Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Özet

G4 Resolvase1 G4-bağlama proteini için dar bildirilen afinite ile G-dörtlüsü (G4) yapılara bağlanan ve HeLa hücreleri G4-DNA ayırma aktivitesinin çoğunluğunu temsil eder. Biz özellikle, katalitik olarak aktif yeniden birleştirici G4R1 saflaştırmak için afinite ve G4 Resolvase1 ATP'ye bağımlı açma aktivitesi koşum yeni bir protokol açıklar.

Özet

Yüksek mertebeden DNA'nın yapısı hem DNA ve RNA guanin zengini bölgelerde oluşabilir G-quadruplexes (G4s, G4 yapılar) olarak adlandırılan ve son derece termal stabildir. Orada, insan genomunda> 375.000 putatif G4-oluşturucu dizileri vardır ve bunlar promoter bölümleri, çevrilmemiş bölgeleri (UTRs) 'de zenginleştirilmiştir ve telomerik tekrarlama olan. Nedeniyle bu yapıları replikasyon ve transkripsiyon gibi hücresel süreçleri etkileyecek potansiyeli, hücre onları yönetmek için enzimler gelişti. Böyle bir enzim, biyokimyasal ve laboratuar Nagamine ve arkadaşları tarafından ortaklaşa karakterize G4 resolvaz 1 (G4R1) 'dir. ve son derece sıkı bir şekilde (düşük uM aralığında _Kd) her iki G4 DNA ve G4-RNA bağlanma bulundu. G4R1 HeLa hücre lizatlarında G4 çözme aktivitesinin çoğunun nedeni bu yana telomer metabolizması, lenf geliştirme, gen transkripsiyonu, hematopoiezin ve bağışıklık takibinde rol oynadığı işaret edilmiştir. ef becerisificiently ifade ve katalitik olarak aktif G4R1 G4 yapıları ve G4-çözme enzimlerin kinetik etkileşim içine daha fazla anlamada ilgilenen laboratuarlar için önem taşımaktadır arındırmak. Burada, rekombinant G4R1 (rG4R1) saflaştırılması için ayrıntılı bir yöntemi açıklanmaktadır. anlatılan prosedür, bir C-terminali histidin etiketli enzim geleneksel afinite bazlı saflaştırma bağlanan ve bir ATP son derece aktif enzim saflaştırmak için G4 DNA gevşemeye rG4R1 yeteneğinin kullanımı ile insan kodon optimize bakterilerde ifade kapsar bağımlı elüsyon adımı. protokol, rG4R1 enzimatik aktivitesi G4 DNA gevşemeye saflaştınlmış enzim yeteneği incelenerek ölçüldüğü bir kalite kontrol adımı içerir. Bir yöntem olup saflaştırılmış rG4R1 ölçümü sağlar tanımlanmaktadır. Bu protokolün alternatif uyarlamaları tartışılır.

Giriş

G4 yapılar DNA ve RNA'nın guanin zengini bölgeler içinde formu son derece kararlı bir nükleik asit ikincil yapılardır. G4 yapılar Hoogsteen-bağlanma etkileşimleri yoluyla stabilize önemli ölçüde G4 yapıları ^{1, 2,} termal stabilitesi katkı tek değerli katyonların (örneğin. K ^+, Na ⁺⁾ merkezi boşluk içinde bağlama koordinat. Erken biyoinformatik çalışmalar insan genomu> 375000 "potansiyel G4 oluşturan motifler" ^{3, 4} içerdiğini ileri sürdü. Daha yakın tarihli bir çalışma tahminleri başka bir çalışma insan genomunda ⁶ 716.310 farklı potansiyel G4 oluşturan dizileri tahmin ederken G4 motifleri sayısı 2-5 ⁵ faktör daha yüksek olduğunu göstermektedir. G4-şekillendirme dizileri evrimsel korunmuş ve rastgele dağılmış değilGenom. G4 motifleri gen kodlama bölgelerinde zenginleştirilmiş ve tüm gen promoteri% 40 yukarı doğru G4 motifleri ⁷ içerir. İlginç bir şekilde, bir gen G4 motifleri takviye derecesinin genin fonksiyonunu önermek gösterilmiştir. Örneğin, gelişiminde rol oynayan proto-onkogenler ve genler tümör baskılayıcı genlerin ^{8, 9} den G4 yapılarının önemli ölçüde daha fazla zenginleştirme var.

yüksek termal kararlılıkları sayesinde, genom boyunca neredeyse her yerde bulunması, ve önemli ölçüde büyük hücresel süreçleri etkileme potansiyeli, hücre bu yapıları yönetmek için enzimler gelişti bulmak için şaşırtıcı değildir. , Insan (HeLa) hücreleri ¹⁰ tetramolecular G4-DNA çözülmesi aktivitesi çoğunluğunun kaynağı olarak karakterize edilen Böyle bir enzim G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) 'dir. O zamandan beri, bu gösterilmiştir that G4R1 biçimde bağlanır ve bir katalitik G4-bağlayıcı ^{protein, 11, 12, 13} sıkı bildirilen Kd ile tetramolecular ve tek moleküllü G4 DNA ve G4 RNA unwinds. Buna ek olarak, G4R1 G4-çözme aktivitesi Telomer / telomeraz biyoloji ^{11, 14, 15, 16,} transkripsiyon ve ekleme ^{17, 18, 19, 20,} geliştirme ²¹ hematopoez içeren biyokimyasal ve hücresel süreçlerin, geniş bir yelpazede implike edilmiştir ²¹ ve bağışıklık düzenleme ^{22, 23.} G4 dizilerinin bir üstünlüğü özellikle genom ve çeşitli hücresel p boyunca yer alan ileG4R1 geçenlerde ifade ve verimli bu proteinin biyokimyasal mekanizmaları ve davranışları ortaya çıkması için rG4R1 son derece önemli olacaktır son derece aktif arındırmak yeteneği ile ilgili olduğu karıştığı edildiğini rocesses.

Burada, yeni bir ifade ve verimli bir şekilde aktif enzim izole etmek rG4R1 ATP'ye bağımlı, G4-çözme aktivitesi yararlanır saflaştırma şeması (Şekil 1) göstermektedir. G4R1 olduğu gibi bu şema, enzimatik reaksiyonun ürünü artık bağlanması için bir substrat olan diğer ATP bağımlı nükleik asit enzimleri saflaştırmak için uyarlanabilir.

Protokol

G4-DNA Yapıları 1. Hazırlık rG4R1 (Biyotinile G4-DNA G-dörtlüsü Oluşturulması) Saflaştırılması Kullanılacak

1. 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3': 1 μmole-ölçekte Z33-Bio denilen şu DNA oligomer, sipariş. biyotin parçası oligomerin 3 'ucunda olduğundan emin olun.
2. 450 mM Tris-HCI pH 8, 25 mM EDTA ve 2,500 mM NaCI: 10x G4 tamponu hazırlayın.
3. su 250 uL Z33 oligomer tekrar süspansiyon (böylece oligomer konsantrasyonunun ~ 2.5 mM) olduğunu. 10x G4 tampon 25 mcL ekleyin ve karıştırın. ~ 48 saat boyunca 50 ° C 'de oligomer inkübe edin.
4. Kısaca yoğunlaşmayı (~ 1.000 xg, 10 s) toplamak için tüp aşağı doğru döndürün. Yüksek kütle ~ 50 uL ekleyin, (H ₂ O% 30 Ficoll) hidrofil polisakkarit ve karıştırın. % 10 akrilamid / 1 x TBE /% 10 gliserol jel (16 cm x 16 cm x 1 mm jeli boyutları) dökün. Jel polimerize sonra, 1x TBE ve yük kuyu yıkamaeşit Jel en boyunca oluşturulan Z33-Bio oligomeri (Örnek şeritli yükleme Schlieren hatları ile görselleştirilebilir).
   1. jel sonunda bir şeritte (bu, yapılandırılmamış bir kontrol olarak görev yapacak), 10 dakika boyunca 98 ° C'de ısıtılmış olan oligomer küçük bir bölümünü, hem de bir jel yükleme boyası bir miktar yük şerit jel tükendi ne kadar izlemek.
5. Jel Yürütme tampon 1x TBE kullanarak, boya cephesinin, jel, en azından 1/3 kadar, geçilen 120 V de jel üzerinde çalıştırıldı.
6. Bir levha koruyucusu olarak onun kaba yüzü yukarı bakacak şekilde bir ince tabaka kromatografisi plakası yerleştirin (veya plastik örtü ile kaplayın). cam plakalar birini çıkarın ve levha koruyucusu yüzeyine jel aktarın. havai ışıklar ve UV gölge jel (: 365 nm uzun dalga boyu) kapatın. taze jilet kullanın ve erimiş göreli (yavaş hareketlilik olan) jel yüksek koşarak olarak görülecektir G-dörtlüsü-Z33-Bio bant kesiped kontrolü.
7. 50 ml tüp içinde oluşturulmuş G4 DNA içeren bir jel dilimi yerleştirin ve jel dilim karşılamak için yeterli ıslatma tampon eklemek (ıslatma tamponu 1/3 hacme 10x TBE, 1/3 hacim, doymuş sodyum asetat ve 1/3 oluşmaktadır birim _H2O). 37 ° C inkübatör (nonhumidified) yerleştirilir ve / nO inkübe edin.
8. 15 ml tüp çözüm aktarın ve (10 mM Tris-HCI, pH 8, 2.5 mM EDTA pH 8 ve% 0.05 sodyum azid içinde 20 mg / mL glikojen stok) 1/10 hacim glikojen ekleyebilir ve ~ 1.2 x hacim izopropanol .
   NOT: Sodyum azid akut toksik, bu yüzden dikkatli kullanın!
   1. Karıştırın ve en azından 2 saat boyunca -20 ° C'de tüp yerleştirin. bir masaüstü santrifüj 2700 xg'de tüp spin 12 dakika boyunca 4 ° C'ye kadar soğutuldu. Yavaşça topak G4 DNA'dan çözelti süzün. % 70 ile pelet 3 kere yıkayın EtOH + 50 mM NaCl (yıkama tuz G4 istikrar için kritik öneme sahiptir). havsız kağıt mendil ile fitil uzakta aşırı sıvı.
9. yerEn az 2 saat boyunca buzdolabında yıkandı peletler hidrat ve daha kolay yeniden süspanse edilmesi için izin vermek. PLE tamponunda 50 ul pelet (10 mM Tris-HCI pH 8, 50 mM NaCl ve 0.05 mM EDTA, pH 8) yeniden süspanse edin.
10. _H2O 495 uL içine bu oluşan DNA, G-dörtlüsü 5 uL yerleştirin ve ekstinksiyon katsayısı olan (oligomerin Z33, DNA oligomeri sönüm katsayısı nükleotid bileşim girerek tespit sağlayan bir spektrofotometre kullanarak ölçmek A = 8 baz bileşimi, C = 3, Y = 15 ve T = 7) 341.946 L / mol / cm'dir. oluşan, G-dört katlı DNA 4 kolu oluşur gibi, 25 (100 değil) halinde seyreltme faktörünü girin.
11. -20 ° C'de tüp ve mağaza başına 3 ODS (OD ₂₆₀ birim) hacim eşdeğer alikotu; _H2O 495 uL ilave edildi 5 uL 3 OD ₂₆₀ okuma verir, örneğin, daha sonra 5 uL hacimde hazırlanır.

G4, DNA yapılarının 2. Hazırlık rG4R1 bir enzimatik aktivite deneyi Kullanılacak (Oluşturulması G4-DNA TAMRA etiketli)

1. 1 μmole-ölçekte Z33-TAM denilen şu DNA oligomer, Sipariş: 5 'TAMRA AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA SKK 3'. TAMRA kısmı oligomer 5 'ucunda olduğundan emin olun.
2. Bu ultraviyole (UV) gölgelendirme hariç G-dörtlüsü oluşumu için Bölüm 1'de belirtilen tetramethylrhodamine (TAMRA) G-dörtlüsü çıplak gözle kolayca görülebilir -etiketli çünkü gerekli değildir aynı prosedürü takip edin. Yine, jel üzerinde erimiş kontrolü de emin olun.
3. Aşama 1 'de olduğu gibi, TAMRA etiketli DNA, G-dörtlüsü bir spektrofotometre okuma aldıktan sonra PLE tamponunda 0.2 pmol / uL oluşturulan G-dörtlüsü seyreltin. Son olarak, -20 ° C de,% 10 nihai konsantrasyona ve mağaza gliserol ekleyin.

3. (DE3) Transform pLysS PTR ile Yetkili HücreleriEx4-DHX36 (plazmid kodlayan insan G4R1) ve / büyük bakteriyel kültürler mi yol Grow

1. TriEx4-DHX36 plazmid elde edilir.
2. 20 uL alikotları bakteri kısım ve -80 ° C'de saklayın. SOC ortamı alikosu (% 2 tripton,% 0.5 maya ekstresi, 10 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 10 mM _MgCI2, 10 mM MgSO _4, ve 20 mM glükoz) içinde 80 ° C 'de 80 uL alikotları saklayın.
3. karbenisilin (CARB) / kloramfenikol (CAM) LB-agar plakaları hazırlayın. CARB ve CAM stok konsantrasyonları 50 mg / mL _H2O ve 35 mg / EtOH, sırasıyla bu 1,000x konsantre edildi% 70 mi; Bu şekilde, LB agar seçme plakaları son konsantrasyonları, sırasıyla 50 ug / ml ve 35 ug / mL, bulunmaktadır.
4. Buz üzerinde bakteri 1 kısım yerleştirin ve oda sıcaklığında SOC ortamı 1 kısım yerleştirin. Bakteri pTriEx4-DHX36 plazmid 1 ug ekleyin ve karışımı pipet ile hafifçe karıştırılır. 42 & # bir başka sonra 5 dakika ve ısı şoku buz üzerinde inkübe176; 30 sn bekletilmiştir. 2 dakika için buz üzerine yerleştirin ve SOC ortamı ilave edin.
5. ve 37 ° CO / N inkübe - önceden ısıtılmış seçme plakaları üzerinde dönüştürülmüş bakteri plakası (Tek koloniler kolayca büyük kültürler aşılanır, böylece düşük bir koloni yoğunluğu sağlamak için, 10 ul, tipik olarak, küçük bir hacim, örneğin 5 plaka) eritin.
6. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ²⁴ Terrific suyu hazırlayın. Büyük şişesi başına 500 ml yapmak kısa bir sıvı döngüsünde ve otoklav (gliserol ekleyin emin olun).
7. çorbasına CARB / CAM (50 ug / ml / 35 ug / ml) ilave edilir ve daha sonra suyu içine bir bakteri kolonisi ve pipetleme ihtiva eden (P1000 pipet kullanarak) fişleri agar alarak kültürlerinin aşılanması. Onları havalandırmak ve ardından sallayarak olmadan 37 ° CO / N kültürlerin inkübe şiddetle kültürleri girdap.
8. Bir sonraki gün, 37 ° C bir çalkalayıcıda kültürleri yerleştirin ve ~ 225 rpm'de çalkalanır. OD ₆₀₀ kadar kültürleri büyümek yaklaşık 0.4 -İlk hücre yoğunluğuna bağlı olarak, 6 saat - tipik olarak yaklaşık 4 alacak 0.6.
   NOT: Bu spektrofotometrik okumalar yoluyla periyodik yoğunluk izleme gerektirir ve 0.5 ODS çok üzerinde kültürlerin büyümek değil önemlidir. spektrofotometrik okumaları için boş olarak, bakterilerin 1 ml aşağı spin ve kararma çözüm olarak açıklık suyu kullanın.
9. Uygun OD ₆₀₀ elde edildikten sonra hemen buz üzerine kültürleri yer ve hızlı bir şekilde 10 ° C'ye kadar soğutmak. % 70 EtOH ile temiz sildi bir termometre kullanarak sıcaklığını izlemek. Bu ileri bakteri üremesine önce rekombinant protein indüksiyon sınırlamak gibi, hızlı bir şekilde buz üzerinde iken şişeler çevirerek soğutma hızlandırın.
10. 1 mM nihai konsantrasyonda (~ 120 mg / 500 ml kültür) için IPTG ilave edin ve daha sonra ~ 17 için 14 ° C 'de 80 rpm'de sallamak - 18 saat. protein indüksiyonu için ideal sıcaklık 14 ° C olduğu tespit edilmiştir; En iyi bunu başarmak için, soğutulmuş su banyosu sarsıcı loc kullanıngeleneksel soğuk odada ated ve elle termometre ile su banyosu sıcaklığını kontrol edin.
    Not: İçinde bir termometre ile bir su şişesi inkübe edilmesi 80 rpm'de sallama ile dijital ayarlanan sıcaklık ayar istenen sıvı sıcaklığını (test, bu elde edileceğini test için gerekli olan, ancak alternatif olarak, bir hava ile soğutulan çalkalayıcı / inkübatör kullanımı bir kaç saat, 14 ° C'ye kadar buna göre ayarlayarak, dijital sıcaklık ayarlama) ulaşılır.
11. buz üzerinde kültürleri yerleştirin ve adım 3.9 gibi hızlı bir şekilde soğutmak. Bakteri küçük bir kısım alın ve bir OD ₆₀₀ okuma alır; 1.2 OD ₆₀₀ - ideal, kültürler yaklaşık 0.8 indüksiyon sırasında iki katına olacaktır.
12. 500 mL santrifüj tüplerine bakteri aktarın ve el tüpler arasındaki ağırlık eşitlemek için bakteri kültürü kullanarak dengelemek. Dengeli sonra, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3,840 x g'de santrifüj. açıklık suyu dökün ve bakteriyel PEL dondurmakProtein saflaştırma zamanına kadar -80 ° C 'de sağlar.

İnsan rG4R1 4. saflaştırılması

1. Çözülme ve Bakteri peletleri, lize.
   1. (TN tamponu 100 mM Tris pH 7.5 ve 50 mM NaCI oluşur) ilave edilmiştir TN tamponda 3 mL bakteriyel pelet çözülme. el ve çözülme girdabında şişeleri tutun / bakteriyel pelletini. Bir kez eritildi ve nispeten eşit süspansiyon (5 ml pipet ile pipetleme ile aşağı gerçekleştirilebilir fazla süspansiyon) TN tampon maddesi ile 5 mL hacim getirmek.
      NOT: arıtma işlemi ile konfor kullanıcının seviyesine bağlı olarak, hazırlık gününde 2 veya 4 ya şişe / çözülme hazırlık için tipiktir.
   2. _H2O 250 uL lizozim 20 mg çözülür (kültür başına) ve yeniden süspansiyon haline bakterilere ekleyin. elinde şişe dönen iken 10 dakika - lizozim ~ 5 bakterileri sindirmek için izin verin.
      NOT: sus rengiEmeklilik sindirim ilerledikçe biraz hafifletmek başlayacak ve süspansiyon nispeten ağdalı olmayan olacaktır. Kültürler çok büyümüş (yani daha büyük 1.2 OD ₆₀₀ hariç) ise, o zaman, bakteriyel DNA, bu aşamada, istenmeyen viskozite neden olabilir kromozomal.
   3. proteaz inhibitör kokteyli (PIC) ve löpeptin biri 10 uL kısım 250 ul. İyice karıştırın.
   4. buz üzerine yerleştirin ve soğuk TN tamponu ve 10 mL BME 22 uL ekleyin. 50 ml tüp aktarın.
   5. % 30 genlik ayarlanmış bir dijital sonikatör ile buz üzerinde bakteri ses dalgalarına maruz. ON 2 s Darbe ve 1 dakika boyunca 2 s KAPALI. Örnekler sonikasyon adımlar arasında en az 2 dakika süreyle buz üzerinde soğumaya bırakıldıktan, sonikasyon 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Birden fazla kültürleri ile sonikasyon tekrarlamalar tekrarlamadan önce sırayla her biri ses dalgalarına maruz. sonication sırasında yeterince bakteri hücresi içerisinde batık sonication ucu tutmak için dikkatli olun, ama th dokunmadan değilBu şekilde tüpün e kenarları, aşırı ısı üretecektir.
   6. Soğuk 4x SSC leupeptin PIC + 1 kısım + 20 uL BME + 50 uL eşit hacimde (15 mL) ilave et ve karıştır.
   7. Bir masaüstü santrifüj içinde 4 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş, 20 dakika boyunca 2300 x g'de santrifüj lizatları. Taze, önceden soğutulmuş 50 ml tüplere süpernatant aktarın (büyük kültür başına 1 tüp prepped edilir).
2. G4-manyetik boncuk hazırlayın.
   1. streptavidin paramanyetik boncuk 1 ml (SPB) süspansiyon (1 L başına kültür) alın ve bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. bir mıknatısla SPB pelet ve boncuk yıkanması için kullanılan aynı çözeltisi 200 uL 2 x SSC + 5 mM EDTA pH 8 tekrar süspansiyon ile yıkanmış, SPB 2x yıkayın.
   2. SPB süspansiyon G4-DNA (Bölüm 1 hazırlanan Z33-Bio G4) bir 3 OD kısım ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve hızla karıştırın. bir karıştırıcı üzerine koyun ve tüpler, en az 30 dakika (ve en fazla 60 dakika) oda sıcaklığında döndürün.
   3. kıçtaer dönme bu dönemde,% 0.4 lactalbumin 1 ml ekleyerek G4 bağlı SPB engellemek, ve gerektiği kadar buz üzerinde tutmak. 1x Tris-glisin kullanılarak% 4 laktalbümin stoktan% 0.4 lactalbumin sulandırmak.
      Not: (a / h) ilk önce 1x PIC ve% 0.05 sodyum azid daha eklenmesi ile, 2 M glisin, pH 7.5 içinde çözünmesi ile hazırlanmıştır hazır% 4 laktalbümin.
3. Bind (adım 4.1 dan devam) kobalt boncuk (CB) için rG4R1 histidin-etiketli.
   1. açıklık bakteriyel lizat içeren her 50 ml tüp (0.5 mi tanecik hacmi eşdeğeri) CB bulamacın 1 ml. bir karıştırıcı üzerine oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
      Not: 0.5 ml tanecik hacmi açıklık lizat, 1 L başına kullanılır; 500 mL'lik iki bakteri kültürleri hazırlanır, örneğin, sadece seri st CB ile aynı 0.5 mL bağlanmış olan ikinci kültürden lizat olarak, bu noktada kültürler birinden açıklık lizat içeren 50 ml tüp CB eklemeep 4.3.3).
   2. 4 ° C'de bir masaüstü santrifüj cihazında 5 dakika boyunca 110 x g'de CB Spin. dikkatle sıvı aspire ve topak haline CB rahatsız etmeyecek şekilde sıvı birkaç mL bırakın. Soğuk 4x SSC + BME 15 mL (4x SSC BME / mL 0.5 uL) - 10 ile yıkayın.
      Not: yıkama için, bunun yerine pipetleme topak kobalt boncuklar üzerine doğrudan 10-15 ml dökün pipetleme boncuklar kaybolur pipet ve protein içine takılıp kalmasına neden olur.
   3. Santrifüj yoluyla tekrar CB pelet ve sonra pellet haline CB üzerine ^(2. büyük kaynaklı bakteri kültürü temsil eden, 30 mL) aşağıdaki açıklık lizat dökün. Rotator oda sıcaklığında bir 20 dakika daha inkübe edilir ve akabinde 4x SSC + BME 10-15 mL ile iki kez yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 110 x g'de Pelet.
   4. İkinci yıkamadan sonra, sıvı aspire ve tüpün altındaki boncuk / sıvı yaklaşık 2 mL bırakın. ile önceden soğutulmuş 2 ml tüp proteine ​​bağlı CB aktarma1 ml "geniş çaplı" pipet kullanarak.
      NOT: proteine bağlı kobalt boncuk kaybını azaltacaktır bu "geniş çaplı" pipet kullanımı gibi, transferden önce ucu ucuna kesmek için yeni bir jilet kullanın.
   5. Kısaca, 4 ° C de bir mikrosantrfuj yüksek hızda (~ 18,000 xg) 2 ml tüp boncuk santrifüj (~ 5-10, hepsi bu pratik topaklama için gerekli olan). Yavaşça kaldırmak ve proteine ​​bağlı CB kaybetmemek için dikkatli olmak, pipetleme süpernatant atın.
4. CB rG4R1 Zehir.
   1. soğuk bir odada 5 dakika boyunca, bir döndürücü üzerinde histidin elüsyon tamponu (HEB) 0.5 mL CB inkübe edin. HEB eklerken Yine, sadece boncuklar üzerine 0.5 ml pipet (CB kaybı ortadan kaldırmak için) ve tüp ters çevrilerek yeniden süspanse boncuklar. HEB 0.7 M L-histidin, pH 6 (pH asetik asit ile ayarlanır) 'dir.
   2. 1 dakika için 4 ° C mikrosantrifüj 18,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant aktarınBir 15 ml tüp önceden soğutulmuş. Yavaşça çıkarın ve CB üzerine bir sıvı bırakarak, dikkatli bir pipetleme protein içeren süpernatant aktarın.
   3. Tekrar 3 HEB elüsyon toplam 4.4.1 ve 4.4.2 adımları.
   4. 0.2 M EDTA, pH 6.0 ile bir kez elüte; EDTA kobalt şelatlayarak olarak CB rengi beyaz pembe değişecektir.
   5. Dördüncü ve son yıkama 15 ml'lik bir tüpe transfer edildikten sonra, 1 ml pipet ucu ucunda bir jel yükleme ucunu kullanarak CB bakiye elüsyon tamponu pipet; borunun alt ucu daldırarak, artan protein ihtiva eden elüsyon tamponu toplanabilir.
5. G4 bağlı SPB rG4R1 bağlanan ve bir ATP-bağımlı bir şekilde yeniden birleştirici enzim Zehir.
   1. 250 mM Tris-asetat, pH 7.8, 250 mM NaCl, 2.5 mM _MgCl2 ve% 50 gliserol: 5x Res tamponu hazırlayın. 3x Res tampon hazırlayın: _H2O, 2 ml 5X Res tamponu,% 0.4 süt albümini 0.33 mL (d 0.915 mi1x Tris-glisin), BME 0.010 mL, _MgCl2 1 M 0.015 mL, PIC bölgesinin 0.050 ml ve leupeptin 0.010 mL% 4 laktalbumin arasından iluted. buz üzerinde tutun.
      Not: (a / h) ilk önce 1x PIC ve% 0.05 sodyum azid daha eklenmesi ile, 2 M glisin, pH 7.5 içinde çözünmesi ile hazırlanmıştır hazır% 4 laktalbümin.
   2. Pelet bir mıknatıs ile tüpün yanına G4 SPB ve (adım 4.2 gibi hazırlanan, G4 SPB) süpernatant atılır. karıştırmak için G4-SPB ve pipet 3x Res Tampon 1 ml ekleyin.
   3. (Aşama 4,4 eluat) protein ihtiva eden HEB / EDTA ~ 2 mL içeren 15 ml tüp içine 3x Res tampon maddesi içinde süspansiyon haline G4 SPB Bu 1 ml pipet. Boncuklar razı kalmamak arada çalkalanarak 37 ° C su banyosu içinde 15 dakika süreyle inkübe edin.
   4. Buz üzerinde, bir mıknatıs ile tüpün yanına proteine ​​bağlı G4 SPB pelet. boncuklar tekrar süspansiyon 4x SSC +% 0.4 lactalbumin (+ 0.5 mL / ml BME) ve pipet 1 ml ekleyin yıkamak için. t ile Pelet boncuko buz üzerinde mıknatıs. 2 yıkama toplam Bu yıkama tekrarlayın.
      Not: sabır manyetik boncuk her yıkama arasında topak haline getirilmesini sağlamak için yıkama işlemi sırasında gereklidir. Bunun nedeni, Res tampon içinde ihtiva gliserole çözeltinin yüksek viskozite verilen özellikle doğrudur.
   5. 3x Res Tampon 1 mL G4-SPB 1x yıkayın.
   6. 3x Res Tamponu, 0.5 mL, 0.1 M ATP 0.1 mL, H ₂ 0.4 ml O.: elüsyon tamponu (EB) hazırlanması
   7. 37 ° C olarak ayarlanmış, bir termal döngü ısıtma bloğu üzerinde dağıtılmış, 37 ° C PCR tüplerine EB öncesi sıcak 1 ml.
   8. buz üzerinde mıknatıslı Pelet G4-SPB ve önceden ısıtılmış EB 100 uL boncuk tekrar süspansiyon. Derhal bir önceden ısıtılmış PCR tüpü boncuk transferi ve 37 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca inkübe edilir.
   9. Derhal 5 M NaCl 12 uL ekleyin ve aşağı kuvvetlice 20 yukarı pipet ve - 30 kez. EB kullanılan yüksek tuz ve ATP kombineG4-boncuk gelen rG4R1 Zehir için hizmet vermektedir.
      NOT: kabarcıklar proteinin denatüre gibi bu, pipet işlemi sırasında oluşan kabarcıkların sayısını en aza indirmek için son derece önemlidir.
   10. Hemen bir mıknatıs ile G4-SPB pelet ve (tarih etiketli) buz üzerinde taze bir PCR tüpüne protein içeren eluat transfer.
   11. elüsyon ve adımları 4.5.8-4.5.10 tarif transferi Tekrar; Bu işlemin son ürünü rG4R1 saflaştınldı içeren EB böylece ~ 200 ml. yüksek ölçüde aktif rG4R1 gerçekten de saflaştırılmış olup olmadığını test eder kalite kontrol enzimatik aktivitesi tahlilinde kullanım için (uygun tarihi ile etiketlenmiş PCR tüplerine) bir kenara iki adet 7 uL alikot olarak ayarlayın.
   12. aktivitesi analiz zamanına kadar -80 ° C 'de arıtıldı rG4R1 saklayın.

Saflaştırılmış rG4R1 5. Kalite Kontrol enzimatik aktivite deneyi

1. rG4R1 her preparat test edilmesi için, 300 uL hazırlanmasıher biri 30 uL TAMRA etiketli Z33 G4 DNA 0.2 pmol içeren resolvaz deney tamponu (RAB) 'in (aşama 2'de elde edilmiştir); 3x Res Tamponu 0.1 mL, 0.2 pmol 0.01 ml / saat uL G4 Z33-TAM 0.1 M ATP 0.03 mL ve 0.16 mL ₂ O 6, PCR bir şerit aşağıdaki gibidir: RAB'ın makyaj borular, pipet tüp içine RAB 40 uL ve kalan tüplere RAB 30 uL (bu noktada buz üzerinde tüpler tutun).
2. (Aşama 4.5.11 arasında) 7 uL rG4R1 alikotları birini almak ve buz üzerine yerleştirin. 5 mcL ayarlanmış bir p20 pipet ile hafifçe yukarı pipet ve bir kaç kez aşağı 6 PCR tüpleri (RAB 40 uL içeren bir) şeridinin ilk tüp tablet ve transfer 5 uL rG4R1 karıştırın. Sonraki 10 mcL pipet ayarlayın ve seri RAB içeren Kalan PCR tüplerine 10 uL aktarın.
3. Derhal bir 4 ° C beklemeye ardından, bir termal döngü 30 dakika, 37 ° C 'de, PCR tüpleri, bu şerit inkübe edin.bunlar, 4 ° C de muhafaza edilirken tüplerin açık ve her tüp 0.5 M EDTA, pH 8, 2 ul ekle (enzimatik reaksiyonu durdurmak için).
4. % 10 akrilamid / 1 x TBE /% 10 gliserol jel dökün. tarağı çıkardıktan sonra, 1x TBE ile kuyu yıkayın. Bir yüksek kütle 5 ul ekleyin, her bir tüp, yük her tüpe 15 uL (Wells yükleme daha Schlieren hatları kullanılarak gözlemlenebilir) ila _(H2O içinde% 30 Ficoll) hidrofilik polisakarit.
   1. G4-DNA hareket için bir kontrol olarak, 4, yüksek kütle uL, 20 uL RAB hidrofilik polisakariti ve yük 15 ul ekle; çözülür monomerik Z33 için bir kontrol olarak, ısı 10 dakika için 98 ° C 'de RAB 20 uL, yüksek kütle, hidrofilik polisakarit ve yük 15 uL 4 uL ekleyin.
5. yürütülmesini tampon 1x TBE 2 saat süre ile 120 V'de jel üzerinde çalıştırıldı. Görüntü TAMRA özgü filtreleri kullanarak floresan görüntüleme yeteneğine sahip bir multimodal kamera jel (532 nm yeşil lazer ile heyecanlandırmak ve 58 kullanın0 nm bandı 30 filtre (580 BP 30)) geçmektedir.
   NOT: rG4R1 bir yüksek derecede aktif hazırlanması Şekil 2'de gösterildiği gibi, jel üzerine yüklendi ilk 3 şerit TAMRA etiketli Z33 tam çözünürlüğünü verecektir.

Son derece aktif rG4R1 Preps, aliquoting ve Depolama 6. havuzu

NOT: Bu adım 2 kişi gerekir. sayısı ve saflaştırılabilir rG4R1 şişelemeden önce gereken kaç preparasyonlar belirleyecek kullanılacak alt deneylerinin enzimatik gereksinimleri. Tipik bir büyük Preparasyon 8 derece aktif preparasyonlar (böylece 16 kaynaklı 500 mL'lik bir bakteri kültürlerinin toplam kullanılarak) birleştirilmesi oluşur, ancak bu isteğe bağlı bir sayıdır ve laboratuar özgüdür.

1. aliquoted olmaktır oldukça aktif, saflaştırılmış rG4R1 toplam hacmi hesaplayın. Tipik haliyle, 7 uL alikot alt deneylerde kullanılır. termal cycl bloğunu Dolguer şerit PCR tüpleri ile 4 ° C (blok katı doğası PCR şeritlerinin hızlı kapanmasını hızlandırmak gibi bu, içine aliquoted olacak) ayarlanır.
2. elinde tüpleri çözülme hızla -80 ° den son derece aktif rG4R1 içeren PCR tüpleri almak ve; buz az miktarda bir tüp içinde kalan zaman, buz üzerinde tüpleri. önceden soğutulmuş bir 15 ml tüp içine hızlı bir şekilde çözülmüş hazırlıklar tüm birleştirin ve kabarcıklar en aza indirmek için emin olun, iyice karıştırın.
3. otomatik tekrar pipet kullanarak, termal döngüleyici içinde önceden soğutulmuş PCR şeridi tüplere istenen kısım hacminin dağıtımı. En kısa sürede 1 olarak - 2 şerit tamamlandı, ikinci kişi kapaklarını kapatın ve (flaş dondurma enzimatik aktivite korumak için gerekli olan) sıvı nitrojen içinde yüzen 96-kuyu gofret aktarabilirsiniz var.
   NOT: Enzim 4'te olmadığını süresini azaltmak için bir seferde otomatik pipet ucu içine rG4R1 yaklaşık 200 uL fazla almayın° C.
4. termal döngüleyici içinde önceden soğutulmuş PCR şerit tüpleri alikotları ile doldurulur ve uygun bir dondurulmuş sonra, hızlı bir şekilde termal döngü buz daha fazla önceden soğutulmuş PCR şeridi tüpleri transferi ve şişelemeden devam edin. enzimin geri kalan kısmı bölünüp kadar bu şekilde devam edin, sıvı nitrojen içinde dondurulur ve kuru buz aktarılır. Son olarak, uzun süreli depolama için -80 ° kadar alikotları aktarın.

7. Niceleme Arıtılmış rG4R1 Konsantrasyon

1. Protein ayrımı için akrilamid / SDS jel çözme /% 12 istifleme standart% 5 dökün.
2. aliquoted rG4R1 yaklaşık 50 ul Çözülme, bir tüp içine birleştirmek ve iyice karıştırın. (PH 6.8,% 26.3 (a / h) gliserol,% 2.1 SDS ve% 0.02 bromofenol mavisi 65.8 mM Tris-HCI) + BME (50 uL pipetle tesisinin hacminin ölçülmesi ve 2 x Laemmli numune tamponu eşit miktarda ilave / 2x Laemmli tamponu 950 uL). 10 dakika boyunca 98 ° C'de protein denatüre.
3. 1 x örnek tamponu içinde geniş bir aralık MW belirteçlerin dilüe + BME Aşağıdaki protein miktarlarının standart olarak jel üzerine yüklendi şekildedir: 31.3, 62.5, 125, 250 ve 500 ng.
   Not: geniş aralıklı MW marker bulunan her bir protein standardı mevcut 0.1 ug / 0.3 ug / uL mevcutsa 50 kDa proteini hariç uL. Bu işaretçiler, ısıyla denatüre edilmiş olması gerekmez.
4. jel tarak çıkarın ve standart 1x SDS / glisin çalışan tamponu ile kuyu yıkayın. Yüklemek için enzimin optimum ses kullanıcı tarafından belirlenmesi gereklidir (değişir enzimatik preparasyonlar konsantrasyonu, örneğin, 35, 25 eşdeğer ve (50, burada denatürasyona uğramış protein 25 uL) rG4R1 12.5 uL yük uL Şekil 3) jel üzerine yüklendi. Adım 7.3 hazırlanan protein standartları yükleyin. pipetler düzgün kalibre emin olun ve possib gibi hassas olması emin olunpipetleme tekniği ile le doğru kantifikasyon sağlamak.
5. Boya ön yaklaşık 2/3 jel geçilen kadar 120 V jel çalıştırın (geniş menzilli MW işaretleyicileri oluşturan proteinlerin doğru ayrılmasını sağlamak için).
6. jel çıkarın ve bir jilet ile uzak keserek protein içermez jel kısmının bertaraf edin. cam güveç çanağı veya eşdeğer hazne içinde jel yerleştirin. Coomassie boyası ile jel leke (Coomassie 50 mg R-250 50:10:40 h / h metanol, 100 ml başına: asetik asit: bir kağıt filtre hunisinden süzüldü edilmiştir _H2O) O / N oda sıcaklığında orbital çalkalayıcı sette jel yeterli karışma sağlamak.
7. 30:10:60 v / v metanol ile jel De-leke: asetik asit: H ₂ O destaining hızlandırmak için balled-up, tüysüz bir kağıt mendil kullanarak. gerektiği gibi destaining çözümü değiştirin. Arka plan yeterince rG4R1 ve protein standartları görselleştirmek için düşük olana kadar lekenin devam edin; Bu tipik bir jelaşamada, Şekil 3 'de gösterilmiştir.
8. Bir levha koruyucusu arasında destained jel yerleştirin ve ≥300 dpi çözünürlükte jel tarayın. bir görüntü analizi yazılım programında taranan görüntüyü (örneğin Fuji Multiguage veya eşdeğer olarak) açın ve 75, 100 karşılık protein standartları standart eğrileri hazırlamak ve 150 kDa (eğriler dansitometrik okumalar karşısında gram tutarları ifade etmektedir). Her kulvar arka plan dansitometrik değerleri elde sürecinde sayısal varlık çıkarmak için emin olun.
9. jel üzerine yüklendi rG4R1 hacmi miktarı, bu standart eğrisinin lineer aralığı içindedir proteinin bir miktarını ihtiva varsayılırsa, rG4R1 mikrolitre başına protein gramlık miktarı tahmin edilebilir yüklendi.
10. 120.000 g / mol olan G4R1, moleküler ağırlığı kullanılarak molar miktarı içine rG4R1 ekstrapole gramlık miktarı dönüştürün.
    NOT: Her jel için, üç ekstrapole değerler olacak(75, 100 ve 150 kDa'lık standart eğrileri oluşturmak için kullanılan üç protein belirteçleri her biri için bir tane) oluşturulur. diğer iki jelleri ve leke çalıştırın ve adımları 7.1 tekrarlayarak onları ölçmek - 7.10. İlk jel miktarının sonuçları ile, kullanıcı rG4R1 Protein standartlarının doğrusal bir aralıkta bir miktarda elde etmek üzere daha da jeller üzerinde yüklendi gereken ne kadar ölçmek mümkün olur. Toplamda, son derece aktif, saflaştırılmış rG4R1 konsantrasyonunu temsil eden dokuz değerleri tahmin. 20-100 nm aralığında, tipik olarak, nihai seriye özgü rG4R1 konsantrasyonunu vermek üzere, bu değerlerin ortalamasını alın. bu değerlerden standart sapmayı hesaplamak (n = 9).

Sonuçlar

Bu protokol, (Şekil 1) düzenli olarak hemen hemen saf, katalitik olarak aktif rG4R1 verir. RG4R1 0.013 uL aralığında (Şekil yukarıda belirtilen G4 aktivitesi deneyi ile analiz edilmiş olarak, - TAMRA etiketli tetramolecular G4-DNA, 0.2 pmol 50% 0.2 olan monomerlere dönüştürülür enzim etkinliğinin bir ölçüsü olarak, tipik olarak görülmektedir 2). Saflaştırılmış rG4R1 Coomassie boyama G4 DNA boncukları bağlamak ve bir ATP-bağımlı elüte kabi...

Tartışmalar

Bu protokol, DHX36 gen ürününün, G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) (Şekil 1) izole edilmesi için son derece etkili bir ekspresyonu, saflaştırılması, ve miktar şemasını temsil etmektedir. G4-DNA-konjuge boncuk His-tag afinite kobalt afinite boncuklar üzerinde arınma ve enzimatik saflaştırma: Bu protokol, iki arıtma adımları kullanır. İkinci adım, rG4R1 G4 yapılar için vardır sıkı afinite, yüksek özgüllük ve katalitik açma faaliyeti yararlanır olduğu benzer...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (from chicken egg white)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7	Universal Scientific Supply Co.	1966	or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8			For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8			For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	or from standard source
70% Ethanol			From standard source
Magnesium chloride (1 M solution)	Life Technologies	AM9530G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptin hemisulfate	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidin paramagnetic beads	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	0718	or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6	Universal Scientific Supply Co.		From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)	Sigma-Aldrich	L5385
Cobalt metal affinity beads	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Universal Scientific Supply Co.	1667	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	or from standard source
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV lamp			Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)			Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge			Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath			For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria			For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria			For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer			capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer			From standard source
PCR strip tubes			From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene)			From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)			From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene)	Thermo Scientific	3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes			From standard source
Gel-loading tips			From standard source
Automatic repeating pipette			For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler			From standard source
Liquid Nitrogen			From standard source
Dry ice			From standard source
Laemlli sample buffer	Biorad	161-0737
Apparatus for running large slab gels	Biorad		We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet	Life Technologies	12301D	We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades			From standard source
Filter paper and funnel			From standard source
Glass casserole dish			From standard source
Orbital shaker			From standard source
Kimwipes			From standard source
Clear sheet protectors			From standard source
Scanner and associated TWAIN software			From standard source
Image analysis software			Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel			Or equivalent