Yağ Asitlerinin Tanımlanması içinde<em&gt; Bacillus cereus</em

Özet

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

Özet

Bacillus türleri metil dalının farklı pozisyonları ile zincirli ve doymamış yağ asitleri (FAS) dallanmış (izo ya anteiso-) ve çift bağın. FA kompozisyonundaki değişikliklerin çevreye bakterilerin adaptasyon önemli bir rol oynamaktadır. Bu değişiklikler anteiso- fas dallı karşı iso oranında bir değişiklik gerektirir ve belirli pozisyonlarda oluşturulan ikili bağlar ile doyurulmuş Fas'a doymamış FAs göreli, oranında. FA profilinin kesin kimlik Bacillus türlerinin adaptasyon mekanizmalarının anlaşılması gereklidir.

Bacillus'dan Fas'ı çoğu ticari olarak temin edilebilir değildir. yağlı asit metil esterleri (FAME), 4,4-dimetil oksazolin: Bu tarifnamede önerilen strateji üç FA türevlerinin tiplerine kütle spektrumları ile (eş zincir uzunluğuna sahip (ECL) hesaplanması ile) alıkoyma süresi hakkında bilgi birleştirerek Fas tanımlar türevleri (DMOX) ve3-pyridylcarbinyl ester (pikolinil). Bu yöntem, bilinmeyen fas arındırmak için gerek kalmadan fas belirleyebilir.

Standartları ticari bir karışım olan, Bacillus cereus hazırlanabilir FAME kromatografik profillerini karşılaştırmak için diğer Fas'ın kimliğine fas, ECL hesaplama ve hipotez, doymuş, düz zincirli tanımlanmasına izin verir. ve Fames karbona aynı sayıda doğrusal doymuş finansman kurumu göre FAS, iso veya anteiso-, ECL sürekli bir negatif kayma gösterir doymuş dallı. Doymamış Fas'ı kareleri moleküler iyon kütlesi ile tespit ve karşılık gelen doymuş Fas'ına göre ECL olumlu bir artışa neden olabilir.

Fas'ı dallanma konumu ve doymamış Fas'ın çift bağ pozisyonu, sırasıyla, pikolinil ve DMOX türevlerinin elektron iyonizasyon kütle spektrumları ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, tüm bilinmeyen doymuş şube tanımlarEd fasının doymamış, düz zincirli Fas ve B. cereus özü doymamış dallı FASB.

Giriş

Yağlı asit metil ester (FAME), gaz kromatografisi (GC), lipid karakterizasyonu için gerekli bir yöntemdir. Bu hızlı bir şekilde ayırır ve kısa bir ekstraksiyon aşamasından sonra bir numune, çeşitli yağlı asitleri (FAS) ifade etmektedir. metil ester türevleri, kromatografik kolona doğru yüksek, uçucu istikrarlı ve inert böylece atık doruklarına kaçınarak. kromatografik profiller yayımlanmış veya standartlarla karşılaştırıldığında, çünkü örnek tanınmış finansman kurumu oluşuyorsa kendi kimlik oldukça basittir. Buna ek olarak, çeşitli Fas'ın ölçümü için bir kalibrasyon standartları tekrar enjeksiyon alev iyonizasyon saptamasıyla (FID) ¹ kendi hemen hemen sabit tepki verilir, gerekli değildir.

FID ek olarak, kütle spektrometrisi (MS) tespit FAMEler teyit etmek için bir bilgi tamamlayıcı bir dizi sağlar. Kareleri elektron iyonizasyonu (El) ile şarj edilir, ancak elde edilen spektrumlar her th için izin vermeFA ince yapısının e tanımlanması. Teşhis iyonları ¹ tespit edilmesi zor olan ve hedef iyon bolca karakteristik bir değişiklik kütle spektrumu kütüphaneleri ² kullanımını engelleyen, makineye bağlı olduğu için, örneğin, konum dallanma (yani, metil dallı grup) tahmin etmek zordur. Başka bir sorun EI çift bağ göçünü neden olduğundan çift bağ pozisyonunu belirleme yatıyor. Böylece, çift bağ pozisyonlarını değişen FA izomerleri kendi kütle spektrumları ayırt edilemez. Neyse ki, başka araçlar FA tanımlanması için geliştirilmiştir. Örneğin, durum ve fasıl'da çift bağların ya da dallanma konumu eş zincir uzunluğuna sahip (ECL) ³ hesaplanarak conjectured edilebilir.

Diğer türetme yöntemleri bir çift bağ ya da kollara ayrılmış bir metil grubunun konumuna bağlı olarak, farklı kütle spektrumları ile sonuçlanır. 4,4-Dimetil oksazolin türevleri (DMOX) ⁴ EAS izintekli doymamış yağ asidi çift bağların pozisyon y tanımlanması. Ester (pikolinil ester) türevleridir metil yerini kesin tanımlanması için izin veren 3-pyridylcarbinyl FAs ⁵ dallanmış. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrumu, yapısal karakterizasyon ¹ tartışılmaz bir yöntem için gerekli olan, saflaştırma karmaşık yöntemler kullanmaya gerek kalmadan kromatografik (ECL) ile kütle spektrumları (DMOX ve pikolinil) bilgi çoğu Fas'ın saptanmasına olanak birleştirme .

Bazı insan ve hayvan patojenleri içeren Bacillus, bakteriler, çok çeşitli bir niş kolonize edebiliyoruz ve bu nedenle yaygın olarak çevre ⁶ dağıtılır. Bacillus cinsi içinde, FA bileşimi (çevresel değişiklikler geniş bir uyum FA desen modülasyonlar türlerin ekolojik niş etkilenir, örneğin, büyüme ortamı, sıcaklık,pH, vs.) ^7-9. Çünkü standart koşullarda büyüme sırasında Bacillus türleri arasında FA model göreli homojenlik FA bileşimin belirlenmesi Bacillus türleri tanımlamak için kullanılan temel kriterlerden biridir. Bacillus cinsinin eşsiz bir nitelik 12-17 karbon iso ve çevre koşullarına uyum önemli bir belirleyicisi olan anteiso- izomerler arasındaki oran ile ^10-12 ihtiva eden dallı zincirli finansman kurumu bolluğu olduğunu. Bacillus türleri de doymamış yağ asitlerinin oranının değiştirilmesiyle çevresel değişimlerin uyum. Bacillus cereus gibi bazı türler, iki yağ asidi desatürazlar uyum ⁹ farklı rollere sahip alkil zincirinin ¹³ farklı pozisyonlarda çift bağ oluşturur. Bacillus cinsinin örnek tam çift bağ pozisyonunu belirleme ve FA dallanma önemini göstermektedir. Toplamakively, Bacillus FA desen kimlik birçok yararlı uygulamalar vardır. Bu yazıda, klasik bir GC-MS analizi doğasında kısıtlamaların üstesinden Bacillus FA desen tanımlanması için yeni bir GC-MS yaklaşımı öneriyoruz.

Bu yenilikçi yaklaşım, ham biyolojik bir malzeme üzerinde doğrudan kullanılan ve mevcut tekniklerin bir kombinasyonundan oluşur edilebilir: tutma süreleri (ECL) ve farklı FAs türevleri (FAME, DMOX ve pikolinil-ester) kütle spektrumları modülleri.

Biz şu FA isimlendirme kullanın. a ve n, iso gösterir I, anteiso- metil sırasıyla dallanmış ve düz zincirli yağlı asit. Doymamış FAs C olarak seçilmiştir: Cı karbonlu yağlı asit atomuna ve D sayısı D ikili bağların sayısı. Δ ^X bir çift bağ karboksilik asit uç sayarak, X. karbon-karbon bağı bulunmaktadır çift bağ pozisyonunu gösterir.

Protokol

1. Bakteri kültürleri

1. LB agar ortamı bir plaka yüzeyi üzerine, LB (Luria-Bertani ortamında) içinde 30 ° C'de inkübe soyun bir gecelik kültüründen 100 ul yayarak bakteriler (Bacillus cereus ATCC 14579) 'in bir çim hazırlayın. 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.

2. ECL: Eşdeğer Zincir uzunluğu

1. şöyle ECL hesaplayın: ile:
   Ben ilgi çözünen;
   N, çözünen önce elüsyon düz zincirli, doymuş yağlı asit metil ester karbon sayısı I;
   N + 1, çözünen sonra elüsyon, düz zincirli doymuş yağlı asit metil ester karbon sayısı I;
   RTI, RTN R (n + 1), yukarıda tarif edilen FAME tepe tutma süreleri verir.
   Not: (aykırı bir karışımının enjeksiyonla B, düz zincirli doymuş yağ asitleri metil esterlerin tutma süreleri elde edilirAME).

3. FAME Hazırlama ve Analiz

1. Agar plakasından koloniler kazınarak lipit yağlı asitler, hasat bakteriyel hücreler elde etmek ve vidalı kapaklar ve PTFE keçe 10 ml'lik bir cam tüp içine bakteri (10 ⁹ canlı hücre eşdeğer taze ağırlık), 40 mg aktarmak için.
2. Aşağıda ayrıntıları verilen ester bağlantı yöntemiyle ^14,15 aracılığıyla transesterifikasyon gerçekleştirin.
   1. Taze bakteri hücreleri için metanol içinde 0.2 M KOH 5 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu reaksiyon, lipid ester bağlantısı kırma ve yağlı asit metil esterlerinin üretilmesi, alkalin metanoliz oluşur.
   2. 7.0 pH değerini düşürmek için 1 M asetik asit 1 ml ilave edilir. pH test şeritleri ile pH'ı kontrol edin.
   3. FAMEler çıkarmak için heksan 3 ml ekleyin.
   4. yaklaşık 200 ul elde etmek üzere bir nitrojen sürekli akış altında oda sıcaklığında buharlaştırma ile temiz bir tüp içine süpernatant (organik faz) aktarın ve konsantreekstresi. ekleme ile GC şişe içine örnek aktarın.
   5. Bir gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) sistemi hülasalarının enjekte edilir.

4. GC / MS koşulları

1. bir kılcal kolon ZB-balmumu (çapı, 0,25 mm, film kalınlığı 0.25 um uzunluğunda, 30 m) ile donatılmış bir GC-MS cihazı içine FAME örnekleri enjekte edilir.
2. (Yarıksız modunda) enjeksiyon ağzının 250 ° C'ye sıcaklığa ayarlayın. 37 cm / sn arasında bir doğrusal hız ile, taşıyıcı gaz olarak helyum kullanın. 20 ° C / dk bir oranda 190 ° C'ye arttırmak ve 2 ° C / dk bir oranda 230 ° C'lik bir son sıcaklığa kadar daha da artması, 1 dakika boyunca 50 ° C de fırın sıcaklığı tutun.
3. MS için 70 eV elektron iyonizasyon (EI) kütle spektrumları kaydedebilir ve 50 ve 400 atomik kütle birimi (akb) (2 tarama / sn) arasındaki toplam iyon akımı satın ayarlayın.
4. Gerektiğinde, aynı durum İstisnai altında DMOX ve pikolinil türevleri enjekteaşağıdaki gibi sıcaklık programı fırın t:
   DMOX: 50 ° C (1 dakika), 20 ° C 210 ° C ye kadar / dk ve 2 ° C / dakika, 240 ° C (5 dakika) kadar;
   Pikolinil: 6 ° C (1 dakika), 220 ° C'ye kadar 20 ° C / dakika ve 250 ° C (20 dakika kadar) 2 ° C / dak.

FAME ¹⁶ 5. Pikolinil ester Preparasyon

1. bir azot akımı (en az 10 mg kuru madde) ile Kısım 3'ten FAME özü buharlaştınn ve kuru diklorometan 1 ml içinde çözülür.
2. Tetrahidrofuran içerisinde potasyum tert t-butoksit içindeki bir 1.0 M çözelti hazırlayın.
3. FAME özü ve aşama 5.2'de yapılan çözeltinin 0.2 ml 3-piridinmetanol ila 0.1 ml ilave edilir.
4. kapalı bir şişede 30 dakika boyunca 40 ° C'da, çözelti ısıtılır.
5. Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, (Malzeme bakınız Tablo, 2 mL) ve heksan (4 mi) arıtılmış, iyonu giderilmiş su ilave edilir. Bir girdap ile karıştırın faz ayrılması için izin ve organik faz toplamak.
6. drorganik faz kadar susuz sodyum sülfat ilave edilerek y bunu çok açıktır. Temiz bir tüp içine aktarın. Daha sonra 200 ul buharlaştırılmaktadır. ekleme ile GC şişe içine örnek aktarın.

FAME ¹⁷ 6. DMOX hazırlanması

1. nitrojen (en az 10 mg kuru madde) içindeki bir akışı ile Bölüm 3'ten FAME özü buharlaştırın.
2. FAME kuru ekstre etmek için, 2-amino-2-metil-1-propanol, 250 mg ekleyin. Nitrojen ile kap yıkayın bir stoper ekleyin ve 190 ° C de bir gece boyunca ısıtma bloğu içine koyun.
3. Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, tüp, 3 ml diklorometan ekleyin ve 5 ml deiyonize edilmiş su (Malzeme Tablosu) arıtıldı.
4. Faz ayrımı için çalkalanır ve daha sonra sulu faz çıkarın.
5. 5 ml su ile organik faz yıkanır. Faz ayrımı için çalkalanır ve daha sonra sulu faz çıkarın.
6. organik faz kadar susuz sodyum sülfat eklenerek kuru çok açıktır veTemiz bir tüp içine aktarın. 200 ul bir hacim elde edilene kadar bir azot akımı altında buharlaştırılır. ekleme ile GC şişe içine örnek aktarın.

Sonuçlar

Bakteriyel hücrelerden FA kimlik stratejisi Şekil 1 'de sunulmuştur. Her adım tamamlayıcı spektral bilgi veya kromatografik tutma hakkında bilgi sağlar. Aşama 1, standart çözeltisi kullanılarak, ön FA belirlenmesinden oluşur. Adım 2 geçici ürünlerini belirlemek için, FAME EI spektrumları ve ECL yorumlanması için izin verir. Adım 3 dallı zincirli-Fas kesin dallanma konumunu tanımlar. Son olarak, aşama 4, doymamış fasıl'da çift bağlar...

Tartışmalar

Tablo 1 'de gösterilen FAs kromatogram profilleri bir agar plakası yüzeyi üzerinde büyütülmüş, B. cereus ATCC 14579 karşılık gelmektedir. Bakteri, aynı sıcaklıkta ⁸ de gaz sıvı ortam içinde büyütülmüştür da benzer profilleri elde edilmiştir. Sıvı ortamda yetişen bakteri durumunda, bakteriyel biyokütlenin büyüme ortamının santrifüj ile toplanır ve büyüme koşulları ^8,19 bağlı olarak daha önce tarif edilen protokollere göre yıka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GC/MS	Shimadzu	QP2010
capillary column ZB WAX	Phenomenex	7HG-G007-11	30 m x 0.25 mm x 0.25 µm
Methanol Lichrosolv	VWR	1.06018.2500
potassium hydroxide	Aldrich	P1767
THF	Hipersolv Chromanorm	28559.320
Dichloromethane	Hipersolv Chromanorm	23373.320
Hexane	Hipersolv Chromanorm	24575.320
3-pyridinemethanol	Aldrich	P6-680-7
potassium tertiobutoxide	Aldrich	156671
2-amino-2-methyl-1-propanol		A-9879
MilliQ Academic	Millipore	ZMQS50001
Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix	Sigma-Aldrich	47080-U Supelco