Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

Özet

Amerikan bullfrog en (Rana catesbeiana) sakkuluslar saç hücre fizyolojisinin doğrudan muayene izin verir. İşte diseksiyon ve biyofiziksel çalışmaları için Bullfrog en sacculus hazırlanması tarif edilmektedir. Biz onun unforced bir hareket Paketin kuvvet-deplasman ilişkisi hesaplanması ve ölçümü de dahil olmak üzere, bu saç hücrelerinden temsili deneyler göstermektedir.

Özet

işitme ve denge çalışma modeli sistemlerinde biyofiziksel çalışmalardan alınan bilgilerle üzerine oturmaktadır. Böyle bir model Amerikan bullfrog sakkuluslar, işitsel ve vestibüler araştırma bir dayanak noktası haline gelmiştir. Bu organın Çalışmalar aktif ortamdan sinyalleri tespit nasıl duyusal hücrelerin saç ortaya koymuştur. Çünkü bu çalışmaların, şimdi daha iyi mekanik yolluk ve saç hücrenin transdüksiyon kanalları, mekanik uyarlamasında Kalsiyum rolü lokalizasyonu ve saç hücresi akımların kimliğini anlıyorum. Bu son derece erişilebilir bir organ saç hücrelerinin işleyişini içgörü sağlamaya devam etmektedir. Burada da saç hücreleri üzerinde biyofiziksel çalışmalar için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz tam diseksiyon prosedürü içeren ve belirli bağlamlarda sacculus hazırlanması için özel protokolleri sağlar. Biz ayrıca hesaplanması dahil olmak üzere bu hazırlık kullanılarak temsilcisi sonuçları içerirsaç Paketin anlık kuvvet-deplasman ilişkisi ve Paketin kendiliğinden salınım ölçümü.

Giriş

Memelilerin acousticolateralis organları karmaşık bir mimari sahip ve erişim zor olabilir anatomik bir niş içinde yalan. Örneğin, memeli koklea bir sarmal labirent oluşur ve kalın temporal kemik içinde gömülü. Koklea izolasyonu sık sık içinde yatan duyusal hücrelerin mekanik hasara neden olur ve bu nedenle zor bir görev ¹ olduğu kanıtlanmıştır. Sinirbilimciler böylece daha kolay kulak kutsal ayıklanır sistemlerin modellenmesi döndü.

Bu model sistemlerinde biri, Amerikan bullfrog (Rana catesbeiana) ve sakkuluslar, yıllardır işitsel ve vestibüler sistemin işlevi içine genellenebilir fikir vermiştir için vardır. sakkuluslar düşük frekanslı işitme ve sismik hissi hem de duyusal rolleri olan bir karma işlev organıdır. sacculus duyusal hücrelerin kendi saç hücreleri, mekanik enerjiyi dönüştürmek uzman dönüştürücüler vardırBizim işitsel ve vestibüler organları içinde elektrik sinyallerine. Her saç hücresinin apikal yüzeyinde çıkıntı stereocilia denilen genişlemiş mikrovilluslar kademeli bir tutam içeren bir mechanosensitive saç demetidir. Bitişik stereocilia uçları lifli uç bağlantı proteinleri ile birbirine mekanik olarak kapısı iyon kanalları mekanik uyarıcılara ^{2, 3} yanıt olarak. İşitsel ve vestibüler organlar uyaranlara farklı yanıt da, ortak bir algılama mekanizması paylaşır. Bu ortak nokta bullfrog sacculus çalışmaları sayesinde saç hücre mechanotransduction içine aldığı birçok anlayışlar yatmaktadır. Örneğin, saç hücrenin etkin bir süreç bu organ ^{4, 5, 6, 7} yaygın olarak incelenmiştir, ve saç demeti, mekanik üretmek için bir enerji tüketen işlemini kullanmaktadıriş. Sadece saç hücreleri aktif çalışma ⁶ oluşturmak olduğu gösterilmiştir, ancak farklı etken sürecini altında yatan mekanizmalar ve saç hücrenin akort özellikleri organlarının acousticolateralis bullfrog çalışmaları ile tanıtıldı edilmiştir. Amfibi papilla saç hücrenin şerit sinaps ¹² aktif saç demeti motilite ⁸ ve saç hücresi elektrik rezonans ^{9, 10,} sacculus ¹¹ ve frekans seçiciliği bulunmaktadır.

Bullfrog en sakkuluslar çeşitli nedenlerle duyusal sinirbilimciler hitap ediyor. Memeli koklea aksine, bu organın kolayca erişilebilir otik kapsül içinde yatıyor. İkincisi, bu organın içindeki saç ^{hücreleri, 14} uygun koşullar ¹³ altında birkaç saat sağlıklı kalabilir. Bu experimentat izinonların memeli meslektaşları göre uzun zaman ölçekleri üzerinde bu hücrelerin iyon. Üçüncü olarak, organ kolay manipülasyon izin, küçük eğrilik taşır. Dördüncü, her organ, yüksek verimlilik ve belirli bir deney için saç hücrelerinin uygun bir dizi bulma olasılığı yüksek hem de sağlayarak, bin ya da daha fazla saç hücrelerinin ¹⁵ içermektedir. Son olarak, Bullfrog en sakkuluslar kolayca nedeniyle saç hücrelerinin bu organ ve büyük boy inceliği ile görüntülenmiştir.

Bu özellikler Bullfrog en sacculus içinde duyu hücrelerinin çalışma için büyük bir çok yönlülük sağlar. eldeki soruya bağlı olarak, bir çok deneysel preparatlarının bir sacculus elde edilebilir. Bu en basit bir bölme hazırlığı olduğunu. Burada sacculus yapay perilenf bir sodyum-zengin ve yüksek kalsiyum tuzlu su ile doldurulmuş bir odacığm içine tesbit edilir. Bu hazırlık saç hücre akımları ve temel saç demeti mekaniği çalışma sağlar. Ikinci bir konfigürasyon, iki odacıklı preparat, kendiliğinden saç demeti hareketleri incelemek için kullanılabilir. bazolateral tarafı yapay perilenf yıkandığı ise burada saç hücrelerinin apikal tarafı potasyum bakımından zengin ve kalsiyum bakımından fakir tuzlu maruz kaldığı, yapay endolymph olarak adlandırılan. Bu iki bölme salines in vivo düzenleme taklit ve saç demetleri kendiliğinden salınım sağlayan bir ortam sağlar.

Bu yazıda duyusal saç hücrelerinin biyofiziksel çalışma için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz ilk Kurbağanın iç kulak bu organın izole ayrıntılı bir tasvirini sunar. Daha sonra tek ve iki odacıklı hem deneysel hazırlıkları tanımlamak ve her yapılandırma için temsili sonuçlar içermektedir.

Protokol

Etik Beyanı: Tüm işlemler Rockefeller Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ön deney Prespanparation

1. Çözümler
   1. Eugenol çözüm hazırlayın (2.5 g · L ^{-1 kg-1} kurbağa). Salin çözeltileri (Tablo 1) hazırlayın.
      NOT: Bir tek odacıklı hazırlanması için yapay perilenf hazırlamak; İki bölmeli hazırlanması için, suni perilenf ve yapay endolymph hem hazırlanması.

2. Deneysel Araçlar

1. Cam stimülasyon elyaf hazırlanması
   1. yüksek ısı ve yüksek hızda tek satırlık çekme bir elektrot çektirmesi ile borosilikat cam kılcal daraltın. solenoid odaklı çektirmenin içine çekti kılcal yükleyin.
   2. Bir cam boncuk ile bir filamanın doğru kapilariteyi en ucu getirKılcal temas cam boncuk kadar bunun üzerine erimiş.
   3. Cam boncuk halinde kılcal ucu eritmek için filaman açın. kılcal ve boncuk arasındaki cam formları ince bir köprü kez filament kapatın ve aynı zamanda etrafında selenoid çektirme etkinleştirin.
      NOT: Bu uzun eksenine dik açıyla cam kapiller çekin ve sağlam bir lif yaratacaktır.
   4. elyafın çapı en fazla 0.5 daha emin olun - 1 mikron ve uzunluğu 100 aşmadığı - 300 mikron. elyafın uzunluğu bu boyutu aşarsa, iris makası ile kırpın. Zaten diseksiyon araçlarını zarar görmemesi için sıkıcı makas kullanın.
   5. Optik kontrastı artırmak için, kaplamaz lif sputter. altın paladyum kaynağı ile, bir püskürtme kaplayıcıda kullanın. Dikey kaynağına doğru olan konik ucu ile bir püskürtme kaplayıcı içine her lif yükleyin. altın palladyum kaynağının 2 cm - 1 bir mesafeye fiberin ucunu getirmek.
   6. KapatBir mühür formu ve açmak için kaplayıcının odasına sputter. Tekrar tekrar argon ile ortam havasını dışarı yıkayın. havayı kızarma sonra, 10 Pa (70 mTorr'luk) odanın içindeki basıncı azaltır.
   7. 120 s boyunca 10 sn gecikme ile 10 s bakliyat kat sputter.
      NOT: püskürtmeli kaplama başarılı oldu ise fiberin ucu bu protokolün süresi boyunca kararacak.
2. Keskin Mikroelektronlar hazırlanması
   1. tek satırlık yüksek ısı çekme kullanarak bir iç filamanın bir cam kılcal çekin. 3 M KCl ile doldurulduğunda 300 MQ - elektrotlar 100 arasında bir dirence sahip olmalıdır. 3 M KCl ile her elektrot doldurun.
   2. Amplifikatör headstage ¹⁶ monte edildiğinde bend microforge her elektrot ucu saç hücresi apikal yüzeye çok dik hale getirmek.
3. Iyontoforez pipetler hazırlanması
   1. bir iç bir cam kılcal çek50 M? ucu filamanın. Konsantre çözünen (örneğin, 500 mM gentamisin sülfat) ile doldurun.
4. Alüminyum montaj meydanın hazırlanması
   1. alüminyum folyodan bir 1 cm x 1 cm kare kesin. Bir pithing çubuğu veya diğer sivri nesnenin ucuyla merkezinde folyo Perfore. dairesel ve çapı yaklaşık 1 mm olacak şekilde perforasyon şekillendirin.
5. Vakum gres şırınga hazırlanması.
   1. 5 ml şırınga pistonu çıkarın. vakum gres ile arkasından şırınga doldurun. pistonu değiştirin.
6. Politetrafluoroetilen yapıştırıcı uygulayıcının hazırlanması
   1. Bir tahta aplikatör çubuk sonuna oyulmuş 2 mm uzunluğunda eksenel olun. son görüntülendiğinde yarık uygulayıcının merkezinde olmalıdır.
   2. keskin bir makas veya bir jilet ile, 1 mm kalınlığındaki bir tabakadan politetrafloroetilen 2 mm x 4 mm dikdörtgen kesin.
   3. politetrafloroetilen dikdörtgenin 2 mm-uzun kenarlarından ince birine bir jilet kullanın. dikdörtgenin ortasında başlayarak, dikdörtgenin ucunda bir eğim oluşturmak için dışa dilimleme dikdörtgen kalınlığını azaltır.
   4. Eğimli kenarın uzak sopa bakacak şekilde ahşap aplikatör yarık içine politetrafloroetilen dikdörtgen yerleştirin. yerine sabitlemek için politetrafloroetilen dikdörtgenin tabanına 5 dk epoksi uygulayın. Tutkal uygulama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bekletilmelidir.
7. İki bölmenin alt yarısının hazırlanması monte
   1. Makine veya 3D iki odasının alt yarısı (İlave dosya 2) monte yazdırın. odasının alt yüzeyi üzerinde 20 mm çaplı gömme daire tanımlar.
   2. girintili dairenin en yanal 3 mm epoksi ince bir tabaka sürün. epoksi bir 18 mm yuvarlak cam lamel uygulayın. epoksi 1 için kurumaya bırakınızh.

İç kulak Organ 3. Ekstraksiyon

1. 10 dakika eugenol anestezik solüsyon içeren küçük bir kova yerleştirerek bir Amerikan bullfrog uyutmak. çözümün ses seviyesini ayarlamak, böylece sadece sıvı-hava arayüzü üzerinde kurbağa humero-skapular ortak yatıyor.
2. çift ​​pithing tarafından anestezi bullfrog euthanize.
   1. çene altında biri kendi burnunun üstüne parmak ve birbirleri ile anestezi kurbağa kavrayın ve ileri kurbağa kafasını döndürün.
   2. Hızla kurbağa oksipital süreçleri arasındaki orta hat bulunan foramen magnum, kranial tonoz içine pithing çubuğunu dalma.
   3. Yavaş yavaş çekilme ve ucu foramen magnum yola kadar çubuk döndürün. omurilik yok etmek için vertebra foraminalardan yoluyla kaudal çubuk zorlayın.
   4. Kurbağa düzgün iki kat alt ekstremite genişletilmiş olduğunu gözlemleyerek pithed olduğunu onaylayın.
3. Geliştirilmiş istikrar için vomerine diş kavrama burun ve ilk parmağı üzerinde bir başparmak ile kurbağa kavrayın. bilateral temporomandibular eklem kesilmesinin ve daha sonra rostro eksene dik keserek kurbağa başını kesmek. kafatası içinde iç kulak organları sağlam kalmasını sağlamak için, kesim hem tympana aşağısındaki olduğundan emin olun.
4. Bir stereodissection mikroskop kullanarak, doku (Şekil 1A) en arka ölçüde vomerine dişlerin damak dokusu kesti bir orta hat yürütmek.
5. Sever ve posterior kıkırdak ortaya çıkarmak için damak dokusu altında yatan neşter yatay kesim herhangi bir kas net. kas çıkardıktan sonra, otik kapsülün sınır oluşturan zamansal kıkırdak lolipop şeklini gözlemlemek.
6. otik kapsülün kıkırdak ile temas noktasındaki columella Sever.
7. Defalarca shallo yaparak bu kıkırdak ince tabakalar tıraşiçinden w yatay keser. iç kulak organlarına zarar görmesini önlemek için derin kesikler kaçının. Bu zamansal kıkırdak (Şekil 1B) lolipop yapısı içinde bulundu otik kapsül açılır. Otik kapsül içinde kurbağanın iç kulak organlar (Şekil 1C) bulunmaktadır.
8. iç kulak organlara zarar vermemeye özen, posterior ve otik kapsülün yanal kenarları kırpın. disseksiyonda sıklıkla batık ve sulu kalmasını sağlamak için iç kulak organları üzerinde tuzlu su akar.
9. orta hatta kıkırdak medial bağlantısında temporal kemiğin iki dairesel açıklıklar bulun. Temporal kemik yırtmak için en medial açıklıktan aşağı doğru kesin.
10. onun arka-yan kenarında otik kapsül içinden ikinci bir aşağı kesim olun. iç kulak organlarına erişim sağlamak için bu ve bundan önceki kesim arasındaki kıkırdak parçasını çıkarınız.
11. adımlar 3.8 a gelen kesimler arasındaki kıkırdak gevşek gözetlemeknd 3.9 ve otik kapsül uzak kesti. Bu işlem, daha sonra manipülasyonlar için bir sap olarak kullanılabilir yakın yarı dairesel kanal, koparır.
12. Sacculus dokunmamaya özen kranial sinir ^inci VIII sever.
13. En yakın semisirküler kanalın ampulla tutun. Yavaşça kalan iki yarı dairesel kanallar ortaya çıkarmak için iç kulağı döndürün. Her kanal açığa üzerine, onu sever.
14. sinir veya bir semisirküler kanal ampulla Holding, baş iç kulak ayıklamak ve soğutulmuş oksijenlenmiş yapay perilenf ile dolu bir tabak koyun. Iç kulak çıkarılması semisirküler kanallar kez geçtikleri temporal kemik (Şekil 1D) içinde pasajlar görselleştirme izin verir.
    NOT: İkinci kulak ayıklamak için bu adımları tekrarlayın.

4. Tek odacıklı Hazırlık

1. Sacculus izolasyonu
   1. Geniş katiyen belirleyerek sacculus bulunE otokonin kütlesi ve bunu üstüne yer alan sakküler sinir (Şekil 1 E). Fiziksel Sakküler saç hücrelerinin bütünlüğünü korumak için aşağıdaki adımları sırasında sacculus travmatize özen gösterin.
   2. iç kulak daha manevra hale getirmek için yarım daire kanalları Trim.
   3. sacculus nöral tarafını örten perilenfatik sarnıç çıkarın. sarnıç çevresinde yumuşak kesim yapmak. Sonraki sacculus sinirsel tarafına sarnıcın en membran köprü küçük doku ayağı sever.
   4. lagena ve ilişkili sinir çıkarın.
   5. sakküler sinir Holding, hafifçe sacculus kaldırın ve otoconial kesenin ince zarından kesti. kesenin dışına otokonin sızıntısı olarak, kendi çevresi etrafında keserek sacculus özgür.
      NOT: İstenirse sacculus izole sonra, kalan iç kulak organları kaydedilebilir. sacculus çıkarılması gibi başka yapıların belirlenmesini kolaylaştırıramfibi ve baziler papillalar.
   6. dikkatle sacculus üzerinde kalan otokonin silip makas veya forseps kullanabilir. Bu işlem sırasında sacculus dokunmamaya özen gösterin.
   7. sacculus 'kenarından kalan otoconial-sac membran kesin. Bu zar, plastik ve cam yüzeylerde yapışma eğilimi ve kaldırma dokusunu ele zorlukları en aza indirir.
   8. Yavaşça kalan otokonin (Şekil 1F) çıkarmak için bir Pasteur pipeti ile sacculus fazla tuzlu su akar.
      NOT: İlk bir ayna görüntüsü olan ikinci sacculus, bu işlemi tekrarlayın.
2. Sindirim ve montaj
   1. Kırık ucu olan bir Pasteur pipeti arka ucunu kullanarak, suni perilenf 67 mg ∙ ^L-1 proteaz XXIV 3 mL içeren bir Petri kabı izole sacculi aktarın.
      NOT: Bu proteaz tedavi otolithic her kinociliary ampul hayvan zinciri bağlantıları sindirirMembran, duyusal saç demetleri zarar vermeden membranın çıkarılmasını sağlayan.
   2. 22 ° C (veya 21 ° C'de 35 dakika), 30 dakika boyunca doku inkübe edin. Açık yüzlü deneysel odasına her sindirilmiş sacculus aktarın ve manyetik pimleri ile doku sabitleyin.
   3. sakküler makula doğrudan otolithic membranın altında yatıyor ve saç hücreleri içeren sacculus kısmıdır. tanımlamak ve dikkatle sakküler makulayı dokunmamaya özen ince bir kirpik kullanarak üstte otolithic membran kaldırmak.

5. İki odalı Hazırlık

1. Sacculus izolasyonu
   1. Bölüm 4.1 gibi iç kulak organlarından sacculus izole edin.
2. Montaj ve sindirim
   1. Vakum iki noktalar kullanarak, suni perilenf montaj bloğu (Company dosya 3) doldurun ve bir açılış delikli alüminyum folyo koyunyerinde tutun ve zayıf mühür oluşturacak şekilde yağlayın.
   2. Transferi bir folyoya sakkuluslar ve aşağı bakacak makula ve yukarı bakacak şekilde sinir güdük ile deliğin üstünde ortalamak.
   3. bükülmüş doku parçası ile sacculus çevreleyen tuzlu su çıkarın. sacculus çevreleyen alüminyum kare yüzeyini kuru tuzlu fitil.
   4. sacculus kenarında ve alüminyum meydanı arasındaki sınır boyunca sıkı bir mühür oluşturmak için siyanoakrilat tutkal uygulamak için politetrafloroetilen aplikatör kullanın. sacculus tüm çevresi yapıştırıcı ile kaplanmış olduğundan emin olun.
      NOT: çok yavaş ilerleyerek siyanoakrilat yapıştırıcı sacculus nöral tarafı üzerinde sürünme ve sonunda onu karşılamak için izin verir. Hızla bu görevi tamamlamak için zorunludur.
   5. tutkal tedavi monte dokusunun üstüne bir damla serum fizyolojik yerleştirin. tutkal ince bir film tuzlu su damlasının üzerine oluşturabilir; forseps ile çıkarın.
   6. Dikkatle t kaldırmakO bağlantı bloğundan bozarlar. sacculus maküler tarafı yukarıya bakacak şekilde üzerine monte doku çevirin ve yapay perilenf dolu Petri kabı üzerine yüzer.
   7. makula üstünde proteaz XXIV solüsyondan bir damla ilave edin ve 22 ° C (veya 21 ° C'de 35 dakika), 30 dakika boyunca inkübe edin. Merkez odasının etrafında perilenf ve yer vakum gres ile iki odalı aparatı (Company dosya 2) alt kanal doldurun.
   8. bölmenin bakan yüzeyinde sinir alt odasının folyo monte sacculus yerleştirin. folyo çevresinde yağ ekleyin.
   9. Vakum yağ ile tam bir sızdırmazlık oluşturmak için özen, folyo hazırlık üst bölmeyi (Company Dosya 1) yerleştirilir. kabarmış yapay endolymph üst bölmeyi doldurun ve yavaşça bir kirpik ile otolithic membran kaldırmak.

Sonuçlar

Bullfrog en sacculus duyusal epitel saç hücrelerinin fizyolojisini prob çeşitli konfigürasyonlarda kullanılabilir. Doku nispeten düz olduğu için, tek ve iki-odacıklı preparatlar hem de monte edilebilir. tek odalı yapılandırma saç hücreleri elektrofizyolojik ve mikromekanik kayıtlar için basit bir kurulum sağlar. iki odacıklı hazırlık yerine Endolenfatik ve saç hücrelerinin sırasıyla apikal ve bazal tarafta perilenfatik bölmeleri simüle eder. Bu bölmeler birbirine saç hücreleri tarafından mechanotransduction çalışma için fizyolojik olarak uygun bir ortam sağlar.

saç hücrelerinin duyarlılığı ve transdüksiyon özellikleri, mekanik stimülasyon elektrik tepki temelini oluşturur. Bu özellikleri prob, biz aynı anda tek bir saç kaydedilen onun paket konumunu hücre veHücrenin reseptör potansiyeli (Şekil 2). Biz ilk kuvvet darbelerini uygulamak için saç demeti kinociliary ampul için esnek bir cam elyaf bağlı. Daha sonra çift fotodiyot sistemi ² (Şekil 2A) ile saç demeti en deplasman ölçüldü. Biz aynı anda keskin bir mikroelektrot ile hücreyi impaling saç hücrenin potansiyelini satın aldı. Bu saç demeti karşılık gelen yer değiştirme (Şekil 2B) karşı her bir mekanik uyarıma neden tepe voltaj yanıt işaretlenmesiyle bir yer değiştirme-yanıt eğrisi elde edilmiştir. saç hücrenin elektriksel tepki hem pozitif-negatif-deplasman ekstramumların için doyurur. Negatif değiştirme adımları ile membran potansiyelinin azalmasına mechanotransduction akım içeri doğru, bir dinlenme varlığını gösterir. Bu dinlenme ^akımı, hem hızlı hem de yavaş adaptasyon ¹⁷ Ca ²⁺ hareketi ile modüle edilir ^{18, 19, 20, 21.}

Bir saç hücrenin davranışı elektrik özellikleri üzerine değil, aynı zamanda onun duyusal saç demetinin mikromekanik üzerine sadece bağlıdır. İki odalı yapılandırma taklit bir saç demeti mekaniği çalışmaları için ideal koşullar sağlayan in vivo endolymph ve perilenf ayrılması. Bu koşullar altında ve kaldırılır otolithic membran ile, saç demetleri kendiliğinden ⁶ salınım olabilir. Burada bireysel demetleri mikromekanik değerlendirmek için iki odacıklı hazırlık kullandı. Biz bir çift fotodiyot deplasman monitör (Şekil 3) üzerindeki gölge döküm bir saç demeti spontan salınımların kaydedildi. mechanotransduction üzerinde antibiyotik aminoglikozid gentamisin rolünü değerlendirmek için, iyontoferik rele saç demeti doğrudan gentamisin ased (Şekil 3). serbest gentamisin konsantrasyonu mikropipet geçti akım ile orantılı artar. Gentamisin saç Paketin salınımları inhibe ederek uzun tarafına doğru demetin ofset statik neden olur. Bu etkiler kendi nüfuz gözenek bloke ederken mechanotransduction kanalların açık durumunu koruyan bir açık kanal blokörü olarak gentamisin rolünü yansıtmaktadır. Yüklü kimyasal iyontoforez lokalize ve sıvı akış kaynaklı mekanik bozulma olmaksızın çeşitli konsantrasyonlarda kimyasal ölçülebilir salma ve bu nedenle ideal olarak saç demeti ²² ile mechanosensitive organellerin çalışma için uygundur izin verir.

Bir saç demeti spontan ^hareket, uyum ve doğrusal olmayan demet sertlik ⁷ arasındaki etkileşim doğarxref "> ^{8, 23, 24.} Bu kendiliğinden hareket viskoz sürükle aşmak için mekanik çalışma içine sinyal enerjisini dönüştüren bir saç demeti aktif sürecin, bir imza. Saç demetleri vestibüler ^2, işitsel nonlineer anlık sertliği sergiledikleri görülmüştür ^25, ve lateral hattı sistemleri ^26.

Bu doğrudan BULLFROG en sacculus (Şekil 4) bağımsız bir saç demeti ani sertlik ölçülmüştür. Bu amaca ulaşmak için, saç demeti en kinociliary ampul (Şekil 4A) için esnek bir cam elyaf ucu bağlanmış. Biz elyafın tabanını yerinden saç demeti kuvvetleri teslim. uyarıcı fiber saç demeti üzerine uygulanan kuvvet elyafın bas deplasmanları arasındaki farka tekabüle ve ucu, fiberin sertlik ^{2, 27} ile çarpılır. güçlerin bir dizi genelinde bakliyat teslim paket ve Paketin takip eden yerinden üzerine uygulanan kuvvet arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu kuvvet-deplasman ilişkisi eğimi saç Paketin anlık sertlik (Şekil 4A) karşılık gelir.

Bu yöntem kendi sapma (Şekil 4B) 'in bir fonksiyonu olarak tek bir grubu en anlık sertliği ölçmek için izin verdi. ani kuvvet-yer değiştirme eğrisinin dinlenme konumu etrafında yaklaşık 20 nm aralığında demetin lineer olmayan bir sertlik ortaya, doğrusal olmayan bir ilişkiyi gösterir. bu kapsam dışında, saç demeti, bir Hookyen malzeme gibi, kendi sertliği büyük büyüklüğü saptırma lineer şekilde hareket eder.

Bu sonuçlar, demonstsaç hücre fizyolojisinin çalışmada bullfrog sacculus çok yönlülüğünü oranı. Bu ve diğer hazırlıkları kullanarak, bir beyne doğru paket bilgilerin iletimi birden aşamalarında mekanotransdüksiyonu keşfedebilirsiniz.

Şekil 1: Bullfrog Inner Kulak diseksiyonu. Ventral taraftan Bullfrog üst damak görüntüleme (A) Östaki borusu (daire) tanımlanmasına izin verir. Üst damak sağ tarafını kaplayan derinin yan yansıma iç kulak (kesik kutu) yerini ortaya koymaktadır. Kurbağanın temporal kemiğin ventral tarafta kıkırdak (B) Temizleme otik kapsül (kesikli çizgi) açılır. Görüntülenen (C) otik kapsül daha yüksek bir büyütme görüntü, hangi sakkuluslar, lagena, CN VIII, ve SACC içinde nitlerin sinir kolaylıkla tespit edilebilir. (D) iç kulak organların çıkarıldıktan sonra otik kapsül bir görünüm semisirküler kanalların yerleri ortaya koymaktadır. Kraniyal sinir (CN VIII) ^'inci izole iç kulak, sacculus, lagena ve VIII çıkarılmasından sonra (E) kolayca tespit edilebilir. (F) izole sakkuluslar sakküler sinir ve duyu epiteli üstünde yatan bir otolithic zarının kısa güdük sahiptir. Etiketler (ii) lagena, (iii) CN VIII (IV) 'sakküler sinir ve (v) otolithic membran (I)' in sacculus karşılık gelmektedir. Eksen P etiketler ve A posterior ve anterior yönde sırasıyla gelmektedir. Ölçek çubukları 1 cm (A, B), 1 mM (C, D, E) ve 400 um (F) ifade etmektedir.
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
s "target =" _ blank "> bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Tek Saç Hücre Deplasman-cevap Eğrisi. (A) bir cam uyaran lif ucu kinociliary saç demetinin ampul ve fiberin tabana birleştirilmiş olan, daha sonra, dokuz farklı aşamalarda arasında yer değiştirmiştir. Paketin konumu çift fotodiyot sisteminde takip edildi, ve onun reseptörü aynı zamanda, potansiyel, çıkış köprüsü modunda bir amplifikatör içinden geçirilmiş bir mikroelektrot kullanılarak ölçülmüştür. elektrot ucu direnci 95 M? ve Paketin istirahat membran potansiyeli oldu -47 mV. (B) yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak Paketin reseptör potansiyel bir arsa Paketin yanıtı ve onun arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye ortayapozisyon. Her nokta mekanik stimülasyon başlamasından sonra 2.5 ms başlayan bir 2.5 ms zaman pencere üzerinde ortalama potansiyeli ve ortalama yerinden karşılık gelir. Her renk, aynı deplasman darbesine karşılık gelen zaman serilerinin bir dizi temsil eder.
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Spontan Saç Bundle Salınım üzerinde Gentamisin Etkisi. İki odacıklı preparat bir saç demeti kendiliğinden hareket çift fotodiyot sistemi kullanılarak kaydedilmiştir. gentamisin iyontoforetik sürümü yokluğunda (0 nA) ise, saçdemet simetrik titreşimleri görüntüler. Mevcut büyüklüğü gentamisin sülfat büyür 500 mm (10 Na, 20 nA), saç demeti başka bir frekans doza bağlı bir şekilde düşer ve paket uzun için uzun kenarına doğru ofset dolu bir iyontoforetik pipet geçerken zaman dilimleri.
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Bir saç demeti en Ani Rijitliğinin hesaplanması. Sertlik K _F (A) uyaran lif (kırmızı) t bağlanıro ayrı bir saç demeti (sarı) ve (kahverengi) kinociliary ampul. Lif tabanını yerinden bilinen bir mesafe X _F X mesafesi _B taşımak için paket neden olur. Kuvvet uyaran lif, F _F paket üzerine uygulanan lif ve paketin deplasmanları arasındaki fark orantılıdır. güçlerin bir dizi genelinde bu Tekrarı anlık kuvvet-deplasman ilişkisi (sağda), eğim olan saç Paketin anlık sertlik karşılık verir. (B) Bireysel paket darbe başlangıcı (mavi noktalar) ölçüldü sonra ilk 50 ms içinde artan büyüklük ve yer değiştirme darbeleri zorlamak tabi tutuldu. Burada saç demeti dinlenme konumu etrafında yaklaşık 20 nm aralığında doğrusal olmayan bir anlık sertliğini gösterir. * Z - 60 * z * (1 / (1 + exp (- kırmızı eğri ilişkisi F = k * X bir uyum tekabül (X - X ₀₎ F paket uygulanan kuvvet olduğu / (k _B * T))) + F _0, X Paketin deplasman, k = 790 ± 51 μN m ^-1 paket en sabittir ∙ sertlik tüm kanallar kapalı ya da açık olan, z = 0.43 ± 0.04 pN tek yolluk yayının kuvveti, X ₀ = 2 ± 1.9 nm kendi kanalları% 50 açık hangi Paketin konumu, k _B Boltzmann olduğunu sabit, T sıcaklığı ve F ₀ = 11.7 ± 1.3 pN ofset güçtür. uygun 0.98 belirlenmesi bir katsayısına sahiptir. Uyarıcı lif 107 μN bir sertlik m ^-1 ∙ vardı.
Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
es / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "target =" _ blank "> bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.

çözünen	Formül Ağırlığı (g / mol)	1 L Ekle
		yapay perilenf	yapay endolymph
NaCI	58.4	6.54 g	0.117 g
KCI	0.149	0.149 g	8.62 gr
CaCl2 ⦁ 2H 2 O	147	1 M CaCI2 stokunun 2 mL	1 M CaCl2 stokunun 250 uL
HEPES	238,3	1.19 g	1.19 g
D - (+) - glukoz	180.2	0.541 g	0. 541 gr

Diseksiyon ve Deneysel Hazırlama Tablo 1. çözümler. Yapay perilenf ve diseksiyon ve tek veya iki odalı hazırlıkları kullanılan yapay endolymph çözümleri için tarifler bu tabloda alınmaz. çözeltiler pH 7.2 getirilmelidir - 7.4 NaOH (perilenf) ya da 2 mL KOH (endolymph) yaklaşık 2 mL. Ozmotik gücü yaklaşık 230 mmol okumalısınız · ^kg-1 eksik iyonik ayrışma nedeniyle.

Tartışmalar

Bullfrog en sacculus içinde birkaç bin kolayca erişilebilir duyusal saç hücrelerinin yalan. Burada tek ve iki odacıklı kayıtları için çıkarma ve sacculus hazırlanmasını göstermektedir. Bu iki hazırlıkları saç hücreleri ve bunların ilişkili demetleri hem mikromekanik ve elektrofizyolojik çalışmalar izin verir. Doku oksijenli tuz sık değiştirilmesi ile birkaç saat yaşayabilir olduğundan, deneyler uzun süreler için devam edebilir. saç demetleri Ekstraksiyon sonra 24 saat süreyle kendiliğinden salınım yaparken bu hazırlıkların içinde saç hücreleri genellikle, diseksiyon sonra 6 saat süreyle mikroelektrot kayıt için geçerli kalır.

sacculus Başarılı çıkarma ve montaj birkaç ortak zorlukları aşıp dayandırılmıştır. İlk olarak, sakküler makula apikal yüzeyi ile doğrudan temas hazırlık prosedürü boyunca kaçınılmalıdır. sakküler sinir güvenli manipu için uygun bir tanıtıcı sağlarsacculus bir yon. iç kulak organlarının geri kalan kurtulmuş sonra sakkuluslar sıvısında dalmış kalan onun duyusal epiteli mekanik zarar görmesini önlemek için ise bir büyük kalibreli pipet kullanarak transfer edilmelidir. maküler yüzeyinden otokonin çıkarılması saç hücreleri mekanik zarar vermeden tamamlanmalıdır. otokonin makula üstünde doğrudan yalan, çünkü saç hücreleri diseksiyon araçları ve otokonin sökerken otolithic membranı arasındaki kazara temas ile hasar görebilir. zarar görmemesi için, biz otokonin jelatinimsi kütle makula uzak bir yerde tutulan ve tek bir kütle olarak kaldırılmasını öneriyoruz. Bu bireysel çıkarılan olacağını her biri çok sayıda kümeler içine otoconial kütlenin parçalanmasını önler. otokonin küçük kümeler kalırsa onlar Pasteur pipeti tarafından teslim hafif sıvı basıncı ile kaldırılabilir. Son bir meydan okuma olarak sakkuluslar ve alüminyum montaj Meydanı arasında sıkı bir mühür oluşumuyla ilgilidirİki odacıklı preparat. yaklaşık 100 mikron sacculus ve çevresindeki alüminyum izinlerinin doku tam sızdırmazlık arasındaki örtüşme izin vermek için yeterince küçük bir perforasyon bir kare çalışanı. Tutkal sıkı bir mühür oluşturmak üzere, yaklaşık 100 um, maküler en çevresinde sakküler doku ile temas haline getirilmesi gerekmektedir.

Serbest Ca konsantrasyonu ²⁺ saç hücrelerinin çalışmasında önemli bir husustur. Ca ^{2 +} böylece kendiliğinden paket hareketi ^{8, 23} de dahil olmak üzere mechanotransduction aygıtının kinetik ve saç demeti aktif işlem olayların özelliklerini belirleyen, hızlı ve yavaş hem de adaptasyon düzenler. In vivo Endolenfatik kalsiyum nedenle çoğu fizyolojik ilgili kinetik bu konsantrasyonda (Maunsell JHR, R. Jacobs ve AJ Hudspeth değerlendirilir, 250 uM'de mevcuttur. Unpublished gözlemler ^16). Ancak, saç hücrelerinden mikroelektrot kayıtları mikroelektrot etrafında hücre zarının uygun sızdırmazlık için 2 mM aşan bir dış kalsiyum konsantrasyonunu gerektirir. Deneyler için, yüksek kalsiyum tuz kullanmak zorunludur. Son olarak, bir kalsiyum konsantrasyonları kullanarak çeşitli mechanotransduction üzerine harici kalsiyum etkilerini incelemek isteyebilirsiniz. Bu durumlarda, genellikle uç bağlantı rüptürü ve transdüksiyon ²⁸ geri dönüşümsüz kaybına yol 1 uM'nin altında kalsiyum konsantrasyonlarını hatırlamak önemlidir.

Burada tarif edilen iki deney preparatlar kılı hücrelerinde biyofiziksel ölçümlerin bir dizi sağlar. Bununla birlikte, ilave ölçümler bu preparatların küçük değişiklikler yapılabilir. Katlanmış sakküler hazırlanmasında, saç demetleri yanal görüntülenmiştir. Bu noktadan görüntüleme saç demeti hareket tutarlı mot ortayaHem kısa hem de uzun boylu stereocilia ²⁹ iyon. Burada sakküler makula ilk olarak alttaki dokuya ayrılır ve daha sonra, saç demetleri dışarı doğru bakar ve kırışık yanal görselleştirildiği şekilde sakküler sinir tarafından tanımlanan bir eksen boyunca katlanır. İkinci değişiklik, saç hücre ayrışma, saç hücrenin paket ve soma hem çalışma sağlar. Saç hücreleri mekanik görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt ³⁰ bir cam slayt üzerine ayrışmış bulunmaktadır. Son olarak, saç hücreleri de benzer bir ayrıştırma protokolü izlenerek, ancak, mekanik ayrıştırma aşaması olmadan epitel ekstrüde edilebilir. mekanik hasar en aza indirirken yavaş yavaş elektrofizyolojik kayıtlar için bazolateral erişim sağlayan, epitel dışarı a'ya saç hücreleri Bu tedavi sonuçları. Bu preparatlar, ve pek çok değişiklik biyofiziksel için bir model sistem olarak kurbağa sacculus çok yönlülüğü göstermektedirduyusal saç hücrelerinin çalışma.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Common to both preparations
Stereo-dissection microscope	Leica	MZ6	Other sources can be used
Tricaine methanesulfonate	Sigma	E10521	Other sources can be used
Metal pithing rod	Fine Science Tools	10140-01
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20
Glass Pasteur pipette and bulb (x2)	Fisher Scientific	22-042816
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle	Fisher Scientific	22-557-172
Dow-corning vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5C
Syringe for vacuum grease	Fisher Scientific	14-829-45	Other sources can be used
35 mm Petri dish (x2 - 3)	Fisher Scientific	08-772A	Other sources can be used
Micropipette puller	Sutter	P-97 or P-2000
120 V Solenoid puller			Home-made, see parts list
Sputter coater	Anatech USA	Hummer 6.2
Current source for iontophoresis	Axon Instruments	AxoClamp 2B	Other sources can be used
Piezoelectric actuator	Piezosystem Jena	P-150-00
Amplifier for piezoelectric actuator	Piezosystem Jena	ENV800
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1B120F-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
For one-chamber preparation
Microelectrode amplifier	Axon Instruments	AxoClamp 2B	Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously
Magnetic pins (x2)			Home-made, see parts list
Open-top chamber with magnetic sheet			Home-made, see parts list
Name	Company	Catalog Number	Comments
For two-chamber preparation
Upper chamber			Supplementary file 1
Troughed lower chamber			Supplementary file 2
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-100	Other sources can be used
Mounting block			Supplementary file 3
Wooden applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112	Other sources can be used
Teflon sheet	McMaster-Carr	8545K12	For teflon applicator
Cyanoacrylate glue	3M	1469SB
Lab tissues (Kimwipes)	Fisher Scientific	06-666A	Other sources can be used
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G1914	Other sources can be used
Quick-setting epoxy	McMaster-Carr	7605A18
18 mm glass coverslips	Fisher Scientific	12-546	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline components
NaCl	Fisher Scientific	S271-3	Other sources can be used
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G	Other sources can be used
CaCl2 • 2H2O	Fisher Scientific	10035-04-8	Other sources can be used
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	Other sources can be used
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G7021	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Parts lists for home-made equipment
Solenoid puller
Solenoid	Guardian Electric	A420-065426-00	Other sources can be used
Foot-pedal switch	Linemaster	T-51-SC36	Other sources can be used
Pipette holder	World Precision Instruments	MEH900R	Other sources can be used
Coarse manipulator	Narishige Group	MM-3	Other sources can be used
Platinum wire	Alfa Aesar	25093	Other sources can be used
Power supply	Leica	Z050-261	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Magnetic pins
Epoxy	McMaster-Carr	7556A33	Other sources can be used
1 mm thickness aluminum	McMaster-Carr	89015K45	Other sources can be used
Insect pins	Fine Science Tools	26000-40	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Open-top magnetic chamber
Flexible magnetic strip	McMaster-Carr	5759K75	Other sources can be used
1 mm thickness aluminum	McMaster-Carr	89015K45	Other sources can be used