Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Resumo

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Resumo

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introdução

Sensível à força, sensores de FRET geneticamente codificados surgiram recentemente como uma ferramenta importante para a medição de forças de tracção baseada em células vivas, fornecendo informações sobre como as forças mecânicas são aplicados em proteínas ^{1, 2, 3, 4.} Com essas ferramentas, os pesquisadores podem imagem não-invasiva forças intracelulares em células vivas usando microscópios fluorescentes convencionais. Estes sensores consistem de um par de FRET (proteínas fluorescentes dadores e aceitador, mais frequentemente um dador e aceitador de azul amarela), separadas por um péptido elástica ^3. Em contraste para C- ou codificação N-terminal, este sensor está inserido num local interno de uma proteína para medir a força mecânica transmitidos através da proteína, comportando-se como um medidor de tensão molecular. O aumento da tensão mecânica entre os resultados de sensores num aumento da distância entre a FRET-par, o que resulta em diminuição de FRET ^3. Como resultado, a FRET é inversamente proporcional à força de tracção.

Estes sensores fluorescentes de base têm sido desenvolvidos para proteínas de adesão focal (vinculina ³ e talina ^4), as proteínas do citoesqueleto (α-actinina ^5), e proteínas de junção célula-célula (E-caderina ^{6, 7,} VE-caderina ^8, e PECAM ^8). O ligante elástico mais frequentemente utilizados e bem caracterizado nestes biossensores é conhecido como TSmod e consiste de uma sequência repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) _8, o qual foi derivado a partir da protea de seda de aranha flageliforme. TSmod tem sido demonstrado que se comportam como um nano-mola elástica linear, com a capacidade de resposta de FRET para 1 a 5 pN de força de tracção ^3. Diferentes comprimentos de flageliforme pode ser utilizada para alterar o r dinâmicoange de sensibilidade à força de FRET TSmod ^9. Além flageliformes, espectrina repete péptido peça de cabeça ⁵ e a vilina (conhecido como HP35) ⁴ têm sido usados como os péptidos elásticas entre pares de FRET em força biossensores semelhantes ^4. Finalmente, um relatório recente mostrou que TSmod também pode ser usado para detectar as forças de compressão ^10.

Desenvolvemos recentemente um sensor de força para o ligante da nucleo-citoesqueleto (LINC) proteína complexo Nesprin2G usando TSmod inserido numa proteína truncada Nesprin2G anteriormente desenvolvido conhecido como mini-Nesprin2G (Figura 2C), o qual se comporta de forma semelhante ao endógeno Nesprin-2G ^11. O complexo LINC contém várias proteínas que conduzem a partir do exterior para o interior do núcleo, ligando o citoesqueleto citoplasmática para a lâmina nuclear. Nesprin-2G vincula uma proteína estrutural de tanto ocitoesqueleto de actina no citoplasma e para proteínas sol no espaço perinuclear. Usando nosso biossensor, fomos capazes de mostrar que Nesprin-2G está sujeita a tensão dependente da actomiosina em NIH3T3 fibroblastos ^2. Esta foi a primeira vez que a força foi medida diretamente através de uma proteína no complexo LINC nuclear, e é provável que se torne uma ferramenta importante para compreender o papel da força no núcleo em mechanobiology.

O protocolo abaixo fornece uma metodologia detalhada de como utilizar o sensor de força Nesprin-2G, incluindo a expressão do sensor de tensão Nesprin (Nesprin-TS) em células de mamífero, bem como a aquisição e análise de imagens FRET de células que expressam Nesprin- TS. Usando um microscópio confocal invertido equipado com um detector espectral, uma descrição de como medir emissão sensibilizados FRET utilizando a separação espectral e imagiologia de FRET raciométrica é fornecido. As imagens raciométrica saída pode ser usado para fazer qua relativacomparações força ntitative. Embora este protocolo é focado sobre a expressão de Nesprin-TS em fibroblastos, é facilmente adaptável a outras células de mamíferos, incluindo ambas as linhas celulares e células primárias. Além disso, este protocolo, uma vez que refere-se a aquisição de imagem e análise de FRET pode ser facilmente adaptada para outros biossensores baseados em FRET força que têm sido desenvolvidos para outras proteínas.

Protocolo

1. Obter Nesprin-2G DNA do sensor e outras DNA plasmídeo

1. Obter Nesprin-2G TS (sensor de tensão) de controlo, Nesprin-2G HL (sem cabeça), mTFP1, Vénus, e TSmod a partir de uma fonte comercial. Propagar todos os plasmídeos de ADN e purificá-los utilizando estirpes de E. coli convencionais, tais como DH5-α, como descrito anteriormente ^{12, 13.}

2. Células transfectar com Nesprin-2G e outro ADN de plasmídeo

1. Cultivar células de fibroblastos NIH 3T3 de 70-90% de confluência numa placa de cultura de células de 6 poços numa incubadora de cultura de células padrão com temperatura (37 ° C) e a regulação de CO ₂ (5%). Para o meio de crescimento celular, uso de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo.
2. Num capuz de cultura de célula, remover o meio e lavar cada poço com aproximadamente 1 mL de um meio de células de soro reduzido. Adicionar 800? L de meio celular reduzida de soro a cada poçoe colocar a câmara de 6 poços na incubadora.
3. Pipetar 700 L de meio celular reduzida-soro para um tubo de 1,5 mL com 35 uL de uma solução de veículo lipídico para formar o "lipomix". Misturar por pipetagem. Rotular o tubo com um "L."
4. Reunir seis tubos de 1,5 mL e classificá-los 1 a 6. Pipetar 100 L de meio celular reduzida de soro a cada tubo.
   1. Usando a concentração de DNA de plasmídeo a partir do passo 1, pipeta de 2 ug de Nesprin 2G-TS para tubos 1 e 2. Pipetar 2 ug de Nesprin-HL em tubos 3 e 4. pipeta de 1 ug de mTFP em tubo 5. Pipetar 1 ug de mVenus no tubo 6. não reutilizar pontas de pipeta ao pipetar diferentes tipos de DNA.
5. Pipeta 100 uL da lipomix do "L" do tubo em cada tubo rotulado (1-6) e misturar por pipetagem repetida. Usar uma pipeta para cada tubo limpo. Incubar durante 10-20 minutos.
6. Adicionar 200 ul de cada tubo rotulado para um poço na câmara de 6 poços com 70-90% confluentecélulas. Rotular o topo de cada poço com o ADN correspondente adicionado. Coloque a câmara de 6 cavidades em uma incubadora durante 4-6 h.
7. Aspirar o meio e adicionar 1-2 mL de meio celular reduzida de soro para enxaguar. Aspirar o meio celular reduzida de soro, adiciona-se 2 mL de tripsina a cada poço, e colocar o prato de 6 poços na incubadora (5-15 min).
8. Enquanto as células separar na incubadora, revestimento 6 com fundo de vidro visualização pratos com uma camada de fibronectina numa concentração de 20 ug / mL dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Permitir que os pratos para revestir a superfície da capa de cultura de células (aproximadamente 20 min).
9. Neutraliza-se a tripsina por adição de 2 ml de DMEM uma vez que as células são separadas.
10. Transferir o conteúdo de cada cavidade para um tubo de centrífuga de 15 mL etiquetados e girar para baixo em 90 xg durante 5 minutos numa centrífuga de rotor oscilante. Aspirar o sobrenadante e re-suspender cada pelete de células em 1000 uL de DMEM por mistura pipeta.
11. Aspirar a mistura de fibronectina a partir dapratos de vidro e pipeta de 1000 L de cada suspensão de células para a pratos de vidro.
12. Após as células se depositam no fundo dos pratos de vidro (~ 15 min), adicionar outro 1 mL de DMEM + FBS a 10% + 1% de Pen-Strep a cada poço e lugar na incubadora celular. Permitir que as células se fixem e expressar sensor para, pelo menos, 18-24 horas.
    NOTA: As células são transfectadas utilizando reagentes lipídicos catiónicos comerciais de transfecção (ver a Tabela de Materiais). Em alternativa, linhas de células estáveis podem ser seleccionados utilizando um plasmídeo com um gene que confere resistência a uma toxina (os plasmídeos pcDNA para Nesprin-TS e -HL estão disponíveis em um site repositório de ADN (ver a Tabela de Materiais) proporcionar células que expressam resistência a geneticina ). Além disso, os métodos de infecção viral (lentivus, retrovus, ou adenovus) pode ser utilizada para expressar o sensor em células que são difíceis de transfectar.
13. Além Nesprin-TS, transfectar células adicionais com o Nesprin HL-zero parace controlo, como descrito nos passos 2.1-2.12; TSmod também pode ser usado como um controlo da força de zero e deve exibir TERF semelhante ao Nesprin-HL.
14. células transfectar com mTFP1 e Vénus para gerar impressões espectrais (ver passo 4).
    NOTA: mTFP1 e Vénus expressam tipicamente a níveis mais elevados do que Nesprin-TS, e como tal, os valores mais baixos de ADN podem necessitar de ser transfectadas para alcançar níveis de expressão semelhantes.

3. Verificar a eficiência de transfecção

1. Cerca de 18-24 h depois de completar a transfecção, usar um microscópio de fluorescência invertido para examinar a eficiência de transfecção pela comparação do número de células fluorescentes para o número total de células em vista (geralmente 5-30%).
   1. Usar um microscópio de fluorescência equipado com uma frequência de excitação perto de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus) e um filtro de emissão centrada perto de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus).
      NOTA: Como alternativa, GFP conjuntos de filtros irá capturar uma combinação de mTFP1 e veemissões nus e vai permitir a confirmação da eficiência de transfecção.
2. células vivas imagem dentro de 48 h após a transfecção.
   1. Alternativamente, as células fixar em paraformaldeo a 4% (em PBS com cálcio e magnésio) durante 5 min, armazenamento em PBS, e vista depois de 48 h ^8.
      NOTA: Beyond 48 h, a qualidade e força do sinal decai. A fixação das células preserva o seu estado, incluindo a FRET ser expresso ^8; no entanto, apenas as células devem ser trabalhada em PBS, como meio de montagem pode afectar FRET ^14. As células fixadas só pode ser comparada a outras células fixadas, como pode haver uma mudança na expressão.
      Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Use equipamento de proteção pessoal adequado (EPI).

4. Captura Spectral Impressões digitais do mTFP1 e Vênus fluoróforos para de Mistura Espectral

1. Num capuz de cultura de células, substituir o meio de células com mediu imagiologiam (tamponado com HEPES) suplementado com soro bovino fetal a 10%.
2. Colocar os pratos entrando num (37 ° C) fase microscópio confocal com temperatura controlada.
3. Colocar o prato de vidro de visualização com células mTFP1-transfectadas sobre o objectivo de óleo a 60X de ampliação com uma abertura numérica de 1,4.
   NOTA: O óleo é usado em um microscópio de varredura a laser no objectivo 60X para se assemelham o índice de refração do substrato de vidro. O óleo é colocado em cima da lente da objectiva e entra em contacto directo com a lamela de vidro.
4. Localizar mTFP1 células que expressam com uma fonte de excitação de 458 nm e um filtro de passagem de banda de emissão centrado a 500 nm.
5. Com uma célula fluorescente no campo de visão, selecione o modo de detecção espectral ( "Modo Lambda" no software usado aqui) e capturar a imagem espectral (Figura 3-1); incluem todas as frequências para além de 458 nm, utilizando incrementos de 10 nm (Figura 3-3). Selecione um fluores brilhanteregião ENT (ROI) da célula (raio de 20 pixels).
   NOTA: A forma espectral do mTFP1 expressando ROI deve permanecer relativamente constante através da célula. Se a forma varia consideravelmente, re-ajustar o laser e ganhar configurações para melhorar a relação sinal-ruído.
6. Adicione o ROI fluorescente dizer, intensidade normalizada ao banco de dados espectrais, clicando em "salvar espectros de banco de dados."
7. Optimizar a potência do laser e ganhar de tal forma que uma boa relação sinal-ruído é alcançada. Configurações irá variar para diferentes equipamentos. Usando células não fluorescentes, não transf ectadas como um quadro de referência, e aumentar o ganho de potência até que as células são brilhantes, mas não para além da gama dinâmica do detector (ponto de saturação). células de fundo não deve ter fluorescência detectável após uma média.
8. Repetir o processo para as células Vénus-transfectadas com as seguintes excepções:
   1. Assegure-se que a frequência de excitação é de 515 nm e que o filtro passa-banda é centered perto de 530 nm, quando a localização de células Vénus-exprimem.
   2. Em "modo espectral," usar uma frequência de excitação de 515 nm em vez de 458 nm.

5. Captura de Imagens Unmixed

1. Mude o modo de captura para "de Mistura Espectral."
2. Adicionar as impressões espectrais de Vénus e mTFP1 para os canais de desmistura (Figura 3, Seta-2).
3. Defina o laser de excitação de volta para uma fonte de argônio 458 nm.
4. Coloque o prato visualização Nesprin-TS acima do objetivo de petróleo 60X.
5. Depois de se concentrar em uma célula fluorescente com expressão suficientemente brilhante, ajustar o poder de ganho e de laser para otimizar a relação sinal-ruído.
   NOTA: Uma vez que a eficiência FRET de Nesprin-TS está perto de 20%, a imagem venus sem mistura deve ser substancialmente mais fraca do que a imagem mTFP1 sem mistura. Uma vez que uma configuração de energia e ganho aceitável foram determinados de forma iterativa, estes parâmetros devem permanecer constante para todas as imagens captured.
6. Capturar um mínimo de 15-20 imagens de células Nesprin-TS com um brilho relativamente similares e evitar a saturação de pixel excessiva (todos os pixels saturados são removidos durante o processamento de imagem).
7. Repetir o processo de captura de imagens com as células HL-Nesprin usando parâmetros de imagem idênticos.

Processamento 6. Imagem e Análise de Imagem Rácio

1. (Fiji) software ImageJ usando open-source (http://fiji.sc/), imagens no formato nativo abertos usando BioFormats Reader.
2. Pré-processar as imagens e calcular as imagens de escala utilizando protocolos previamente estabelecidos ^15.

Resultados

Seguindo o protocolo acima, o DNA de plasmídeo foi adquirida a partir do repositório de ADN e transformado em células de E. coli. E. coli que expressam o ADN do sensor foram seleccionados a partir de placas de LB / Ampicilina e amplificado em um caldo de LB líquido. Após a amplificação dos vectores, plasmídeos de ADN foram purificados em tampão TRIS-EDTA utilizando um padrão, disponíveis comercialmente kit de isolamento de ADN. Usando um espectrofotómetro, o...

Discussão

Um método e demonstração da imagem de células vivas da tensão mecânica através Nesprin-2G, uma proteína no complexo nuclear LINC, foi descrito acima. Antes deste trabalho, várias técnicas, tais como a aspiração micropipeta, magnético-grânulo citometria, e microscopia laser de ablação, têm sido usados para aplicar pressão sobre o núcleo da célula e para medir as suas propriedades de material a granel ^{16, 17, 18.}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658