JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Аннотация

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Введение

Чувствительная к Силе, генетически кодируемые сенсоры FRET недавно появились в качестве важного инструмента для измерения растяжения на основе силы в живых клетках, обеспечивая понимание того , как механические силы прикладываются белки 1, 2, 3, 4. С помощью этих инструментов, исследователи могут неинвазивно изображения внутриклеточных сил в живых клетках с помощью обычных флуоресцентных микроскопов. Эти датчики состоят из FRET-пары (донорные и акцепторные флуоресцентных белков, наиболее часто синий донор и желтый акцептор) , разделенная упругого пептидом 3. В отличии от С- или N-концевого мечения, этот датчик вставлен во внутреннем сайт белка для измерения механической силы, передаваемой через белок, ведет себя как датчик молекулярной деформации. Повышение механических напряжений через результаты датчика к увеличению расстояния между FRET-рвоздух, что приводит к снижению FRET 3. В результате лада обратно пропорциональна растягивающей силы.

Эти флуоресцентные основой датчики были разработаны для координационных белков адгезии (винкулины 3 и талины 4), белков цитоскелета (α-актинин 5), и клетка-клетка соединительных белков (Е-кадгерин 6, 7, VE-кадгерин 8 и РЕСЫ 8). Наиболее часто используемый и хорошо характеризуются упругий линкер в этих биосенсорах известен как TSmod и состоит из повторяющихся последовательности из 40 аминокислот, (GPGGA) 8, который был получен из паука шелка белка жгутовидного. TSmod было показано, ведет себя как линейная упругую нано-пружину, с FRET отзывчивостью к 1 до 5 пН растягивающего усилия 3. Различные длины жгутовидного могут быть использованы для изменения динамического гАнж из TSmod FRET силы чувствительности 9. В дополнении к жгутовидному, спектрин повторяет 5 и виллина заставку пептид (известный как HP35) 4 были использован в качестве эластичных пептидов между FRET-паром в аналогичных силовых биосенсорах 4. Наконец, недавний отчет показал , что TSmod также может быть использована для обнаружения сжимающих сил 10.

Недавно мы разработали датчик силы для линкера-цитоскелета ядерно (ЛИНК) сложный белок Nesprin2G с помощью TSmod вставляется в ранее разработанном усеченный белок Nesprin2G известного как мини-Nesprin2G (рис 2С), которая ведет себя так же , как эндогенные Nesprin-2G 11. Комплекс ЛИНКА содержит множество белков, которые ведут от наружного к внутренней части ядра, связывая цитоплазматические цитосколют к ядерной пластинке. Nesprin-2G представляет собой структурный белок связывания с какактина цитоскелета в цитоплазме и SUN белки в перинуклеарном пространстве. Используя наш биосенсор, мы смогли показать , что Nesprin-2G подлежит актомиозиновую-зависимую напряженность в NIH3T3 фибробластах 2. Это был первый раз, когда сила измеряется непосредственно через белок в комплексе ядерного ЛИНКА, и это, вероятно, станет важным инструментом для понимания роли силы на ядре в mechanobiology.

Протокол ниже приводится подробная методикой, как использовать датчик силы Nesprin-2G, в том числе экспрессии датчика натяжения Nesprin (Nesprin-TS) в клетках млекопитающих, а также сбора и анализа FRET изображений клеток, экспрессирующих Nesprin- TS. Используя перевернутую конфокальной микроскопии, оснащенный детектором спектрального, описание того, как измерить сенсибилизированные излучение FRET с использованием спектральной расслоении и обеспечивается ратиометрический FRET изображений. Выходные логометрических изображения могут быть использованы для относительного кваntitative сила сравнения. Хотя этот протокол ориентирован на экспрессию Nesprin-TS в фибробластах, он легко адаптируется к другим клеткам млекопитающих, в том числе обеих клеточных линий и первичных клеток. Кроме того, этот протокол, как он относится к приобретению и анализу изображений FRET может быть легко адаптирован к другим силе биосенсоров на основе FRET, которые были разработаны для других белков.

протокол

1. Получение Nesprin-2G датчик ДНК и другие плазмидной ДНК

  1. Получение Nesprin-2G TS (датчик натяжения) контроля, Nesprin-2G HL (без головы), mTFP1, Венера, и TSmod из коммерческого источника. Размножьтесь все плазмиды ДНК и очистить их с использованием стандартных штаммов E.coli, такие как DH5-альфа, как описано ранее , 12, 13.

2. Клетки с трансфекции Nesprin-2G и других плазмидной ДНК

  1. Grow NIH 3Т3 фибробласты клетки 70-90% слияния в 6-луночный культуральный блюдо в стандартном инкубаторе для клеточных культур с температурой (37 ° C) и СО 2 (5%) регулирования. Для среды роста клеток, используют Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка.
  2. В капоте культуры клеток, удалить среды и промыть каждую лунку с приблизительно 1 мл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки. Добавьте 800 мкл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки в каждую лункуи поместить в камеру 6-а в инкубаторе.
  3. Пипетка 700 мкл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки в 1,5 мл пробирку с 35 мкл раствора липида-носителя, чтобы сформировать «lipomix». Смешать с помощью пипетки. Этикетка трубки с «L.»
  4. Собирают шесть 1,5 мл пробирки и маркировать их от 1 до 6. Pipette 100 мкл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки в каждую пробирку.
    1. Использование концентрации плазмидной ДНК из стадии 1, пипетки 2 мкг Nesprin 2G-TS в пробирки 1 и 2. пипеткой 2 мкг Nesprin-HL в пробирки 3 и 4. пипеткой 1 мкг mTFP в трубку 5. Pipette 1 мкг mVenus в трубу 6. не повторное использование пипеток при пипетке различных типов ДНК.
  5. Пипетка по 100 мкл lipomix от «L» трубки в каждую пробирку с маркировкой (1-6) и перемешать повторным пипетированием. Используйте чистую пипетку для каждой трубки. Инкубировать в течение 10-20 мин.
  6. Добавляют 200 мкл из каждой меченой трубки к скважине в 6-луночный камере с 70-90% сплошностиклетки. Добавьте в верхней части каждой скважины с соответствующей ДНК добавляли. Поместите камеру 6-а в инкубаторе в течение 4-6 ч.
  7. Аспирируйте среду и добавляют 1-2 мл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки для полоскания. Аспирируйте среду клеток с пониженным содержанием сыворотки, добавляют 2 мл трипсина в каждую лунку, и поместите блюдо 6-а в инкубаторе (5-15 мин).
  8. В то время как клетки отделить в инкубаторе, пальто 6 стеклянным дном просмотра блюда слоем фибронектина при концентрации 20 мкг / мл, растворенного в фосфатно-солевом буфере (PBS). Разрешить посуду, чтобы покрыть поверхность в капоте культуры клеток (примерно 20 мин).
  9. Нейтрализовать трипсина путем добавления 2 мл DMEM, как только клетки отделяют.
  10. Передача содержимого каждой лунки с меченым центрифужной пробиркой 15 мл и спина вниз на 90 мкг в течение 5 мин в качающемся роторе центрифуге. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать каждый осадок клеток в 1000 мкл DMEM с помощью пипетки смешивания.
  11. Аспирируйте фибронектин смесь изстеклянной посуды и пипетки 1000 мкл каждой клеточной суспензии на стеклянной посуды.
  12. После того как клетки оседают на дно стеклянной посуды (~ 15 мин), добавляют еще 1 мл DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep в каждую лунку и место в инкубаторе клеток. Разрешить клетки приложить и выразить датчик в течение по крайней мере 18-24 часов.
    Примечание: Клетки трансфицировали с использованием коммерческих катионных липидных трансфекций реагентов (см Таблицы материалов). В качестве альтернативы, стабильные клеточные линии могут быть выбраны с помощью плазмиды с геном , придающим устойчивость к токсину (плазмиды PcDNA для Nesprin-TS и -HL доступны на веб - сайте хранилища ДНК (см таблицу материалов) обеспечивают клетки , экспрессирующие генетицина сопротивление ). Кроме того, могут быть использованы вирусные инфекции (методы лентивирусов, ретровируса или аденовируса), чтобы выразить датчик в клетках, которые трудно для трансфекции.
  13. В дополнение к Nesprin-TS, дополнительные трансфекции клеток с Nesprin HL нулевой дляКонтроль с, как описано в шагах 2.1-2.12; TSmod также может быть использована в качестве контроля нулевой силы и должна проявлять подобную FRET к Nesprin-HL.
  14. Трансфекции клеток с mTFP1 и Венерой генерировать спектральные отпечатки пальцев (этап 4).
    Примечание: mTFP1 и венера, как правило, выражают на более высоких уровнях, чем Nesprin-TS, и, как таковые, более низкие количества ДНК, возможно, должны быть трансфицированы для достижения аналогичных уровней экспрессии.

3. Проверка эффективности трансфекции

  1. Примерно 18-24 ч после завершения трансфекции, использовать инвертированный флуоресцентный микроскоп для изучения эффективности трансфекции пути сравнения числа флуоресцирующих клеток к общему числу клеток в поле зрения (обычно 5-30%).
    1. С помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного частотой возбуждения вблизи 462 нм (mTFP1) или 525 нм (Венера) и фильтр излучения с центром около 492 нм (mTFP1) или 525 нм (Венера).
      Примечание: В качестве альтернативы, GFP наборы фильтров захватит комбинацию mTFP1 и веNUS выбросы и позволят подтверждение эффективности трансфекции.
  2. Изображение живые клетки в течение 48 часов после трансфекции.
    1. В качестве альтернативы, зафиксировать клетки в 4% параформальдегид в PBS (с кальцием и магнием) в течение 5 мин, хранить в PBS, и вид через 48 часов 8.
      Примечание: За 48 ч, качество и сила сигнала убывает. Фиксация клеток сохраняет свое состояние, в том числе FRET выражается 8; Однако, клетки должны быть отображены только в PBS, в качестве монтажной среды может повлиять на FRET 14. Фиксированные клетки можно сравнить только с другими фиксированными клетками, так как может быть изменение в экспрессии.
      Внимание: параформальдегид является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).

4. Захват Спектральный Отпечатки из mTFP1 и Венеры флуорофоров для спектрального расслоении

  1. В капоте культуры клеток, заменить среду клеток с mediu изображенийм (HEPES-буфер) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки.
  2. Поместите просмотр блюда в контролируемой температурой (37 ° C) конфокальной столик микроскопа.
  3. Поместите стекла обзора блюдо с mTFP1-трансфецированных клеток над целью масла при 60X увеличении с числовой апертурой 1,4.
    Примечание: Масло используется на лазерном сканирующем микроскопе на объектив 60X, чтобы близко напоминают показатель преломления стеклянной подложки. Масло помещают поверх линзы объектива и приходит в непосредственный контакт с покровным стеклом.
  4. Расположить mTFP1 клетки, экспрессирующие с источником возбуждения 458 нм и полосового фильтра излучения с центром при 500 нм.
  5. С флуоресцентной клетки в поле зрения, выбрать режим спектрального обнаружения ( «Lambda Mode» в программном обеспечении , используемом здесь) и захвата спектрального изображения (рис 3-1); включают в себя все частоты за пределами 458 нм с использованием шагом 10 нм (рис 3-3). Выберите яркий fluorescлор область (ROI), на мобильном (радиусе 20 пикселей).
    Примечание: спектральная форма mTFP1-экспрессирующие ROI должен оставаться относительно постоянной по всей клетке. Если форма изменяется значительно, повторно отрегулировать лазер и получить параметры, чтобы улучшить отношение сигнал-шум.
  6. Добавить флуоресцентный ROI значит, нормированная интенсивность спектральной базы данных, нажав кнопку «Сохранить спектры в базе данных.»
  7. Оптимизация мощности лазера и получить таким образом, что хорошее отношение сигнал-шум достигается. Настройки будут различаться для различного оборудования. Используя нефлуоресцентные, нетрансфицированные клетки в качестве фона ссылки, увеличивает усиление и мощность, пока клетки светлые, но не выходит за рамками динамического диапазона детектор (точка насыщения). Фоновые клетки не должны обнаруживаемая флуоресценция после усреднения.
  8. Повторите этот процесс для Венеры, трансформированные клеток со следующими исключениями:
    1. Убедитесь, что частота возбуждения при 515 нм, и что полосовой фильтр в.п.ntered вблизи 530 нм при определении местоположения венера-экспрессирующие клетки.
    2. В «Спектральный режиме» используют частоту возбуждения 515 нм вместо 458 нм.

5. Захват изображение Несмешанного

  1. Переключение в режим захвата на «Spectral расслоении.»
  2. Добавьте спектральные отпечатки Венеры и mTFP1 в расслоении каналов (рисунок 3, Arrow-2).
  3. Установите лазер возбуждения обратно в источник аргона в 458 нм.
  4. Поместите блюдо просмотра Nesprin-TS выше цели 60X нефти.
  5. После фокусировки на флуоресцентную клетку с достаточно ярким выражением, регулировки усиления и мощность лазера для оптимизации отношения сигнала-шум.
    Примечание: Поскольку эффективность ладу Nesprin-TS находится вблизи 20%, несмешанная венера изображение должно быть существенно слабее, чем в несмешанном mTFP1 изображении. После того, как приемлемая мощность и коэффициент усиления настройка была определена итерационно, эти параметры должны оставаться постоянными для всех изображений CaptUred.
  6. Захват минимум 15-20 изображений клеток Nesprin-TS с относительно аналогичной яркостью и избежать чрезмерного насыщения пикселя (все насыщенные пиксели удаляются во время обработки изображения).
  7. Повторите процесс захвата изображения с клетками HL-Nesprin с использованием одинаковых параметров обработки изображений.

Обработка изображений и 6. Соотношение анализа изображений

  1. Использование с открытым исходным кодом ImageJ (FIJI) программное обеспечение (http://fiji.sc/), открывать изображения родной формат с помощью BioFormats Reader.
  2. Предварительная обработка изображения и вычислить отношение изображений с использованием ранее установленных протоколов 15.

Результаты

В результате вышеуказанного протокола, плазмидная ДНК была приобретена из хранилища ДНК и трансформировали в клетках E.coli. E.coli , экспрессирующий ДНК датчика были отобраны из LB / ампициллин и амплифицировал в жидкой LB - бульоне. После амплификации векторов, ДНК...

Обсуждение

Способ и демонстрация клеток живого изображения от механического напряжения через Nesprin-2G, белок в комплексе ядерного ЛИНКА, были описаны выше. До этой работы, различные методы, такие как микропипетки аспирации, магнитно-бусинки цитометрии, и микроскопического лазерной абляции, были ис?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Эта работа была поддержана Томасом Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Memoria Trust (к DEC) и NIH грант R35GM119617 (для DEC). Конфокальный микроскоп визуализация была выполнена в VCU наноматериалы Характеристика Ядро (НКК) фонда.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Nesprin-TS DNAAddgene68127Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNAAddgene68128Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNAAddgene54613Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNAAddgene27793Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNAAddgene26021Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent CellsBiolineBIO-85026
Liquid LB MediaThermoFisher10855001https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture PlatesSigma-AldrichL5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
AmpicillinSigmaA9518
SpectrophotometerBiorad273 BR 07335SmartSpec Plus
quartz cuvetteBiorad1702504Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kitMacherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dishFalcon-Corning353046Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell mediaGibco11995-065DMEM(1x)
Bovine SerumLife Technologies16170-078
reduced serum cell mediaGibco31985-070Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solutioninvitrogen11668-019Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tubeDenvillec2170
TrypsinGibco25200-0560.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dishIn Vitro ScientificD35-20-1.5-N35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
FibronectinThermoFisher33016015fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tubeGreiner bio-one188261
swinging rotor centrifuge Thermo electronCentra CL2Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hoodForma Scientific1284
climate controlled cell culture incubatorThermoFisher3596
inverted LED widefield fluorescent microscopeLife technologiesEVOS FL
Clear HEPES buffered imaging mediaMolecular ProbesA14291DJ
Fetal bovine SerumLife technologies10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources Zeiss LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth MediaNewengland BiolabsB9020s
NIH 3T3 FibroblastsATCCCRL-1658

Ссылки

  1. Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
  2. Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
  3. Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  4. Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  5. Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
  6. Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  7. Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
  8. Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
  9. Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  10. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
  11. Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
  12. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  13. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
  14. Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
  15. Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
  16. Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
  17. Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
  18. Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
  19. Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
  20. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
  21. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  22. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122mechanobiologyFRETNesprin 2G

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены