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요약

G4 Resolvase1는 G4 결합 단백질에 대한 소감보고 된 친화 G-quadruplex (G4) 구조에 결합 HeLa 세포에서 G4-DNA 풀기 활동의 대부분을 나타냅니다. 우리는 특히 촉매 활성 재조합 G4R1를 정화 친 화성 및 G4-Resolvase1의 ATP 의존 풀기 활동을 마구를 채우는 새로운 프로토콜을 설명합니다.

초록

고차 핵산 구조는 모두 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역에서 형성 할 수있는 G-quadruplexes (G4를, G4 구조)라는 높은 열적으로 안정하다. 이 인간 게놈에> 375,000 추정 G4 형성 서열이 있고, 그들은 프로모터 영역, 번역되지 않은 지역 (UTRs)에 충실하고, 텔로미어 반복 내에서. 때문에 이러한 구조는 복제 및 전사와 같은 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이있는 경우에, 셀들을 관리하는 효소를 진화했다. 하나의 효소는 생화학 실험실 및 나가미네 등에 의해 공동으로 특징이었다 G4 Resolvase 1 (G4R1)입니다. 매우 긴밀하게 (낮은 오후 범위에서 K d 개) 모두 G4-DNA와 G4-RNA에 결합하는 것으로. G4R1는 헬라 세포 용 해물에서 G4-해결 활동의 대부분의 원인과 이후 텔로미어 대사, 림프 개발, 유전자 전사, 조혈 및 면역 감시의 역할을 내포하고있다. EF 할 수있는 능력분히 표현하고 촉매 활성 G4R1는 G4의 구조와 G4-해결 효소의 운동의 상호 작용에 더 통찰력을 얻기에 관심이 실험실을 위해 중요하다 정화. 여기, 우리는 재조합 G4R1 (rG4R1)의 정제에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 설명 된 절차는 C- 말단 히스티딘 표지 된 효소의 전통적인 선호도 기반 정제 바인딩 및 ATP- 고도로 활성 효소를 정제 G4-DNA를 긴장을 rG4R1 능력의 이용 인간 코돈 최적화 된 세균의 발현 포함 종속 용출 단계. 프로토콜은 또한 rG4R1의 효소 활성 G4-DNA를 푸는 정제 효소의 능력을 조사하여 측정하는 품질 관리 단계를 포함한다. 방법도 정제 rG4R1의 정량화를 허용 것이 기재되어있다. 이 프로토콜의 대체 적응이 논의된다.

서문

G4 구조는 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역 내에 형성 안정성이 높은 핵산 차 구조이다. G4 구조 훅 스틴 - 결합 상호 작용을 통해 안정화 크게 G4 구조 (1, 2)의 주목할만한 열적 안정성에 기여하는 가의 양이온 (예. K +와 + 나)와 중앙 공동 내에 결합을 조정한다. 초기 생물 정보학 연구는 인간 게놈> 375,000 "잠재적 인 G4 형성 모티브"3, 4 포함하는 것이 좋습니다. 최근의 연구 평가는 다른 연구는 인간 게놈 6 716310 별개의 잠재적 인 G4 형성 순서를 예측하면서 G4 주제의 수는 2-5 5 배 정도 높은 것이 좋습니다. G4는-형성하는 서열은 진화 적으로 보존 무작위로 분산되지 않습니다게놈. G4 주제는 유전자의 코딩 지역에서 농축되고, 모든 유전자 프로모터의 40 %의 위쪽으로는 G4 모티브 (7)를 포함한다. 흥미롭게도, 유전자의 G4 모티프의 농축 정도는 유전자의 기능을 제시하는 것으로 입증되었다. 예를 들면, 현상에 관여하는 프로토 - 암 유전자 및 유전자는 종양 억제 유전자 8,9보다 G4 구조 훨씬 더 농축있다.

높은 열 안정성으로 게놈 전체에서 거의 어디에나 존재 상당히 중요한 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이, 상기 셀은 이러한 구조를 관리하기 위해 효소를 진화 것을 발견 놀랍지이다. 우리는 인간 (헬라) 세포 10 tetramolecular G4-DNA 해결 활동의 대부분의 소스로 특징으로 하나의 효소는 G4 Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1)입니다. 그 이후로,이 표시되어 그쪽으로t G4R1 단단히 바인딩 및 촉매 G4 결합 단백질 11, 12, 13에 대한 엄격한보고 된 KDS와 tetramolecular 및 단 분자 G4-DNA와 G4-RNA가 풀릴. 또한 G4R1의 G4 분해하는 활성 텔로미어 / 텔로 머라 생물학 11, 14, 15, 16, 전사 및 접합 17, 18, 19, 20, 개발 21 조혈 포함 생화학 및 세포 과정의 다양한 연루되었는지 (21), 및 면역 조절 22, 23. G4 시퀀스의 우세는 특히 게놈 및 다양한 휴대 페이지에 걸쳐 위치하고로G4R1 최근 표현 효율적이 단백질의 생화학 적 메커니즘과 동작을 밝히기 위해 rG4R1가 매우 중요 할 것이다 활성이 높은 정화 능력에 관여하는 연루되었는지 rocesses.

여기서 우리는 새로운 표현하고 효율적으로 활성 효소를 분리 rG4R1의 ATP 의존, G4-해결 활동을 활용 정화 방식 (그림 1)를 보여줍니다. G4R1 대한 경우와 같이,이 방식은, 효소 반응의 생성물은 더 이상 바인딩 기재되는 다른 ATP 의존성 핵산 효소를 정제하도록 채택 될 수있다.

프로토콜

G4-DNA 구조 1. 준비 rG4R1 (바이오틴 G4-DNA G-Quadruplex의 형성)의 정제에 사용되는

  1. 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 비오틴 3': 1 μmole 규모의 Z33-바이오라는 다음 DNA 올리고머를 주문. 비오틴 부분이 올리고머의 3 '말단에 있는지 확인합니다.
  2. 450 mM 트리스 - 염산 pH를 8, 25 mM의 EDTA, 2,500 밀리미터의 NaCl : 10 배 G4 버퍼를 준비합니다.
  3. 물 250 μL에 Z33 올리고머를 재현 탁 (도록 올리고머 농도는 ~ 2.5 mm 인 경우). 10 배 G4 버퍼의 25 μL를 추가하고 혼합한다. ~ 48 시간 동안 50 ℃에서 인큐베이션 올리고머.
  4. 짧게 응축 (~ 1000 XG, 10 초)을 수집 튜브를 스핀 다운. 높은 질량 ~ 50 μL를 추가, (H 2 O의 30 % 피콜) 친수성 폴리 사카 라이드와 섞는다. 10 % 아크릴 아미드 / 1X를 TBE / 10 % 글리세롤 겔 (: 16cm X 16cm X 1mm 겔 치수)를 붓는다. 겔 중합되면, 1 배 TBE 및 부하와 우물을 씻어균등 겔의 대부분에 걸쳐 형성 Z33-바이오 올리고머 (샘플 레인 로딩은 슐 리렌 선으로 시각화 할 수 있습니다.)
    1. 겔의 끝에서 하나의 레인 (이 구조화 제어 될 것)을 10 분 동안 98 ° C로 가열 된 올리고머의 작은 부분뿐만 아니라, 또 다른 겔 로딩 염료를 소량 적재 레인 젤이 실행 방법까지 모니터링 할 수 있습니다.
  5. 겔 실행 버퍼 1X TBE를 사용하여 염료 전면이 겔의 적어도 1/3 통과 할 때까지 120 V에서 젤을 실행합니다.
  6. 시트 보호에서의 거친면이 위로와 박층 크로마토 그래피 판 배치 (또는 플라스틱 포장으로 덮고). 유리판을 제거하고, 시트 보호기의 표면에 겔 옮긴다. 오버 헤드 조명과 UV 그림자 겔 (: 365 nm의 장파장)을 끕니다. 신선한 면도날을 사용하여 용탕에 대하여 (느린 이동성을 갖는) 겔에서 더 높은 최대 실행으로 간주되는 G-quadruplex-Z33 바이오 밴드를 잘라에드 제어 할 수 있습니다.
  7. 50 ㎖의 튜브에 형성 G4-DNA를 함유하는 겔 슬라이스를 넣고 젤 슬라이스를 덮도록 충분히 침지 완충액 추가 (침지 완충액 1/3 부피 배 TBE, 1/3 부피 포화 소듐 아세테이트 및 1/3 이루어져 볼륨 H 2 O). 37 ° C 배양기 (nonhumidified)에 튜브를 삽입하고 / N을 O를 품어.
  8. 15 ㎖의 튜브에 용액을 옮기고 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 8, 2.5 mM의 EDTA pH를 8 및 0.05 % 아 지드 화 나트륨 20 ㎎ / ㎖에서 글리코겐 주식) 1/10 부피 글리코겐을 추가 ~ 1.2 배 부피의 이소프로판올 .
    참고 : 아 지드 화 나트륨은 급성 독성이 있으므로주의해서 사용!
    1. 믹스 적어도 2 시간 동안 -20 ° C에서 튜브를 배치합니다. 탁상 원심 분리기에서 2,700 XG에서 튜브를 스핀은 12 분 동안 4 ° C로 냉각. 조심스럽게 펠렛 G4-DNA의 솔루션을 가만히 따르다. 70 %와 펠렛을 3 회 반복의 EtOH + 50 mM의 염화나트륨 (세척의 소금은 G4의 안정을 위해 중요하다). 보풀이없는 휴지 심지 멀리 초과 액체.
  9. 장소적어도 2 시간 동안 냉장고에 세척 된 펠릿은 펠릿 수분을 쉽게 재현 탁을 허용한다. TNE 완충액 50 μL의 펠렛 (10 mM 트리스 - 염산 pH를 8의 50 mM의 NaCl, 0.05 mM의 EDTA pH를 8)에 재현 탁.
  10. H 2 O 495 μL로이 형성된 DNA G-quadruplex 5 μL를 넣고 흡광 계수가 함께 (올리고머의 Z33 DNA 올리고머의 흡광 계수 뉴클레오티드 조성물을 입력하여 측정 할 수있는 분광 광도계를 사용하여 정량 A = 8의 기본 구성, C = 3, G = 15, 및 T = 7) 341,946 L / 몰 / cm이다. 형성된 G-quadruplex는 DNA의 4 가닥으로 구성으로, 25 (안 100)로 희석 계수를 입력합니다.
  11. -20 ° C에서 튜브 및 매장 당 3 ODS (OD 260 단위)의 볼륨 상당을 나누어지는; H 2 O의 495 μL 가하고 5 μL 3 OD 260의 판독을 제공하는 경우, 예를 들어, 5 μL의 분취 량을 준비한다.

G4-DNA 구조 2. rG4R1 제제의 효소 활성 분석에서 사용되는 (G4의 형성 TAMRA-DNA 라벨링)

  1. 1 μmole 규모에 Z33-TAM이라는 다음 DNA 올리고머를, 주문 : 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. TAMRA 부분이 올리고머의 5 '말단에 있는지 확인합니다.
  2. 그 자외선 (UV) 그림자를 제외하고 G-quadruplex의 형성을위한 제 1 절에 설명 된 테트라 메틸 (TAMRA)는 G-quadruplex는 육안으로 쉽게 볼 수 있습니다 - 표지 때문에 필요가 없습니다와 같은 절차를 따르십시오. 다시, 젤에 용융 컨트롤을 포함해야합니다.
  3. 단계 1에서와 같이, TAMRA 표지 DNA G-quadruplex의 분광 광도계 판독 복용 후 TNE 완충액으로 0.2 pmol의 / μL로 형성된 G-quadruplex 희석. 마지막으로, -20 ° C에서 10 %의 최종 농도 및 저장에 글리세롤을 추가합니다.

3. (DE3)를 변환 pLysS를 PTR와 관할 세포iEx4-DHX36 (플라스미드 인코딩 인간 G4R1) 및 / 대형 세균 배양을 유도 성장

  1. TriEx4-DHX36 플라스미드를 얻습니다.
  2. 20 μL 씩에 박테리아를 나누어지는 및 -80 ° C에 저장합니다. 온칩 매체 나누어지는 (2 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 10 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을 10 mM의의 MgCl 2, 10mM의 황산, 20 mM의 글루코스) -80 ° C에서 80 μL의 분취 량으로 저장.
  3. 카르 베니 실린 (CARB) / 클로람페니콜 (CAM) LB 한천 플레이트를 준비합니다. CARB 및 CAM 스톡의 농도가 50 ㎎ / ㎖의 H 2 O 35 밀리그램 / EtOH를 각각, 이들은 1000 배 농축되어 70 %의 용액; 따라서, LB 아가 플레이트 선택의 최종 농도가 각각 50 μg의 / ㎖, 35 μg의 / ㎖이다.
  4. 얼음에 박테리아의 1 나누어지는을 놓고 실온에서 SOC 매체의 1 나누어 놓습니다. 박테리아에 pTriEx4-DHX36 플라스미드의 1 μg의 추가와 혼합하는 피펫 팁으로 부드럽게 소용돌이 친다. # 42에 추가 한 후, 5 분 및 열충격 얼음 위에서 인큐베이션(176) 30 초 동안 C. 2 분 동안 얼음에 놓고 SOC 매체를 추가 할 수 있습니다.
  5. 37 ° CO / N 부화 - 데워진 선발 플레이트 상에 형질 전환 된 박테리아를 강판 (단일 콜로니 쉽게 대규모 배양에 접종 될 수 있도록 낮은 집단 밀도를 보장하기 위해, 10 μL 전형적으로 소량의, 예컨대 5 판금).
  6. 제조업체의 지침 (24)에 따라 좋아요 국물을 준비합니다. 큰 플라스크 500 mL로 짧은 액체 사이클과 오토 클레이브 (글리세롤을 추가해야합니다).
  7. 국물에 CARB / CAM (50 μg의 / ㎖ / 35 μg의 / ㎖)을 추가 한 다음 국물에 하나의 세균 식민지와 피펫을 포함 (A P1000 피펫을 사용하여) 플러그 한천 취함으로써 문화를 접종. 를 통기하고 흔들림없이 37 ° CO / N의 문화를 배양하기 위해 적극적으로 문화를 소용돌이 친다.
  8. 다음 날, 37 °의 C 통에 문화를 배치하고 ~ 225 rpm으로 흔들. 외경 (600)까지 문화 성장은 약 0.4이다 -초기 세포 밀도에 따라 6 시간 - 일반적으로 약 4 걸릴 것 0.6.
    참고 :이 분광 측정을 통해주기적인 농도 모니터링을 필요로하고, 0.5 ODS보다 훨씬에 문화를 성장하지하는 것이 중요합니다. 분광 측정을위한 빈으로 박테리아의 1 mL로 스핀 다운 및 블랭킹 솔루션으로 명확히 국물을 사용합니다.
  9. 적절한 OD (600)가 얻어지면, 바로 얼음에 배양액을 넣고 빠르게 10 °의 C로 냉각. 70 % EtOH로 깨끗이 닦아 온도계를 사용하여 온도를 모니터링합니다. 이 또한 박테리아의 성장 이전에 재조합 단백질의 유도에 제한되므로, 빨리 얼음 동안 플라스크를 회전시켜 냉각을 촉진.
  10. 1 mM의 최종 농도 (~ 120 밀리그램 / 500 mL의 문화)에 IPTG를 추가 한 다음 ~ 17 14 ° C에서 80 rpm으로 흔들어 - 18 시간. 단백질 유도를위한 이상적인 온도는 14 ° C 것으로 밝혀졌다; 가장이를 위해 냉각 수조 쉐이커 LOC를 사용종래 냉장실에 ated 수동 온도계 수조의 온도를 확인한다.
    참고 : 그것의 온도계 물 술병을 배양하고 80 rpm으로 흔들어 디지털 설정 온도 설정이 원하는 액체 온도 (시험이를 얻을 것입니다 무엇을 테스트 할 필요가 있지만 또한, 공기 냉각 통 / 인큐베이터를 사용 몇 시간 동안, 14 ° C까지 따라 설정 디지털 온도를 조절하는)에 도달한다.
  11. 얼음에 문화를 놓고 단계 3.9에서와 같이 신속하게 냉각. 박테리아의 작은 나누어지는을하고 OD 600 독서를 취할; 1.2 OD 600 - 이상적으로, 문화는 약 0.8로 유도하는 동안 두 배로됩니다.
  12. 500 ㎖ 원심 분리 튜브로 이동 박테리아 수동 튜브의 중량 심지어 세균의 배양을 사용하여 균형. 균형 잡힌 후, 4 ℃에서 20 분 동안 3,840 XG에 그들을 원심 분리기. 정화 된 국물을 붓고 세균 화소 동결단백질 정제시까지 -80 ° C에 있습니다.

인간 rG4R1 4. 정제

  1. 해동 및 세균 펠릿을 용균.
    1. (TN 버퍼가 100 mM 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 염화나트륨으로 구성) RT에서 TN 버퍼의 3 ㎖의 세균 펠렛을 해동. 손과 해동하는 소용돌이의 병을 잡고 / 박테리아 펠렛을 재현 탁. 일단 해동 비교적 고르게 정지 (5 mL를 피펫와 피펫 팅을 통해하고 아래로 수행 할 수 있습니다 더 서스펜션) TN 버퍼 5 mL의 최대 볼륨을 가지고.
      참고 : 그것은 정제 절차에 편안한 사용자의 수준에 따라 준비의 날에 2 또는 4 중 병 / 해동 준비하는 전형이다.
    2. H 2 O의 250 μL에 리소자임 20 mg의 용해 (문화 당)과 재 부유 세균에 추가 할 수 있습니다. 손에 병을 소용돌이 치는 동안 10 분 - 리소자임은 ~ 5 박테리아를 소화 할 수 있습니다.
      참고 : SUS의 색상연금은 소화가 진행됨에 따라 약간 밝게 시작하고, 서스펜션은 상대적으로 비 점성이 될 것입니다. 문화가 너무 자란 (즉, 더 큰 1.2 OD 600 이하) 인 경우에, 박테리아 DNA는이 단계에서 원치 않는 점도를 야기 할 수 염색체.
    3. 프로테아제 억제제 칵테일 (PIC)과 류 펩틴의 한 10 μL 나누어지는 250 μL를 추가합니다. 철저하게 섞는다.
    4. 얼음에 놓고 차가운 TN 버퍼의 10 mL의 BME의 22 μL를 추가합니다. 50 ㎖의 튜브에 전송합니다.
    5. 30 % 진폭로 설정 디지털 초음파 처리기와 얼음에 박테리아를 초음파 처리. ON 2 초에서 펄스 1 분 2 초 OFF. 샘플을 초음파 처리 단계 사이에 적어도 2 분 동안 얼음에 방냉 상기 초음파을 3 회 반복한다.
      참고 : 여러 문화로, 초음파의 반복을 반복하기 전에 차례로 각 하나를 초음파 처리. 초음파 동안 충분히 박테리아 해물에 빠져들 초음파 팁을 유지하기 위해주의해야하지만, 일을 터치하지이 같은 튜브의 전자 측이 과도한 열을 생성합니다.
    6. 추운 4 배 SSC 류 펩틴의 PIC + 1 분취의 + 20 μL BME + 50 μL의 동일한 볼륨 (15 ml)에 추가하고 혼합한다.
    7. 탁상 원심 분리기에서 4 ° C에 미리 냉각, 20 분 동안 2,300 XG에 해물을 원심 분리기. 신선한, 미리 냉각 된 50ml 튜브에 뜨는을 전송 (대형 문화 당 1 관은 수험 공부를하게되는).
  2. G4-자기 구슬을 준비합니다.
    1. 스트렙 타비 딘의 상자성 비드 1 ㎖ (SPB) 서스펜션 (1 L 당 문화)를 가지고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. 자석과 SPB 펠렛과 구슬을 세척에 사용 된 것과 같은 용액 200 μL에 2 배 SSC + 5 mM의 EDTA pH가 8을 Resuspend로 세척 SPB를 2 배 씻는다.
    2. SPB 서스펜션에 G4-DNA (섹션 1에서 제조 한 Z33-바이오 G4) 중 하나 3 OD 나누어지는을 추가하고 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 신속하게 혼합한다. 회 전자에 튜브를 삽입하고 적어도 30 분 (최대 60 분) 동안 실온에서 회전 할 수 있습니다.
    3. 선미ER 회전이 기간은 0.4 % 락트 알부민 1 ㎖를 첨가하여 G4 바인딩 SPB를 차단하고, 필요할 때까지 얼음 상에 유지한다. 1X 트리스 글리신을 사용하여 4 % 락트 알부민 재고의 0.4 % 락트 알부민을 희석.
      주 : (V / W) 초기 1X PIC 및 0.05 % 아 지드 화 나트륨의 추가 첨가하여, 2 M 글리신 pH가 7.5에 용해시켜 제조 주식 4 % 락트 알부민.
  3. 바인딩 (단계 4.1에서 계속) 코발트 구슬 (CB)에 rG4R1를 히스티딘은-태그.
    1. 명확히 세균 분해물을 포함하는 각 50ml의 튜브 (0.5 ML의 비드 볼륨에 해당) CB 슬러리의 1 ML을 추가합니다. 회 전자에 실온에서 20 분 동안 품어.
      주 : 0.5ml를 비드 부피 명확히 분해물 1 L 당 사용된다; 두 500 ㎖의 세균 배양 물을 제조하는 경우 예를 들면, 전용 직렬 세인트 CB 같은 0.5 mL로 결합되는 제 문화 분해물로서,이 시점에서 배양 중 하나에서 명확 분해물을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 CB 추가EP 4.3.3).
    2. 4 ° C 탁상 원심 분리기에서 5 분 동안 110 XG에 CB를 스핀 다운. 조심스럽게 액체를 대기음, 그리고 펠렛 CB를 방해하지 않도록 액체 몇 mL로 둡니다. 차가운 배 SSC + BME의 15 ㎖ (4 배 SSC의 BME / mL의 0.5 μL) - 10 씻으십시오.
      참고 : 세척를 들어, 대신 피펫의 펠렛 코발트 구슬에 직접 10 ~ 15 mL를 부어 피펫으로 구슬을 잃게됩니다 피펫과 단백질의 내부에 박히하게됩니다.
    3. 원심 분리를 통해 다시 CB 펠렛 후 펠렛 CB에 (2 차 대형 유발 박테리아 문화를 대표하는 30 ㎖)을 다음 명확히 해물을 붓는다. 회 전자에 실온에서 추가로 20 분 동안 품어하고 배 SSC + BME의 10 ~ 15 mL로 두 번 씻는다. 4 ℃에서 5 분 동안 110 XG에 펠렛.
    4. 두번째 세척 한 후, 액체를 흡인 튜브의 하단에 비즈 / 액체는 약 2 mL로 떠난다. 하여 예비 냉각 2 ㎖의 튜브에 단백질 - 결합 CB 전송1 mL의 "넓은 구멍"피펫 팁을 사용.
      주 : 단백질 결합 코발트 비드의 손실을 줄일이 "와이드 보어"피펫 팁의 사용과 같이 전송 이전에 팁의 단부를 절단하는 새로운 면도날을 사용한다.
    5. 간단히 4 ° C에서의 microcentrifuge에서 높은 속도 (~ 18,000 XG)에서 2 ㎖의 튜브에 구슬을 원심 분리하면 (~ 5-10의 모든 것을 빠른 펠렛을 위해 필요하다). 조심스럽게 제거하고 단백질 결합 CB를 잃지주의하면서 피펫으로 상층 액을 버린다.
  4. CB에서 rG4R1을 용출.
    1. 추운 방에서 5 분 동안 회 전자에 히스티딘 용출 버퍼 (HEB)의 0.5 mL의에서 CB를 품어. HEB를 추가 할 때 다시, 그냥 구슬 상에 0.5 mL로 피펫 (CB 손실을 제거하기 위해) 및 튜브를 반전 구슬을 재현 탁. HEB 0.7 M L 히스티딘 6 산도 (pH를 아세트산을 사용하여 조정된다)이다.
    2. 1 분 동안 4 ° C 형의 microcentrifuge에서 18,000 XG에 원심 분리기. 뜨는을 전송(A)에 15 ㎖의 튜브를 미리 냉각시켰다. 조심스럽게 제거하고, CB 위에 소량의 액체를 남겨주의 피펫으로 단백질 함유 상등액을 옮긴다.
    3. 반복 3 HEB의 용리 총 4.4.1와 4.4.2 단계를 반복합니다.
    4. 0.2 M EDTA pH가 6.0 번 용출; EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)는 코발트 킬레이트로 CB의 색상은 흰색에 분홍색 변경됩니다.
    5. 제 4 및 최종 용출은 15 ㎖의 튜브에 전사 된 후, 1 ㎖의 피펫 팁 끝에 겔 로딩 팁을 사용하여 CB에서 잔류 용출 완충액 피펫; 튜브의 바닥 끝 급락하여, 잔여 단백질을 함유하는 용출 완충액을 회수 할 수있다.
  5. G4 결합 된 SPB에 rG4R1 바인딩 및 ATP 의존적으로 재조합 효소를 용출.
    1. 250 mM 트리스 - 아세테이트의 pH 7.8, 250 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 MgCl 2, 50 % 글리세롤 : 5 배 해상도 버퍼를 준비합니다. 배 해상도 버퍼를 준비 : H 2 O, 2 mL의 5 배의 해상도 버퍼, 0.4 % 락트 알부민 0.33 ㎖ (D의 0.915 mL의1X 트리스 글리신), BME의 0.010 ㎖,의 MgCl 2 1 M의 0.015 ㎖, PIC의 0.050 mL를 류 펩틴의 0.010 mL를 4 % 락트 알부민에서 iluted. 얼음에 보관하십시오.
      주 : (V / W) 초기 1X PIC 및 0.05 % 아 지드 화 나트륨의 추가 첨가하여, 2 M 글리신 pH가 7.5에 용해시켜 제조 주식 4 % 락트 알부민.
    2. 펠렛의 자석과 튜브의 측면에 G4-SPB과 (4.2 단계에서 제조 된, G4-SPB) 상층 액을 버린다. 혼합하는 G4-SPB 및 피펫으로 배 해상도 버퍼의 1 ML을 추가합니다.
    3. (단계 4.4에서 용출) 단백질 함유 HEB / EDTA를의 ~ 2 mL로 포함 된 15 mL의 튜브에 3 배 해상도 버퍼에 현탁 G4-SPB이 1 mL를 피펫. 구슬이 정착하지 않도록 가끔 교반하면서 37 ℃로 물을 욕조에 15 분 동안 품어.
    4. 얼음 자석과 튜브의 측면에 단백질 - 결합 G4-SPB 펠렛. 구슬을 재현 탁하는 배 SSC + 0.4 % 락트 알부민 (+ 0.5 μL / mL의 BME)과 피펫 1 mL를 넣어 세척합니다. t와 펠렛의 구슬그 얼음 마그넷. 이 세척의 총이 세차를 반복합니다.
      참고 : 인내는 자기 구슬을 모두 세척 사이 펠렛되었는지 확인하기 위해 세척 과정에서 필요합니다. 이는 입술 버퍼에 포함 된 글리세롤 용액의 점도가 증가 주어진 특히 그러하다.
    5. 배 해상도 버퍼 1 mL로 G4-SPB 1 배를 씻으십시오.
    6. 배 해상도 완충액 0.5 ㎖, 0.1 M ATP, 0.1 ㎖, 및 H (2)의 0.4 mL의 O. : 용출 완충액 (EB)를 준비
    7. 37 ° C로 설정 열 자전거 타는 사람의 가열 블록에 분산 37 ° C PCR의 튜브에 EB의 사전 따뜻한 1 mL를.
    8. 얼음에 자석 펠렛 G4-SPB과 미리 예열 EB 100 μL의 비드를 재현 탁. 즉시 예열 된 PCR 튜브에 비드를 전송하고, 37 ℃에서 30 초 동안 배양한다.
    9. 즉시 5 M NaCl을 12 μL를 추가하고 아래로 격렬하게 20까지 피펫과 - 30 회. 상기 EB에 포함 된 높은 소금 ATP의 결합G4의 구슬에서 rG4R1을 용출하는 역할을한다.
      주 : 기포가 단백질을 변성 수있는대로, 피펫 팅 공정 동안 형성된 버블의 수를 최소화하는 것이 매우 중요하다.
    10. 즉시 자석과 G4-SPB 펠렛과 (날짜로 표시) 얼음에 신선한 PCR 튜브에 단백질 함유 용출액을 전송합니다.
    11. 용출 및 단계 4.5.8-4.5.10을에 기술 이전을 반복; 본 공정의 최종 생성물은 정제 rG4R1 함유 EB의 이와 ~ 200 μL이다. 고 활성 rG4R1 참으로 정제되었는지 여부를 테스트합니다 품질 제어 효소 활성 분석에 사용 (해당 날짜가 표시된 PCR 튜브에) 옆이 7 μL 씩을 설정합니다.
    12. 활동 분석시까지 -80 ° C에서 정제 rG4R1를 저장합니다.

정제 된 rG4R1 5. 품질 관리 효소 활동 분석

  1. rG4R1 각각 준비가 분석 할 경우, 300 μL를 준비각 30 μL를 TAMRA 표지 Z33의 G4-DNA 0.2 pmol의 포함되어 resolvase 세이 버퍼 (RAB)의 (단계 2에서 제조 됨); 배 해상도 버퍼의 0.1 mL의 0.2 pmol의 0.01 ㎖ / H의 μL G4-Z33-TAM, 0.1 M ATP 0.03 ㎖, 0.16 mL의 2 O. 6 PCR의 스트립에서 다음과 같이 RAB의 구성은 튜브 피펫 제 튜브에 RAB 40 μL 남은 튜브에 RAB 30 μL (이때 얼음 튜브를 유지).
  2. (단계 4.5.11)에서 7 μL rG4R1 씩 중 하나를 검색하고 얼음에 놓습니다. 5 μL로 설정 P20 피펫으로 부드럽게 피펫과 몇 번 아래로 6 PCR 튜브 (RAB의 40 μL를 포함하는 하나)의 스트립의 제 1 튜브로 나누어지는 및 전송에 5 μL를 rG4R1를 혼합 할 수 있습니다. 다음에, 10 μL 피펫을 설정 직렬 RAB를 포함하는 나머지 PCR 튜브에 10 μL 옮긴다.
  3. 즉시 4 ℃로 유지 한 다음 열 순환기에서 30 분, 37 ° C에서 PCR 튜브이 스트립을 배양한다.그들은 4 ° C에서 개최되는 동안 튜브를 열고 각 튜브에 0.5 M EDTA pH를 8의 2 μL를 추가 (효소 반응을 정지합니다).
  4. 10 % 아크릴 아미드 / 1X TBE / 10 % 글리세롤 겔을 붓고. 빗를 제거한 후, 1 배 TBE로 우물을 씻는다. 높은 질량의 5 μL를 추가, 각 튜브 및 부하 각 관에서 15 μL (우물의로드가 다시 슐 리렌 라인을 사용하여 관찰 할 수있다)에 (H 2 O의 30 % 피콜) 친수성 폴리 사카 라이드.
    1. G4-DNA의 이동에 대한 제어로, 4 높은 질량의 μL, 20 μL의 RAB에 친수성 폴리 사카 라이드, 및 부하 15 μL를 추가; 풀린 단량체 Z33에 대한 제어로, 열을 10 분 동안 98 ° C에서 RAB의 20 μL, 높은 질량, 친수성 폴리 사카 라이드, 부하 15 μL의 4 μL를 추가합니다.
  5. 실행 버퍼로 1 배 TBE 2 시간 동안 120 V에서 젤을 실행합니다. 이미지 TAMRA 특정 필터를 사용하여 형광 이미징 기능이있는 복합 이미 저에 겔의 (a 532 nm의 녹색 레이저로 자극과 58을 사용0 nm의 밴드 (30) 필터 (580 BP 30))를 전달합니다.
    주 : rG4R1의 고 활성 제제는도 2에 도시 된 바와 같이, 겔에 로딩 된 제 3 차선 TAMRA 표지 Z33의 전체 해상도를 산출 할 것이다.

고 활성 rG4R1 최상의 상태로 준비, 분취, 및 저장 6. 풀링

참고 :이 단계는 이명이 필요합니다. 수 및 정제 rG4R1은 분취 전에 필요한 몇 제제 결정할에서 사용될 하류 분석법 효소 요구. 전형적인 큰 준비는 8 고 활성 준비 (따라서 16 유도 500 ㎖의 세균 배양의 총을 사용)의 풀링으로 구성되어 있지만, 이것은 임의의 수이며, 실험실 다릅니다.

  1. 분주되어야하는 활성이 높은 정제 rG4R1의 총량을 계산한다. 일반적 7 μL 씩 하류 분석에 사용된다. 열 CYCL의 블록을 채우기어 스트립 PCR 튜브 4 °의 C (블록의 고체 성질이 PCR 스트립의 신속한 폐쇄를 촉진하므로 이들로 분주합니다)로 설정합니다.
  2. 손에 튜브를 해동 신속 -80 ° C에서 높은 활성 rG4R1를 포함하는 PCR 튜브를 검색하고; 얼음 소량 튜브에 남아있는 경우에는, 얼음에 튜브를 놓는다. 미리 냉각, 15 ML의 튜브에 신속 - 해동 준비를 모두 결합하고 거품을 최소화해야하고, 잘 섞는다.
  3. 자동 반복 피펫을 사용하여, 열 순환기에서 예비 냉각 PCR 스트립 튜브에 소망 분취 량을 분배. 즉시 1로 - 2 스트립 완료, 두 번째 사람이 뚜껑을 닫고 (플래시 동결 효소 활성을 유지하기 위해 필요합니다) 액체 질소에 떠있는 96 웰 웨이퍼로 전송할 수 있습니다.
    주 : 효소 4에 있지되는 시간을 감소시키는 시간에 자동 피펫 팁으로 rG4R1 약 200 μL 이상 적용되지 않는다기음.
  4. 열 자전거 타는 사람에 미리 냉각 PCR 스트립 튜브 분취 가득 제대로 고정되고 나면, 신속하게 열 자전거 타는 사람에 얼음에서 더 많은 사전 냉장 PCR 스트립 튜브를 전송 및 분취를 계속합니다. 효소의 나머지는 분주 할 때까지 이러한 방식으로 계속 플래시를 액체 질소로 동결하고, 드라이 아이스로 옮겼다. 마지막으로, 장기 저장에 대해 -80 ° C로 분취 옮긴다.

7. 정량 정화 rG4R1 농도의

  1. 단백질 분리를위한 아크릴 아미드 / SDS 젤을 해결 / 12 % 스태킹 표준 5 %를 붓는다.
  2. 분주 rG4R1의 약 50 μL 해동, 하나의 튜브에 결합하고 잘 섞는다. (pH가 6.8, 26.3 % (w / v)의 글리세롤, 2.1 % SDS, 0.02 % 브로 모 페놀 블루 65.8 mM 트리스 - 염산) + BME (50 μL를 피펫으로 정확한 부피를 측정하고 2 배 램 믈리 샘플 버퍼의 동일한 금액을 추가 / 배 램리 완충액 950 μL). 10 분 동안 98 ℃에서의 단백질 변성.
    3. 1X 샘플 버퍼에 넓은 범위의 MW 마커의 희석을 준비 + BME 다음과 단백질의 양이 표준으로 겔에로드 될 수 있도록 : 31.3, 62.5, 125, 250, 500 NG.
    참고 : 넓은 범위 MW 마커에 포함 된 각각의 단백질 표준에 존재하는 0.1 μg의 / 0.3 μg의 / μL에 존재하는 50 kDa 단백질을 제외하고 μL. 이 마커는 열 변성 될 필요가 없습니다.
  3. 겔에서 빗을 제거하고 표준 1 배 SDS / 글리신 실행 버퍼로 우물을 씻는다. 로딩 효소의 최적의 양이 사용자에 의해 결정되어야하지만 (달라질 효소 제제의 농도로, 예를 들어, 35 25 당량과 (50과 변성 된 단백질의 25 μL) rG4R1 12.5 μL를로드 μL 그림 3)에서 젤에 로딩 하였다. 단계 7.3에서 제조 된 단백질 표준을 넣습니다. 피펫가 제대로 조정되어 있는지 확인하고 possib만큼 정확해야합니다피펫 팅 기술로 제작 정확한 정량을 보장합니다.
  4. 염료 앞 약 2/3 겔의 통과 때까지 120 V에서 젤을 실행합니다 (넓은 범위 MW 마커를 구성하는 단백질의 적절한 분리를 보장하기 위해).
  5. 겔을 제거하고 면도날로 떨어져 절단하여 단백질을 함유하지 겔의 일부를 폐기. 유리 캐 서 롤 접시 또는 이와 동등한 용기에 젤을 놓습니다. 쿠마 염료로 젤 얼룩 (쿠마의 50 mg의 R-250 50:10:40 v / V를 메탄올 100 mL의 당을 : 아세트산 : 필터 종이 깔때기를 통해 여과 된 H 2 O) O / N 실온에서을 궤도 흔드는 세트 겔의 적절한 교반을 보장합니다.
  6. 30:10:60 v / V를 메탄올로 젤을 드-얼룩 : 아세트산 : H 2 O 탈색을 촉진하기 위해 고사리 업, 보풀이없는 티슈를 사용합니다. 필요에 따라 탈색 솔루션을 변경합니다. 배경이 충분히 rG4R1 단백질 표준을 시각화 낮아질 때까지 탈색 계속; 이에서 일반적인 젤단계는 그림 3에 표시됩니다.
  7. 시트 보호 사이에서 탈색 젤을 놓고 ≥300 dpi의 해상도로 젤을 검사합니다. 이미지 분석 소프트웨어 프로그램의 스캔 화상 (후지 Multiguage 상당)를 열고 (75), (100)에 해당하는 단백질 수준에서의 표준 곡선을 제조하고, 150 kDa의 (커브가 농도계 판독 대 g의 양을 나타낸다). 각 레인의 배경 농도계 값을 획득하는 과정에서 정량화되고 뺄해야합니다.
  8. 겔에 로딩 하였다 rG4R1의 체적 양이 표준 곡선의 선형 범위 내에있는 단백질의 양을 포함한다고 가정 rG4R1 마이크로 리터 당 단백질의 그램 량을 추정 할 수있다로드했습니다.
  9. 120,000g / 몰이다 G4R1의 분자량을 사용 몰량에 rG4R1의 외삽 g로 환산.
    참고 : 각 젤 들어, 세 추정 값이 될 것입니다(75, 100, 150 kDa의 표준 곡선을 생성하기 위해 사용되는 세 가지 단백질 마커들 각각에 대해 하나)를 생성. 이 또한 젤과 얼룩을 실행하고 단계 7.1 반복을 정량화 - 7.10. 제 젤 정량화의 결과, 사용자가 rG4R1 단백질 표준의 선형 범위 내에있는 양을 수득 상기 겔에 로딩 될 필요가 얼마나 측정 할 수있을 것이다. 전부, 고 활성, 정제 rG4R1의 농도를 나타내는 아홉 값을 추정. 20-100 nm 범위 내의 통상적 인 최종 배치 특정 rG4R1 농도를 제공하기 위해 이러한 값의 평균. 이 값에서 표준 편차를 계산한다 (N = 9).

결과

이 프로토콜 (그림 1)는 일상적으로 거의 순수, 촉매 활성 rG4R1을 산출한다. rG4R1 0.013 μL 범위 (도 위에서 설명한 G4 활성 분석으로 분석으로서, - TAMRA 표지 tetramolecular G4-DNA 0.2 pmol의 50 %가 0.2 이내에 단량체로 변환되는 효소 활성의 척도로서, 이는 전형적으로 관찰 2). 정제 rG4R1의 쿠마 염색은 G4-DNA 구슬을 결합 할 수 및 ATP 의존에서 용출 능력을 유지하고 그 rG4R1...

토론

이 프로토콜은 DHX36 유전자 산물, G4-Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1) (그림 1)의 분리를위한 고효율 발현, 정제 및 정량 방식을 나타냅니다. G4-DNA 접합 구슬에 대한 그의 태그 친 화성 코발트 친 화성 구슬 정화 및 효소 정제 :이 프로토콜은 두 개의 정제 단계를 사용합니다. 후자 단계는 rG4R1는 G4 구조물 가진 꽉 선호도 높은 특이성 및 풀림 촉매 활성을 활용하는 것을 독특하다. G4 구?...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

우리는 (JPV까지) 도자기 재단의 관대 한 선물을 포함하여, 우리의 재원을 감사드립니다 (PJS에) (PJS에) HealthGrant T32-CA079448 및 볼 주립 대학 시작 기금의 국립 연구소. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
TriEx4-DHX36 plasmidAddgene68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cellsNovagen71403-4
S.O.C mediumThermo Fisher Scientific15544034 
Difco Terrific BrothBecton Dickinson243820
GlycerolSigma-AldrichG5516
ChloramphenicolSigma-AldrichC191935 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)Sigma-AldrichC341650 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI6758
Lysozyme (from chicken egg white)Sigma-AldrichL6876
1 M Tris-HCl, pH 8Universal Scientific Supply Co. 1963-Bor from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7Universal Scientific Supply Co. 1966or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8Universal Scientific Supply Co. 1981or from standard source
70% EthanolFrom standard source
Magnesium chloride (1 M solution)Life TechnologiesAM9530G
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sodium acetateSigma-AldrichS8750
20x SSCUniversal Scientific Supply Co. 1665or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)Sigma-Aldrich63689
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8849
Leupeptin hemisulfateSigma-AldrichL8511
Streptavidin paramagnetic beadsPromegaZ5482
0.5 M EDTA, pH 8 Universal Scientific Supply Co. 0718or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6Universal Scientific Supply Co. From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)Sigma-AldrichL5385
Cobalt metal affinity beadsClonetech635502
L-HistidineSigma-AldrichH8000
Acetic acid, glacialFisher ScientificA38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)SigmaA7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)Biorad161-0148
GlycineSigma-Aldrich50046to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)Universal Scientific Supply Co. 1667to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE Sigma-Aldrich11666703001or from standard source
Tris baseFisher ScientificBP152-1to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMEDSigma-Aldrich411019
Ammonium persulfate (APS)Sigma-AldrichA3678
Broad Range Protein MW markersPromegaV8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")Oligos Etc5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")Oligos Etc5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plateLife TechnologiesAM10110
FicollSigma-AldrichF263730% in H2O
Coomassie R-250Sigma-Aldrich27816
MethanolFisher ScientificA412
Multiband UV lampCapable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)Capable of being cooled to 4 °C
MicrocentrifugeCapable of being cooled to 4 °C
Digital SonfierBransonOr equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bathFor formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteriaFor bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteriaFor growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometercapable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
ThermometerFrom standard source
PCR strip tubesFrom standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene)From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene)Thermo Scientific3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettesFrom standard source
Gel-loading tipsFrom standard source
Automatic repeating pipetteFor quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cyclerFrom standard source
Liquid NitrogenFrom standard source
Dry iceFrom standard source
Laemlli sample buffer Biorad161-0737
Apparatus for running large slab gelsBioradWe have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
MagnetLife Technologies12301DWe use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor bladesFrom standard source
Filter paper and funnelFrom standard source
Glass casserole dishFrom standard source
Orbital shakerFrom standard source
KimwipesFrom standard source
Clear sheet protectorsFrom standard source
Scanner and associated TWAIN softwareFrom standard source
Image analysis softwareSuch as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft ExcelOr equivalent 

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