Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

Zusammenfassung

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Zusammenfassung

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Einleitung

Kraftempfindliche, genetisch kodierte FRET Sensoren sich in letzter Zeit als ein wichtiges Werkzeug für die in lebenden Zellen dehnbare basierenden Kräfte zu messen, einen Einblick in wie mechanischen Kräften über ¹ Proteine angewandt ^{werden, 2, 3, 4.} Mit diesen Werkzeugen können die Forscher nicht-invasiv Bild intrazellulären Kräfte in lebenden Zellen konventionelle Fluoreszenzmikroskope. Diese Sensoren bestehen aus einem FRET-Paar (Donor und Akzeptor - Fluoreszenzproteinen, am häufigsten ein blauen und gelben Donator - Akzeptor) , getrennt durch ein elastisches Peptid ^3. Im Gegensatz zu dem C- oder N-terminalen Tagging, ist dieser Sensor in eine interne Stelle eines Proteins eingeführt, um die mechanische Kraft auf das Protein übertragen zu messen, als Molekular Dehnmessstreifen verhält. Erhöhte mechanische Spannung über den Sensor führt zu einem erhöhten Abstand zwischen dem FRET-pLuft, was zu einer verminderten FRET ^3. Als Ergebnis wird der FRET umgekehrt proportional zur Zugkraft bezogen.

Diese fluoreszenzbasierten Sensoren haben für Focal Adhäsionsproteine (Vinculin ³ und Talin ^4), Cytoskelett - Proteine (α-Actinin ⁵⁾ und Zell-Zell - junction - Proteine (E-Cadherin ^{6, 7,} VE-Cadherin ⁸ und PECAM entwickelt ^8). Das am häufigsten verwendete und gut charakterisierte elastischen Linkers in diesen Biosensoren als TSmod bekannt und besteht aus einer sich wiederholenden Sequenz von 40 Aminosäuren, (GPGGA) _8, die aus dem Spinnenseidenprotein flagelliform abgeleitet wurde. TSmod wurde als lineare elastische Nanofeder mit FRET Ansprechbarkeit auf 1 bis 5 der Zugkraft pN ³ verhalten gezeigt. Verschiedene Längen von flagelliform können verwendet werden, um die dynamische r zu verändernange von TSmod FRET-Kraftempfindlichkeit ^9. Zusätzlich zu flagelliform wiederholt Spektrin ⁵ und Villin Kopfstück Peptid (als HP35 bezeichnet) ⁴ haben wie die elastischen Peptide zwischen FRET-Paare in ähnlicher Kraft Biosensoren ⁴ verwendet. Schließlich ist ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte , dass TSmod können auch Druckkräfte ¹⁰ zu detektieren.

Kürzlich entwickelten wir einen Kraftsensor für den Linker des Nucleo-Zytoskeletts (LINC) -Komplex Protein Nesprin2G durch Verwendung TSmod in eine zuvor entwickelte verkürztes Protein als Mini-Nesprin2G (2C) bekannt Nesprin2G eingesetzt, die endogene ähnlich verhält Nesprin-2G ^11. Das LINC-Komplex enthält mehrere Proteine, die von außen in das Innere des Zellkerns führt, die Verknüpfung der zytoplasmatischen Zytoskelett zum Kernlamina. Nesprin-2G ist ein Strukturprotein-Bindung an sowohl derAktin-Zytoskelett im Zytoplasma und SUN-Proteine ​​in dem perinukleären Raum. Mit unserem Biosensor, konnten wir zeigen , dass Nesprin-2G bis ² Aktomyosin abhängige Spannung in NIH3T3 Fibroblasten unterliegt. Dies war das erste Mal, dass Kraft direkt über ein Protein, das in der Kern LINC-Komplex gemessen wurde, und es ist wahrscheinlich ein wichtiges Instrument worden, die Rolle der Kraft auf dem Kern in Mechanobiologie zu verstehen.

Das Protokoll unten ein detailliertes Methodik, wie der Sensor Nesprin-2G Kraft zu verwenden, einschließlich der Expression des Nesprin Spannungssensors (Nesprin-TS) in Säugetierzellen, sowie die Erfassung und Analyse von Bildern von FRET-exprimierenden Zellen Nesprin- TS. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop mit einem spektralen Detektor ausgestattet ist, eine Beschreibung, wie sensibilisierten Emission messen FRET unter Verwendung Entmischung und ratiometrisch FRET-Bildgebung bereitgestellt. Die Ausgangsratiometrisches Bilder können verwendet werden, relativ qua machenntitative Kraft Vergleiche. Während dieses Protokoll auf der Expression von Nesprin-TS in Fibroblasten fokussiert wird, ist es auf andere Säugetierzellen leicht anpassbar, einschließlich Zelllinien und Primärzellen. Außerdem ist dieses Protokoll, wie es auf die Bildaufnahme und FRET-Analyse bezieht sich ohne weiteres auf andere FRET-basierten Biosensoren Kraft angepasst werden, die für andere Proteine ​​entwickelt wurden.

Protokoll

1. Besorgen Nesprin-2G-Sensor-DNA und andere Plasmid-DNA

1. Erhalten Nesprin 2G-TS (Spannungssensor), Nesprin-2G HL (ohne Kopf) -Steuerung, mTFP1, Venus und TSmod aus einer kommerziellen Quelle. Propagieren alle DNA - Plasmide und reinigen , sie Standard E. coli - Stämme verwendet, wie beispielsweise DH5-α, wie zuvor ^{12, 13} beschrieben.

2. Transfektion von Zellen mit Nesprin-2G und anderem Plasmid-DNA

1. Wachsen NIH 3T3 - Fibroblasten - Zellen zu 70-90% Konfluenz in einer 6-Well - Zellkulturschale in einem Standard - Zellkultur - Inkubator mit der Temperatur (37 ° C) und CO ₂ (5%) Regelung. Für das Zellwachstumsmedium verwendet Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum.
2. In einer Zellkulturhaube Entfernen des Mediums und spülen jede Vertiefung mit etwa 1 ml einer reduzierten Serum-Zellmedium. In 800 & mgr; l reduziert Serum Zellmedium zu jeder Vertiefungund legen Sie die 6-well Kammer in dem Inkubator.
3. Pipette 700 & mgr; l Serum-reduziertes Zellmedium in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 35 & mgr; l Lipid-Trägerlösung, die das „lipomix“ zu bilden. Mischen durch Pipettieren. Das Röhrchen mit einem „L“
4. Sammeln sechs 1,5 ml-Röhrchen und sie 1 bis 6. Je 100 & mgr; l reduziert Serums Zellmedium in jedes Röhrchen beschriften.
   1. Unter Verwendung der Plasmid-DNA-Konzentration aus Schritt 1 Pipette 2 ug Nesprin 2G-TS in Röhrchen 1 und 2. Pipettieren 2 ug Nesprin-HL in Röhrchen 3 und 4. Pipettieren 1 ug mTFP in das Rohr 5. Pipette 1 ug mVenus in das Rohr 6. Setzen Sie wiederverwenden Pipettenspitzen nicht, wenn verschiedene Arten von DNA-Pipettieren.
5. Je 100 & mgr; L des lipomix aus dem „L“ Rohr in jedes markierten Rohr (1-6) und durch wiederholtes Pipettieren vermischt. Mit einer sauberen Pipette für jedes Röhrchen. Inkubieren für 10-20 min.
6. Füge 200 & mgr; l von jedem markierten Rohr zu einem gut in der 6-well Kammer mit 70-90% konfluentenZellen. Beschriften die Oberseite jeder Vertiefung mit der entsprechenden DNA hinzugefügt. Platzieren Sie die 6-well Kammer in einem Inkubator für 4-6 h.
7. Anzusaugen, das Medium und füge 1-2 ml verringert Serum Zellmedium zu spülen. Absaugen reduziertes Serum Zellmedium, 2 ml Trypsin zu jeder Vertiefung, und legen Sie die 6-Well-Platte in dem Inkubator (5-15 min).
8. Während die Zellen in dem Inkubator mantel 6 Glasbodensichtschalen mit einer Schicht von Fibronektin mit einer Konzentration von 20 ug / ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst abzulösen. Lassen Sie die Gerichte, die Oberfläche in der Zellkultur zu beschichten Haube (ca. 20 min).
9. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 2 ml DMEM, sobald die Zellen abgelöst werden.
10. Transferieren des Inhalts von jeder Vertiefung zu einem markierten 15-ml-Zentrifugenröhrchen und Spin-down bei 90 × g für 5 min in einem Schwingrotor zentrifugiert. Aspirieren den Überstand und resuspendiere jedes Zellpellet in 1000 & mgr; l DMEM pipettiert Mischung.
11. Absaugen Fibronektin Mischung aus demGlasschalen und Pipetten 1.000 & mgr; l jeder Zellsuspension auf die Glasschalen.
12. Nachdem die Zellen auf den Boden der Glasschalen (~ 15 min) absetzen, fügen eine weitere 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep in jede Vertiefung geben und in den Zellinkubator. Lassen Sie die Zellen befestigen und exprimieren Sensor für mindestens 18-24 h.
    HINWEIS: Die Zellen werden unter Verwendung von handelsüblichen kationischen Lipid - Transfektionsreagenzien transfiziert (siehe die Tabelle der Materialien). Alternativ dazu kann eine stabile Zelllinien unter Verwendung eines Plasmid mit einem Gen , das Resistenz gegenüber einem Toxin verleiht , ausgewählt werden (die pcDNA - Plasmide für Nesprin-TS und -HL sind auf einem DNA - Repository Website zur Verfügung (die Tabelle der Materialien sehen) liefern exprimierenden Zellen Geneticin - Resistenz ). Zusätzlich können virale Infektionsmethoden (Lentivirus, Retrovirus oder Adenovirus) verwendet werden, um den Sensor in Zellen zu exprimieren, die schwer zu transfizieren.
13. Neben Nesprin-TS, transfizieren zusätzliche Zellen mit dem Nesprin HL Null fürce Steuerung, wie in den Schritten 2,1-2,12 beschrieben; TSmod kann auch als Nullkraftsteuerung verwendet werden und ähnliche FRET Nesprin-HL zeigen sollte.
14. Transfizieren von Zellen mit mTFP1 und Venus zu erzeugen, spektralen Fingerabdruck (siehe Schritt 4).
    HINWEIS: mTFP1 und Venus exprimieren typischerweise bei höheren Niveaus als Nesprin-TS, und als solche, geringere Mengen an DNA müssen möglicherweise zu transfizierenden ähnlichen Expressionsniveaus zu erreichen.

3. Überprüfen Sie Transfektionseffizienz

1. Etwa 18-24 h nach der Transfektion Abschluss verwenden ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop die Effizienz der Transfektion durch Vergleichen der Anzahl der fluoreszierenden Zellen an der Gesamtzahl der Zellen in der Ansicht (in der Regel 5-30%) zu untersuchen.
   1. Verwenden eines Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Anregungsfrequenz in der Nähe von 462 nm ausgestattet (mTFP1) oder 525 nm (Venus) und einem Emissionsfilter zentriert in der Nähe von 492 nm (mTFP1) oder 525 nm (Venus).
      HINWEIS: Alternativ GFP Filtersets wird eine Kombination aus mTFP1 erfassen und venus-Emissionen und der Bestätigung der Transfektionseffizienz ermöglichen.
2. Bild lebenden Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der Transfektion.
   1. Alternativ fixieren Zellen in 4% Paraformaldehyd (in PBS mit Calcium und Magnesium) für 5 min, zu speichern in PBS und Ansicht nach 48 h ^8.
      HINWEIS: über 48 h, die Signalqualität und -stärke abklingt. Fixieren der Zellen bewahrt ihren Zustand, einschließlich der FRET ⁸ exprimiert wird; jedoch sollten die Zellen nur in PBS bebildert werden, wie Eindeckmediums ¹⁴ FRET beeinflussen können. Die fixierten Zellen können nur mit anderen fixierten Zellen verglichen werden, da kann es zu einer Veränderung der Expression sein.
      Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (PSA).

4. Erfassung Spectral Fingerabdrücken von mTFP1 und Venus Fluorophore für Entmischung

1. In einer Zellkulturhaube, ersetzen das Zellmedium mit bildgebenden medium (HEPES-gepufferter) mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt ist.
2. Platzieren das Betrachtungs Geschirr in einer temperaturgesteuerten (37 ° C) konfokale Mikroskoptisch.
3. Das Glas Sichtschal mit mTFP1 transfizierte Zellen über das Öl-Objektiv mit 60facher Vergrößerung mit einer numerischen Apertur von 1,4.
   HINWEIS: Das Öl auf einem Laser-Scanning-Mikroskop auf dem 60X Objektiv verwendet wird, eng mit dem Brechungsindex des Glassubstrats ähneln. Das Öl wird auf der Oberseite der Objektivlinse angeordnet und kommt in direktem Kontakt mit dem Deckglas.
4. Finde mTFP1 Zellen mit einem 458 nm-Anregungsquelle und ein Emissionsbandfilter, zentriert bei 500 nm zu exprimieren.
5. Mit einer fluoreszierenden Zelle in dem Sichtfeld, wählen Sie den spektralen Detektionsmodus ( „Lambda - Modus“ in der Software hier verwendet wird ) und erfassen , die spektrale Bild (Bild 3-1); umfassen alle Frequenzen über 458 nm 10 nm Inkrementen (Bild 3-3) verwendet wird . Wählen Sie eine helle fluoreszierent-Region (ROI) auf der Zelle (20-Pixel-Radius).
   HINWEIS: Die spektrale Form des mTFP1-exprimierenden ROI sollte relativ konstant über die Zelle bleiben. Wenn die Form erheblich ändert, neu justieren den Laser und Einstellungen gewinnen das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
6. In der Fluoreszenz ROI bedeutet, normalisierte Intensität der spektralen Datenbank, indem Sie auf „Spektren-Datenbank speichern.“
7. Optimierung der Laserleistung und die Verstärkung derart, dass ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird. Die Einstellungen werden für verschiedene Geräte variieren. Die Verwendung von nicht-fluoreszierenden, nicht-transfizierten Zellen als Hintergrundreferenz, erhöhen die Verstärkung und Leistung, bis die Zellen sind hell, aber nicht über den Dynamikbereich des Detektors (Sättigungspunkt). Hintergrund Zellen sollten nicht nachweisbare Fluoreszenz haben nach durchschnittlich.
8. Wiederholen Sie den Vorgang für die Venus-Zellen, die mit den folgenden Ausnahmen:
   1. Sicherstellen, dass die Anregungsfrequenz bei 515 nm ist, und dass das Bandpassfilter ist centered in der Nähe von 530 nm, wenn Venus-exprimierende Zellen zu lokalisieren.
   2. In „Spectral-Modus“, eine Anregungsfrequenz von 515 nm anstelle von 458 nm.

5. Capture-Unmixed Bilder

1. Schalten Sie den Aufnahmemodus auf „Entmischung“.
2. Fügen Sie die spektralen Fingerabdrücke von Venus und mTFP1 Entmischung in die Kanäle (Bild 3, Pfeil-2).
3. Stellen Sie den Anregungslaser zurück zu einer 458 nm Argon-Quelle.
4. Platzieren Sie den Nesprin-TS Sichtschale über dem 60X Öl-Objektiv.
5. Nachdem sie mit ausreichend hell-Expression auf einer Fluoreszenzzelle konzentriert, stellen die Verstärkung und die Laserleistung das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.
   Hinweis: Da die FRET-Effizienz von Nesprin-TS in der Nähe von 20% ist, sollte die ungemischte Venus Bild wesentlich dunkler als die ungemischte mTFP1 Bild sein. Sobald eine akzeptable Leistung und Verstärkungseinstellung iterativ bestimmt worden sind, müssen diese Parameter für alle Bilder capt konstant bleibenured.
6. Erfassen mindestens 15-20 Bilder von Nesprin-TS-Zellen mit relativ ähnlicher Helligkeit und zur Vermeidung von übermäßiger Pixelsättigung (alle gesättigten Pixel werden während der Bildverarbeitung entfernt).
7. Wiederholen Sie die Bildaufnahme-Prozess mit Nesprin-HL-Zellen mit identischen Bildgebungsparameter.

6. Bildverarbeitung und Bildanalyse-Verhältnis

1. Mit Open-Source-ImageJ (FIJI) Software (http://fiji.sc/), offene native Format von Bildern mit BioFormats Reader.
2. Vorprozess die Bilder und berechnet das Verhältnis Bilder zuvor etablierte Protokolle unter Verwendung von ^15.

Ergebnisse

Nach dem obigen Protokoll wurde Plasmid - DNA aus der DNA - Repository erworben und in E. coli - Zellen transformierte. E. coli , den Sensor - DNA exprimieren , wurde aus LB / Ampicillin - Platten ausgewählt , und in einem flüssigen LB - Medium amplifiziert. Im Anschluss an die Amplifikation der Vektoren wurden DNA-Plasmide in TRIS-EDTA-Puffer gereinigt, wobei ein Standard verwendet, im Handel erhältliche DNA-Isolierungskits. Verwendung eines Spektrophotometers, wurd...

Diskussion

Ein Verfahren und eine Demonstration der Abbildung lebender Zellen der mechanischen Spannung über Nesprin-2G, ein Protein in der Kern LINC-Komplex, wurden oben beschrieben. Vor dieser Arbeit wird verschiedene Techniken, wie zum Beispiel Mikropipette Bestrebung, Cytometry Magneten Wulst und mikroskopische Laserablation, verwendet worden , um Druck auf dem Zellkern zu übernehmen und seine Eigenschaften Schüttguts ^{16, 17, 18} zu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658