Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Özet

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Özet

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Giriş

Kuvvet-duyarlı, genetik olarak kodlanmış FRET sensörler, yakın, canlı hücrelerde çekme bazlı kuvvetleri olarak ^{proteinler, 1, 2, 3, 4} arasında nasıl uygulandığı mekanik kuvvetlerin fikir sağlamak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu araçları ile, araştırmacılar geleneksel floresan mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde, non-invaziv görüntü hücre içi kuvvetler can. Bu sensörler bir elastik peptid ³ ile ayrılmış bir FRET çiftinin (donör ve akseptör floresan proteinleri, en çok mavi bir verici ve sarı akseptör) oluşur. C- veya N-terminal etiketleme aksine, bu sensor, bir molekül gerilme göstergesi gibi davranmak, protein üzerinden iletilen mekanik kuvvetini ölçmek için bir proteinin bir iç alanı içine eklenir. FRET p arasında artan bir mesafe sensörü sonuçları arasında mekanik gerilim artışıhava, azalmış FRET ³ elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, FRET ters gerilme kuvveti ile ilgilidir.

Bu flüoresan bazlı sensörler fokal yapışma proteinleri (vinkülin ³ ve talin ^4), sitoskeletal proteinler (α-aktinin ^5), ve hücre-hücre birleşme proteinleri için geliştirilmiştir (E-kadherin ^{6, 7,} VE-cadherin ⁸ ve PECAM ^8). Bu biyoalgılayıcılarda da en sık kullanılan ve iyi karakterize edilmiş esnek bağlayıcı TSmod olarak bilinir ve örümcek ipeği proteini flagelliform türetilmiş 40 amino asitlik (GPGGA) _8, bir tekrarlanan dizinin oluşur. TSmod çekme kuvveti ³ 5 pN için 1 FRET yanıtı, bir doğrusal elastik nano yay olarak hareket ettiği gösterilmiştir. flagelliform farklı uzunlukları dinamik r değiştirmek için kullanılabilirTSmod FRET kuvvet duyarlılık ⁹ ange. Flagelliform ek olarak, spektrin (HP-35 olarak da bilinir) ⁵ ve villin başlık peptid ⁴ içindeki kuvvet biyosensörler ⁴ FRET çifti arasındaki elastik peptidler olarak kullanılmıştır tekrarlar. Son olarak, son bir yay TSmod da sıkıştırma kuvvetlerini ¹⁰ algılamak için kullanılabileceğini gösterdi.

Son zamanlarda TSmod endojen benzer şekilde davranır mini Nesprin2G (Şekil 2C), olarak bilinen, daha önce geliştirilmiş kesik Nesprin2G protein içine sokulur kullanılarak Nucleo-hücre iskeletinin (LINC) kompleks protein Nesprin2G bağlayıcısına için bir güç sensörü gelişmiş Nesprin-2G ^11. LINC kompleksi, nükleer lamina sitoplazmik hücre iskeleti bağlama, çekirdeğin içine dışarıdan yol açan birçok proteinler içerir. Nesprin-2G yapısal bir protein bağlanma her ikisitoplazmada ve çekirdek çevresi alanı GÜNEŞ proteinlerine aktin hücre iskeletinin. Bizim biyosensör kullanarak, Nesprin-2G NIH3T3 fibroblastların ^2'de actomyosin bağımlı gerilim tabi olduğunu göstermek başardık. Bu, o kuvvet direkt olarak nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında ölçüldü ilk kez oldu ve mechanobiology içinde çekirdeği üzerinde gücünün rolünü anlamak için önemli bir araç haline muhtemeldir.

Aşağıdaki protokol, Nesprin- ifade eden hücrelerin FRET görüntülerin memeli hücrelerinde Nesprin gerilim sensörü (Nesprin-TS) ifadesi, hem de toplama ve analizi de dahil olmak, Nesprin-2G güç sensörü nasıl kullanılacağını detaylı bir yöntem sağlar TS. bir spektral detektörü ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak, duyarlı emisyon ölçmek için nasıl bir açıklama spektral Karışmama kullanılarak FRET ve rasyometrik FRET görüntüleme sağlanır. çıkış oran ölçer görüntüleri göreceli nereye yapmak için kullanılabilirntitative kuvvet karşılaştırmaları. Bu protokol, fibroblastlarda Nesprin-TS ekspresyonu odaklanmış olsa da, bu hücre hatları ve primer hücreler de dahil olmak diğer memeli hücreleri, kolayca adapte edilebilir. Bundan başka, bu görüntü elde etme ve FRET analizi ile ilgili olarak, bu protokol, hali hazırda diğer proteinler için geliştirilmiştir, diğer FRET'e dayalı bir kuvvet biyosensör için adapte edilebilir.

Protokol

1. Nesprin-2G Sensör DNA ve diğer plazmid DNA elde edilir

1. ticari bir kaynaktan Nesprin-2G TS (gerilim sensörü), Nesprin-2G HL (başsız) kontrol, mTFP1, venus, ve TSmod elde edilir. Bütün DNA plazmidleri yaymak ve daha önce ^{12, 13} tarif edildiği gibi, örneğin DH5a-a gibi Standart E. coli suşları, kullanarak saflaştırılması.

Nesprin-2G ve diğer Plazmid DNA ile 2. transfekte hücreler

1. Sıcaklık (37 ° C) ve _CO2 (% 5) düzenlenmesi ile standart bir hücre kültürü inkübatöründe bir 6-yuvalı hücre kültürü çanağı içinde% 70-90 konflüansa NIH 3T3 fibroblast hücrelerinin büyütün. hücre büyüme ortamı için,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanın.
2. bir hücre kültür kaput, orta kaldırmak ve bir indirgenmiş serum hücre ortamında yaklaşık olarak 1 mL'si ile de her yıkayın. Her bir oyuğa indirgenmiş serum hücre ortamında 800 mcLve kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin.
3. Lipid taşıyıcı çözeltisi 35 uL 1.5 ml tüp içine indirgenmiş serum hücre ortamında Pipet 700 uL "lipomix" oluşturulur. Pipetleme ile karıştırın. bir "L" ile tüp etiketleyin
4. Altı 1.5 ml tüpler toplayın ve her bir tüpe indirgenmiş serum hücre ortamında 6. pipetle 100 uL aracılığıyla onları 1 etiketleyin.
   1. mVenus 5. pipetle 1 ug tüp içine borular 3 ve 4 pipetle 1 OVMP ug içine tüpler 1 ve 2 Pipet 2 Nesprin-HL ug içine aşama 1, pipet 2 Nesprin 2G-TS ug plazmid DNA konsantrasyonu kullanılarak tüp 6. içine yeniden kullanım etmeyin pipet uçları DNA'nın farklı türde pipetlerken zaman.
5. Her bir işaretlenmiş borusu (1-6), "L" tüp lipomix Pipet 100 uL ve tekrar pipetleme karıştırın. Her tüp için temiz pipet kullanın. 10-20 dakika süreyle inkübe edin.
6. % 70-90 konfluent 6 oyuklu odası içinde bir kuyuya her etiketli tüp 200 mcLHücreler. karşılık gelen DNA ile her bir üst Etiket ilave edildi. 46 saat için bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin.
7. orta aspire ve durulama için indirgenmiş serum hücre ortamında 1-2 ml. , Indirgenmiş serum hücre ortamı aspire her bir göze tripsin 2 mL ekleyin ve inkübatör (5-15 dakika), 6-çukurlu bir tabak yerleştirin.
8. Hücreler inkübatör içinde ayırmak birlikte, kat 6 cam alt fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda fibronektinle bir tabaka ile bulaşıkları görüntüleme. kaplamak için yemeklere hücre kültürü kaputu (yaklaşık 20 dakika) yüzey izin verin.
9. Hücreler müstakil bir kez DMEM 2 mL eklenerek tripsin nötralize.
10. iyi bir etiketli 15-ml santrifüj tüpüne her içeriğini aktarın ve sallanan bir rotor santrifüj içinde 5 dakika için 90 x g'da aşağı doğru döndürün. Süpernatant aspire ve pipet karıştırma ile DMEM 1.000 uL, her hücre topağı yeniden askıya.
11. fibronektin karışımı aspireCam kaplar ve pipet cam tabaklar üzerine her bir hücre süspansiyonu 1.000 uL.
12. Hücreler cam kasesi taban (~ 15 dakika) yerleşmek sonra hücre kuluçka makinesi içinde de yer ve her DMEM başka bir 1 ml +% 10 FBS +% 1 Pen-Strep ekleyin. Hücreler en az 18-24 saat sensör takmak ve ekspres izin verin.
    Not: Hücreler, ticari katyonik lipid transfeksiyon reaktifleri (Malzemelerin Tablo) kullanılarak transfekte edilir. Seçenek olarak ise, stabil hücre hatları, bir toksine karşı direnç kazandıran bir gen ile bir plasmid kullanılarak seçilebilir (Nesprin-TS ve -HL için pcDNA plazmidler genetisin direnci ifade eden hücreler (Malzemelerin Tablo) temin eden bir DNA depo web sitesinde bulunabilir ). Ek olarak, viral enfeksiyon yöntemleri (lentivirüs, retrovirüs, veya adenovirüs) transfekte etmek zor olan hücrelerde sensörü ifade etmek için kullanılabilir.
13. Nesprin-TS ek olarak, Nesprin HL sıfır için ek hücreleri transfektece kontrol adımlar 2.1-2.12 tarif edildiği gibi; TSmod aynı zamanda sıfır güç kontrol olarak kullanılabilir ve Nesprin-HL benzer FRET sergilemelidir.
14. mTFP1 ve venus ile transfekte hücreler spektral parmak izi (Adım 4) üretmek için.
    Not: mTFP1 ve venus, tipik olarak Nesprin-TS daha yüksek seviyelerde eksprese eder ve bu şekilde DNA alt miktarların benzer ekspresyon seviyelerini elde etmek için transfekte edilmesi gerekebilir.

3. Transfeksiyon Verimi doğrulama

1. Yaklaşık 18-24 saat transfeksiyon tamamlandıktan sonra, görünümünde hücreler (genellikle% 5-30) toplam sayısı flüoresan hücrelerin sayısını karşılaştırarak transfeksiyon etkinliğini incelemek için bir ters flüoresan mikroskop kullanılır.
   1. 462 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venus) ve 492 nm'de (mTFP1) ya da 525 nm'de (venüs) yakınında bulunan bir emisyon filtresi yakın bir uyarım frekansı ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak.
      NOT: Alternatif olarak, GFP filtre setleri mTFP1 bir arada yakalamak ve ettik edeceknus emisyon transfeksiyon verimliliği teyidini sağlayacak ve.
2. Transfeksiyon sonrası 48 saat içinde resmi canlı hücreleri.
   1. Seçenek olarak ise, 48 saat ⁸ sonra, PBS içinde 5 dakika, deposu için, ve görünümü (kalsiyum ve magnezyumlu PBS içinde)% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit.
      NOT: 48 saat ötesinde, sinyal kalitesi ve gücü azalır. Hücrelerin Tespit ⁸ ifade edilen FRET dahil olmak üzere durumunu korur; orta montaj FRET ¹⁴ etkileyebilir olarak, ancak, hücrelerin sadece PBS içinde görüntülü olmalıdır. ekspresyonunda bir değişiklik olabilir gibi sabit hücreleri yalnızca, diğer sabit hücrelere kıyasla olabilir.
      Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin.

Spektral unmixing için mTFP1 ve Venüs floroforların 4. Yakalama Spektral parmak izleri

1. Bir hücre kültürü kaputu, görüntüleme Mediu ile hücre orta yerine% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş m (HEPES-tamponlu).
2. sıcaklık-kontrollü bir (37 ° C), konfokal mikroskop aşamasında görüntüleme yemekler yerleştirin.
3. 1.4 olan bir sayısal açıklık ile 60X büyütmede yağ objektiv mTFP1-transfekte edilmiş hücreler ile cam görüntüleme tabağına yerleştirin.
   NOT: Yağ yakından cam zeminin kırılma indeksi benzemeye 60X objektif bir lazer tarama mikroskobu kullanılmaktadır. Yağ objektif lens üstüne yerleştirilir ve cam kapak ile doğrudan temas edilir.
4. mTFP1 bir 458 mm uyarım kaynağı ve 500 nm de bir emisyon bant-geçiş filtresi ile eksprese eden hücrelerin bulun.
5. Görüş alanında bir flüoresan hücre ile, (burada kullanılan yazılım "Lambda modu") spektral algılama modu seçmek ve spektral görüntü (Şekil 3-1) yakalamak; 10 mil artışlarım (Şekil 3-3) kullanılarak 458 nm ötesinde tüm frekansları içerir. Parlak fluoresc seçinHücre (20 piksel uzaklık) üzerinde ent bölgesi (ROI).
   Not: mTFP1 eksprese ROI spektral şekil hücresi boyunca nispeten sabit kalmalıdır. şekil büyük ölçüde farklı ise, lazer yeniden ayarlayın ve sinyal-gürültü oranını geliştirmek için ayarları kazanır.
6. tıklayarak spektral veritabanına, floresan ROI ortalama normalize yoğunluğunu Ekle "veritabanına spektrum kaydedin."
7. lazer gücü optimize edin ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilecek şekilde kazanırlar. Ayarlar farklı ekipman için değişecektir. Arka plan referans olarak floresan olmayan, transfekte edilmemiş hücreler kullanılarak, fakat detektörü (doyma noktasına) dinamik aralığının dışında, hücrelerin parlak olana kadar kazanç ve gücünü artırmak. Arka plan hücre ortalaması sonra saptanabilir flüoresans olmamalıdır.
8. aşağıdaki istisnalarla Venus-transfekte hücreler için tekrarlayın:
   1. uyarı frekansı 515 nm'de olduğundan emin olun ve bant geçiş filtresi ce olduğuvenus-ifade eden hücreleri tespit ederken 530 nm'ye yakın ntered.
   2. Olarak "Spektral Mod" 515 nm yerine 458 nm'lik bir eksitasyon frekans kullanımı.

5. Yakalama Karışmamış Görüntüler

1. için yakalama modunu değiştirin "Spektral unmixing."
2. Karışmama kanallarına (Şekil 3, Ok-2) venus ve mTFP1 spektral parmak izi ekle.
3. geri 458 nm argon kaynağına uyarım lazer ayarlayın.
4. 60X petrol amacı yukarıda Nesprin-TS inceleyen tabağına yerleştirin.
5. yeteri kadar parlak ifadesi ile bir floresan hücre odaklanan sonra, sinyal-gürültü oranını optimize etmekte kazanç ve lazer gücü ayarlar.
   NOT: Nesprin-TS FRET verimliliği% 20 yakın olduğu için, karışmamış Venus görüntü karıştırılmamış mTFP1 resimden daha büyük ölçüde sönük olmalıdır. Kabul edilebilir bir güç ve kazanç ayarı iteratif belirlendikten sonra, bu parametreler tüm resimler capt için sabit kalmalıdıredilsin.
6. (Tüm doymuş piksel görüntü işleme sırasında çıkartılmıştır) nispeten benzer parlaklık Nesprin-TH hücrelerinin 15-20 görüntülerin en az çekme ve aşırı piksel doygunluk kaçının.
7. özdeş görüntüleme parametreleri kullanılarak Nesprin-HL hücreleri ile görüntü yakalama işlemi tekrarlayın.

6. Görüntü İşleme ve Oran Görüntü Analizi

1. Kullanılması açık kaynak ImageJ (FİJİ) yazılımı (http://fiji.sc/), BioFormats Reader kullanılarak açık yerel biçim görüntüler.
2. Ön-işlem ve görüntüler ve daha önce tespit edilmiş protokollerin ¹⁵ kullanılarak oranı görüntü hesaplamak.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokole ardından DNA plazmidi DNA deposundan alınan edildi ve E. coli hücrelerine transforme edildi. Sensör DNA ifade eden E. coli LB / Amfisilin plakaları seçilir ve bir sıvı LB suyu içinde amplifiye edildi. Vektörlerin amplifikasyonu takiben, DNA plazmidleri standart, ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak Tris-EDTA tampon maddesi içinde saflaştırılmıştır. Bir spektrofotometre kullanılarak, saflaştırılmış D...

Tartışmalar

Bir yöntem ve Nesprin-2G, nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında mekanik gerilimin canlı hücre görüntüleme gösteri, yukarıda özetlenen edildi. Bundan önce işe, örneğin mikropipet aspirasyon sitometrisi manyetik boncuk ve mikroskopik lazer ablasyon gibi çeşitli teknikler, hücre çekirdeği üzerindeki yükü uygulamak ve dökme malzeme özellikleri ^{16, 17, 18} ölçmek için kullanılmıştır. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658