Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Zusammenfassung

G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen.

Zusammenfassung

Höherwertige Nukleinsäurestrukturen G-Quadruplexe (G4S, G4 Strukturen) in guaninreichen Regionen sowohl DNA als auch RNA und sind thermisch hochstabile Form genannt. Es gibt> 375.000 putative G4 bildenden Sequenzen im menschlichen Genom, und sie sind in Promotorregionen, untranslatierten Regionen (UTRs) angereichert, und innerhalb der telomeren Wiederholungs. Aufgrund des Potenzials für diese Strukturen zellulärer Prozesse zu beeinflussen, wie beispielsweise Replikation und Transkription wurde die Zellenzyme entwickelt sie zu verwalten. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase 1 (G4R1), die biochemisch wurde zusammen gekennzeichnet durch unser Labor und Nagamine et al. und zu binden , extrem eng sowohl G4-DNA und RNA-G4 (K _d im Nieder pM - Bereich) gefunden. G4R1 ist die Quelle der Mehrzahl der G4-Auflösungsaktivität in Lysaten HeLa-Zelle und hat eine Rolle, da eine Rolle bei telomere Stoffwechsel, Lymphe Entwicklung, Gentranskription, Hämatopoese und Immunüberwachung spielen. Die Fähigkeit, efzient Expression und Aufreinigung katalytisch aktive G4R1 von Bedeutung ist für die Laboratorien an weiteren Einblick in die kinetische Interaktion von G4 Strukturen und G4-Lösung Enzyme zu gewinnen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Reinigung von rekombinantem G4R1 (rG4R1). Das beschriebene Verfahren beinhaltet die herkömmliche affinitätsbasierte Reinigung eines C-terminalen Histidin-markiertes Enzym in menschlichen Codon-optimierten ausgedrückt Bakterien mit der Ausnutzung der Fähigkeit von rG4R1 zu binden und G4-DNA Entspannen hochaktive Enzym in einer ATP- zu reinigen abhängige Elutionsschritt. Das Protokoll enthält außerdem ein Qualitätskontrollschritt, bei dem die enzymatische Aktivität von rG4R1 durch Untersuchung der Fähigkeit des gereinigten Enzyms gemessen wird G4-DNA zu entspannen. Außerdem wird ein Verfahren beschrieben, das für die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 ermöglicht. Alternative Anpassungen dieses Protokolls werden diskutiert.

Einleitung

G4 Strukturen sind hochstabile Nukleinsäuresekundärstrukturen, die innerhalb Guanin-reichen Regionen von DNA und RNA bilden. G4 Strukturen werden über Hoogsteen-Bindungswechselwirkungen stabilisiert und koordinative Bindung innerhalb des zentralen Hohlraums mit einwertigen Kationen (d. K ⁺ und Na ^+), die zu der bemerkenswerten thermischen Stabilität von G4 Strukturen ^{1, 2} wesentlich beitragen. Frühe Bioinformatik Studien vorgeschlagen , dass das menschliche Genom enthält> 375.000 "potential G4 bildenden Motive" ^{3, 4.} Neuere Studie Schätzungen deuten darauf hin , dass die Anzahl der G4 - Motive höher ist um einen Faktor von 2-5 ^5, während eine andere Studie 716.310 unterschiedliche Potential G4 bildenden prognostiziert ⁶ Sequenzen im menschlichen Genom. G4-bildende Sequenzen sind evolutionär konserviert und nicht willkürlich verteilt indas Genom. G4 - Motive sind in Gen kodierenden Regionen angereichert und nach oben von 40% der Gen - Promotoren enthalten G4 Motive ^7. Interessanterweise hat der Grad der Anreicherung von G4-Motive in einem Gen demonstriert worden, um die Funktion des Gens zu suggerieren. Zum Beispiel haben proto-Onkogenen und Gene in Entwicklung beteiligt signifikant größere Anreicherung von G4 Strukturen als Tumorsuppressorgene ^{8, 9.}

Mit hoher thermischer Stabilität, eine fast allgegenwärtige Präsenz im gesamten Genom, und das Potenzial, deutlich größeren zellulären Prozesse beeinflussen, ist es wenig überraschend zu finden, dass die Zelle Enzyme zu verwalten, diese Strukturen entwickelt hat. Ein solches Enzym ist G4 Resolvase1 (G4R1; auch Rhau und DHX36 genannt), die wir als die Quelle der meisten tetra G4-DNA Auflösungs Aktivität charakterisiert in menschlichen (HeLa) Zellen ^10. Seitdem hat es sich gezeigt, That G4R1 fest bindet und abwickelt katalytisch tetra und unimolekularer G4-DNA und G4-RNA mit den engsten berichteten KDs für einen G4-bindendes Protein ^{11, 12, 13.} Zusätzlich hat die G4-Auflösungs Aktivität von G4R1 wurde in einer Vielzahl von biochemischen und zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich telomere / Telomerase biology ^{11, 14, 15, 16,} Transkription und Splicing ^{17, 18, 19, 20,} Entwicklung ^21, Hämatopoese ^21, und der Immunregulation ^{22, 23.} Mit einem Übergewicht der G4-Sequenzen spezifisch im gesamten Genom und die diverse zelluläre p gelegenrozesse dass G4R1 die Fähigkeit hat zu verwickelt beteiligt mit kurzem wurde, zu exprimieren und zu reinigen, effizient hochaktiven rG4R1 von äußerster Wichtigkeit ist, die biochemischen Mechanismen, und das Verhalten dieses Proteins für die Aufklärung.

Hier zeigen wir eine neuartige Expression und Reinigungsschema (Figur 1) , die die Vorteile der ATP-abhängige, G4-Auflösungs Aktivität von rG4R1 effizient isolieren aktiven Enzyms führt. Dieses Schema könnte angepasst werden, um andere ATP-abhängigen, für die Nukleinsäure-Enzyme zu reinigen das Produkt der enzymatischen Reaktion ist nicht länger ein Substrat für die Bindung, wie es der Fall für G4R1.

Protokoll

1. Herstellung von G4-DNA-Strukturen, die für die Reinigung von rG4R1 Used (Bildung von biotinylierter DNA-G4 G-Quadruplex)

1. Bestellen Sie folgende DNA-Oligomer, genannt Z33-Bio, bei einer 1 & mgr; mol-Maßstab: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-Biotin-3'. Sicherzustellen, dass die Biotin-Einheit am 3'-Ende des Oligomers ist.
2. Bereiten 10x G4-Puffer: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA und 2,500 mM NaCl.
3. Resuspendieren Z33 Oligomers in 250 ul Wasser (so dass die Oligomer-Konzentration von ~ 2,5 mM). In 25 ul 10x G4-Puffer und mischen. Inkubieren des Oligomers bei 50 ° C für ~ 48 h.
4. Kurz das Rohr drehen, um die Kondensation (~ 1000 · g, 10 s) zu sammeln. Hinzufügen ~ 50 & mgr; l eines hoher Masse, hydrophiles Polysaccharid (30% Ficoll in H ₂ O) und mischen. Gießen Sie eine 10% Acrylamid / 1x TBE / 10% Glycerin-Gel (Gel Maße: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Sobald das Gel polymerisiert wird, waschen Sie die Vertiefungen mit 1x TBE und Lastdas gebildete Z33-Bio-Oligomer gleichmäßig über den größten Teil des Gels (Spur Laden Probe mit Schlieren Linien sichtbar gemacht werden).
   1. In einer Spur am Ende des Gels geladen einen kleinen Anteil des Oligomers, das für 10 min (dies dient als unstrukturierte Steuerung) sowie eine kleine Menge an Gel-Beladungsfarbstoff in eine andere bei 98 ° C erhitzt wurde, Spur zu überwachen, wie weit das Gel laufen.
5. Verwenden Sie 1x TBE als Gel-Laufpuffer und führen Sie das Gel bei 120 V, bis die Farbstofffront mindestens 1/3 des Gels durchlaufen hat.
6. Legen Sie eine Dünnschicht-Chromatographie-Platte mit seiner rauen Seite nach oben in einer Klarsichthülle (oder mit Plastikfolie abdecken). Entfernen Sie eine der Glasplatten und übertragen Sie das Gel auf die Oberfläche des Blattschutz. Schalten Sie die Deckenbeleuchtung und UV-Schatten das Gel (lange Wellenlänge: 365 nm). Verwenden Sie eine frische Rasierklinge und schneiden Sie die G-Quadruplex-Z33-Bio-Band, die als Lauf höher im Gel zu sehen sein wird (mit langsamer Mobilität) bezogen auf die Schmelzeed Kontrolle.
7. Legen Sie die Gelschnitte das gebildete G4-DNA in einem 50 ml-Röhrchen und fügen Sie einfach genug Einweichen Puffer, der die Gelschnitte zu bedecken (Einweichen Puffer besteht aus 1/3 Volumen 10x TBE, 1/3 Volumen gesättigter Natriumacetat und 1/3 Volumen H ₂ O). Das Röhrchen wird in einem 37 ° C-Inkubator (nonhumidified) und Inkubation O / N.
8. Die Lösung wird in einem 15 ml-Röhrchen und fügen 1/10 Volumen Glykogen (Glykogen Lager bei 20 mg / ml in 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8 und 0,05% Natriumazid) und ~ 1.2x Volumen Isopropanol .
   HINWEIS: Natriumazid ist akut toxisch, so mit Vorsicht verwenden!
   1. Mischen Sie und legen Sie den Schlauch bei -20 ° C für mindestens 2 h. Drehe das Röhrchen bei 2.700 xg in einer Tischzentrifuge, gekühlt auf 4 ° C für 12 min. Vorsichtig dekantiert die Lösung von der G4-DNA pelletiert. Waschen Sie das Pellet 3 mal mit 70% EtOH + 50 mM NaCl (das Salz in der Wasch ist entscheidend für die Stabilität G4). Wick entfernt überschüssige Flüssigkeit mit einem fusselfreien Tuch Papier.
9. OrtDas gewaschene Pellet im Kühlschrank das Pellet mindestens 2 h hydratisieren und zum leichteren Resuspension ermöglichen. Resuspendieren des Pellets in 50 ul TNE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl und 0,05 mM EDTA pH 8).
10. Place 5 ul dieser gebildeten DNA G-Quadruplex in 495 & mgr; l H ₂ O und zu quantifizieren , indem unter Verwendung eines Spektrophotometers , das der Extinktionskoeffizient ermöglicht durch Eingabe der Nukleotidzusammensetzung des Oligomers bestimmt werden (der Extinktionskoeffizient des Z33 DNA - Oligomer mit einer Basiszusammensetzung A = 8, C = 3, G = 15 und T = 7 341.946 l / mol / cm). Geben Sie den Verdünnungsfaktor 25 (nicht 100), da das gebildete G-Quadruplex von 4 Stränge der DNA besteht.
11. Aliquot der Volumenäquivalent von 3 ODs (OD ₂₆₀ Einheiten) pro Röhrchen und bei -20 ° C; wenn die 5 & mgr; l zum Beispiel, die mit dem 495 & mgr; l H ₂ O ergibt eine OD ₂₆₀ Lesen von 3 hinzugefügt wurde, bereiten dann 5 & mgr; l Aliquots.

2. Herstellung von G4-DNA-Strukturen in eine enzymatische Aktivität Assay von rG4R1 verwendet zu werden (Bildung von TAMRA-markierten G4-DNA)

1. Bestellen Sie folgende DNA-Oligomer, genannt Z33-TAM bei einer 1 & mgr; mol-Maßstab: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Sicherzustellen, dass die TAMRA-Rest am 5'-Ende des Oligomers ist.
2. Nach dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 1 für die Bildung der G-Quadruplex umrissen, mit der Ausnahme, dass ultraviolette (UV) shadowing ist nicht notwendig, da die Tetramethylrhodamin (TAMRA) -markierten G-Quadruplex wird mit dem bloßen Auge leicht sichtbar sein. Wieder stellen Sie sicher, dass eine geschmolzene Kontrolle auf dem Gel enthalten.
3. ein Spektrophotometer Lesen des TAMRA-markierte DNA G-Quadruplex, wie in Schritt 1, verdünne das gebildete G-Quadruplex bis 0,2 pmol / & mgr; l mit TNE-Puffer nach der Einnahme. Schließlich Glycerin zu einer 10% igen Endkonzentration und bei -20 ° C hinzufügen.

3. Transformation (DE3) pLysS Competent Cells mit ptriEx4-DHX36 (Plasmid Encoding Menschen G4R1) und wachsen / Induce Große Bakterienkulturen

1. Beziehen Sie die TriEx4-DHX36 Plasmid.
2. Aliquot der Bakterien in 20 & mgr; l-Aliquots und lagern Sie sie bei -80 ° C. Aliquot der SOC - Medium (2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 10 mM MgSO ₄ und 20 mM Glucose) in 80 ul Aliquots und bei -80 ° C.
3. Bereiten Sie Carbenicillin (CARB) / Chloramphenicol (CAM) LB-Agar-Platten. Stock Konzentrationen von CARB und CAM sind 50 mg / ml in H ₂ O und 35 mg / ml in 70% EtOH, bzw., und diese sind 1,000x konzentriert; Somit sind die Endkonzentrationen in der LB-Agar-Selektionsplatten 50 ug / ml und 35 ug / ml.
4. Platz 1 aliquote Menge von Bakterien auf Eis und legen 1 aliquoten SOC-Medium bei RT. 1 ug pTriEx4-DHX36 Plasmid zu den Bakterien und vorsichtig schwenken mit der Pipettenspitze zu mischen. Inkubieren auf Eis für weitere 5 min und dann Hitzeschock bei 42 & #176; C für 30 s. Auf Eis für 2 Minuten und fügen Sie das SOC-Medium.
5. Platte, die die transformierten Bakterien auf vorgewärmten Selektionsplatten (typischerweise Platte mit einem kleinen Volumen, wie von 5 bis 10 & mgr; l, zu niedrige Kolonie Dichte gewährleisten, sodass einzelne Kolonien lassen sich leicht in großen Kulturen geimpft werden) und Inkubation bei 37 ° CO / N.
6. Bereiten Terrific Broth gemäß den Anweisungen des Herstellers ^24. Machen Sie 500 ml pro großen Kolben (stellen Sie sicher, Glycerin hinzufügen) und Autoklaven auf einem kurzen Flüssigkeitskreislauf.
7. Hinzufügen CARB / CAM (50 ug / ml / 35 & mgr; g / ml) zu der Brühe und dann die Kulturen inokulieren durch Agarpfropfen wobei (unter Verwendung einer Pipette p1000) eine einzelne Bakterienkolonie und Pipettieren in die Brühe enthält. Swirl, die Kulturen kräftig sie zu belüften und dann brüten die Kulturen bei 37 ° CO / N ohne Schütteln.
8. Am nächsten Tag, legen Sie die Kulturen in einem 37 ° C Schüttler und schütteln bei ~ 225 Umdrehungen pro Minute. Wachsen die Kulturen , bis die OD ₆₀₀ etwa 0,4 -0,6, die etwa 4 typischerweise nehmen - 6 h, abhängig von der anfänglichen Zelldichte.
   Hinweis: Dies wird durch spektrophotometrische Messungen periodische Dichteüberwachung erfordern, und es ist wichtig , die Kulturen zu viel über 0,5 ODs nicht wachsen. Als Rohling für spektrophotometrische Messungen, Spin-down 1 ml Bakterien und die geklärte Brühe als Blanking-Lösung verwenden.
9. Sobald die richtige OD ₆₀₀ erhalten wird, legen Sie sofort die Kulturen auf Eis und sie schnell auf 10 ° C abkühlen lassen . Überwachen Sie die Temperatur mit einem Thermometer sauber gewischt mit 70% EtOH. Expedite die Kühlung durch schnelles Drehen der Kolben während auf Eis, da dies zu weiteren Bakterienwachstum vor der rekombinanten Proteininduktion begrenzen.
10. Hinzufügen IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM (~ 120 mg / 500 ml Kultur) und dann Schütteln bei 80 rpm bei 14 ° C für ~ 17 bis 18 h. Die ideale Temperatur für die Proteininduktion wurde gefunden, 14 ° C sein; am besten dies zu erreichen, verwenden Sie ein loc Wasserbad gekühlt Schüttlerin einem herkömmlichen Kühlraum ATED und manuell die Temperatur des Wasserbades mit einem Thermometer überprüfen.
    HINWEIS: Alternativ können Sie auch einen luftgekühlten Schüttler / Inkubator, obwohl es notwendig ist , was zu testen digital eingestellten Temperatureinstellung die gewünschte Flüssigkeitstemperatur ergeben wird (Test dies durch eine Flasche Wasser mit einem Thermometer in ihm Inkubation und Schütteln bei 80 Umdrehungen pro Minute für ein paar Stunden wird die digitale Temperatureinstellung entsprechend, bis 14 ° C Einstellung erreicht).
11. Legen Sie die Kulturen auf Eis und kühlen sie schnell, wie in Schritt 3.9. Nehmen Sie eine kleine aliquote Menge von Bakterien und nehmen Sie eine OD ₆₀₀ Lesung; 1.2 OD ₆₀₀ - im Idealfall werden sich die Kulturen während der Induktion auf etwa 0,8 verdoppelt.
12. Übertragen Sie die Bakterien zu 500 ml Zentrifugenröhrchen und manuell ausgleichen Bakterienkultur unter Verwendung des Gewichts zwischen den Rohren zu glätten. Einmal ausgeglichen, sie für 20 min bei 4 ° C bei 3.840 xg zentrifugiert. Gießen Sie die geklärte Brühe ab und frieren die bakterielle pelkönnen bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Proteinreinigung.

4. Reinigung von humanen rG4R1

1. Tauen und Bakterienpellets lysieren.
   1. Auftauen das Bakterienpellet in 3 ml TN-Puffer bei RT (TN-Puffer besteht aus 100 mM Tris pH 7,5 und 50 mM NaCl). Halten Sie die Flaschen in der Hand und wirbeln auftauen / resuspendieren Bakterienpellet. Nach dem Auftauen und relativ gleichmäßig suspendiert, bringen das Volumen bis zu 5 ml mit TN-Puffer (weitere Suspension kann über Auf- und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette erreicht werden).
      HINWEIS: Es ist typisch auftauen / prep entweder 2 oder 4 Flaschen am Tag der Vorbereitung, in Abhängigkeit von dem Niveau des Benutzers an Komfort mit dem Reinigungsverfahren.
   2. Man löst 20 mg Lysozym in 250 & mgr; l H ₂ O (pro Kultur) , und fügen zu den resuspendierten Bakterien. Lassen Sie das Lysozym die Bakterien für ~ 5 zu verdauen - 10 min, während die Flaschen in der Hand wirbeln.
      HINWEIS: Die Farbe des susRente beginnt etwas wie die Verdauung weiter zu erleichtern, und die Suspension wird relativ nicht-viskos sein. Wenn die Kulturen zu überwachsen sind (dh viel größer als 1,2 OD _600), dann wird die chromosomale bakterielle DNA unerwünschte Viskosität in diesem Stadium verursachen können.
   3. In 250 ul Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC) und ein 10-ul-Aliquot von Leupeptin. Gut mischen.
   4. Auf Eis und 10 ml kaltem TN-Puffer und 22 & mgr; l von BME. Transfer in ein 50 ml Röhrchen.
   5. Beschallen die Bakterien auf Eis mit einem digitalen Beschallungsgerät auf 30% Amplitude eingestellt. Impuls bei 2 s ON und 2 s AUS für 1 min. Wiederholen Sie die Beschallung 3 mal, so dass die Proben für mindestens 2 min zwischen Beschallungsschritte auf Eis zu kühlen.
      HINWEIS: Bei mehreren Kulturen, jede wiederum beschallen , bevor die Beschallung Iterationen wiederholen. Während der Beschallung, seien Sie vorsichtig die Beschallungsspitze zu halten ausreichend im Bakterienlysats untergetaucht, aber nicht berühren the Seiten des Rohres, da dies überschüssige Wärme erzeugen.
   6. In das gleiche Volumen (15 ml) kaltem 4x SSC + 20 & mgr; l von BME + 50 & mgr; l von PIC + 1 aliquote Menge von Leupeptin und mischen.
   7. In einer Tischzentrifuge auf 4 ° C vorgekühlt Zentrifugation der Lysate bei 2.300 xg für 20 min. Den Überstand auf frische, vorgekühlte 50 ml-Röhrchen (1 Röhrchen pro große Kultur vorbereitet wird).
2. Bereiten Sie G4-magnetischen Kügelchen.
   1. Nehmen Sie 1 ml Streptavidin paramagnetische Perle (SPB) Suspension (je 1 Liter Kultur), und überträgt es auf einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die SPB mit einem Magneten und waschen Sie 2x mit 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8 Resuspendieren des gewaschenen SPB in 200 & mgr; l der gleichen Lösung zum Waschen der Kügelchen verwendet.
   2. In einem 3 OD aliquote Menge von G4-DNA (Z33-Bio G4 hergestellt in Abschnitt 1) ​​an die SPB Suspension und mischen schnell durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. Die Röhrchen auf einem Rotator und rotieren bei RT für mindestens 30 min (und bis zu 60 min).
   3. Achterner diese Periode der Rotation, blockieren die G4-gebundenen SPB von 1 ml 0,4% Lactalbumin Zugabe, und auf Eis halten, bis sie benötigt. Verdünnen Sie die 0,4% Lactalbumin aus der 4% Lactalbumin Lager mit 1x Tris-Glycin.
      HINWEIS: Das Lager 4% Lactalbumin (w / v) zunächst durch Auflösen in 2 M Glycin pH 7,5, mit der weiteren Zugabe von 1x PIC und 0,05% Natriumazid hergestellt wird.
3. Bind Histidin-markierten rG4R1 zu Kobaltkügelchen (CB) (Fortsetzung von Schritt 4.1).
   1. 1 mL CB Aufschlämmung (äquivalent zu einem 0,5 ml Volumen bead) zu jeder 50 ml-Röhrchen geklärte Bakterienlysat enthält. Inkubieren für 20 min bei RT auf einem Rotator.
      HINWEIS: 0,5 mL bead Volumen pro 1 l geklärtes Lysat verwendet wird; beispielsweise , wenn zwei 500 ml - Bakterienkulturen hergestellt, nur CB auf die 50 ml - Röhrchen hinzu geklärte Lysat aus einer der Kulturen an diesem Punkt, wie Lysat aus der zweiten Kultur , die in Reihe mit dem gleichen 0,5 ml CB in st gebunden sindep 4.3.3).
   2. Spin-Down CB bei 110 xg für 5 min in einem 4 ° C Tischzentrifuge. Saugen Sie das sorgfältig Flüssigkeit und lassen ein paar ml Flüssigkeit, um nicht die pelle CB zu stören. Waschen mit 10 bis 15 ml kaltem 4x SSC + BME (0,5 ul BME / ml 4x SSC).
      HINWEIS: Für Waschungen, gießen Sie die 10-15 ml direkt auf die pelleKobaltKügelchen anstelle von Pipettieren, wie Pipettieren führt dazu , dass die Perlen in das Innere der Pipette und Protein verloren gehen stecken.
   3. Pellet die CB wieder durch Zentrifugation und dann die nächste geklärte Lysat (30 ml, was die ^2. große induzierte Bakterienkultur) gießen auf den pelletiert CB. Inkubieren für weitere 20 min bei RT auf den Rotator und dann waschen zweimal mit 10-15 ml 4x SSC + BME. Pellet bei 110 xg für 5 min bei 4 ° C.
   4. Nach dem zweiten Waschen, aspirieren die Flüssigkeit und etwa 2 ml Perlen / Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu verlassen. Übertragung der proteingebundenen CB an einen vorgekühlten 2-ml-Röhrchen durchunter Verwendung einer 1 ml "wide-bore" Pipettenspitze.
      HINWEIS: eine frische Rasierklinge Verwenden Sie das Ende der Spitze vor der Übertragung, da die Verwendung dieser "wide-bore" Pipettenspitze zu schneiden den Verlust von proteingebundenen Kobaltkügelchen reduzieren.
   5. Zentrifuge kurz die Kügelchen in der 2 ml-Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit (~ 18.000 · g) in einer Mikro bei 4 ° C (~ 5-10 s ist alles, was für eine schnelle Pelletierung erforderlich ist). Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand durch Pipettieren verwerfen, man aufpassen, nicht die proteingebundenen CB zu verlieren.
4. Eluieren rG4R1 von CB.
   1. Inkubieren der CB in 0,5 ml Histidin Elutionspuffer (HEB) auf einem Rotator für 5 min in einem kalten Raum. Auch wenn HEB Zugabe pipettieren nur die 0,5 ml auf die Kügelchen und resuspendieren die Perlen durch das Rohr Umkehren (CB Verlust zu beseitigen). HEB 0,7 M L-Histidin pH 6 (der pH-Wert eingestellt wird unter Verwendung von Essigsäure).
   2. Zentrifuge bei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge 4 ° C für 1 min. Den Überstandauf ein vorgekühltes 15 ml-Röhrchen. Sanft zu entfernen und das Protein enthaltende Überstand durch sorgfältiges Pipettieren zu übertragen, eine kleine Menge Flüssigkeit auf der Oberseite des CB zu verlassen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 und 4.4.2 für insgesamt 3 HEB Eluierungen.
   4. Eluieren, einmal mit 0,2 M EDTA pH 6,0; die Farbe des CB wird von rosa bis weiß ändern, wenn die EDTA die Kobaltchelate.
   5. Nach dieser vierten und letzten Elution wurde mit dem 15 ml Röhrchen überführt wurde, pipettiert den Rest Elutionspuffer vom CB durch ein Gel-Ladespitze am Ende einer 1 ml-Pipettenspitze verwendet wird; indem die Spitze zum Boden des Röhrchens zu stürzen, Restproteinhaltigen Elutionspuffer gesammelt werden können.
5. Binden Sie rG4R1 an G4-gebundenen SPB und rekombinante Enzym in einer ATP-abhängigen Weise eluieren.
   1. Bereiten 5x Res Puffer: 250 mM Tris-Acetat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl _2, und 50% Glycerol. Bereiten 3x Res Puffer: 0,915 ml H ₂ O, 2 ml 5x Res Puffer, 0,33 ml 0,4% Lactalbumin (diluted von 4% Lactalbumin mit 1x Tris-Glycin), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M MgCl _2, 0,050 ml PIC und 0,010 ml Leupeptin. Halten Sie sich auf dem Eis.
      HINWEIS: Das Lager 4% Lactalbumin (w / v) zunächst durch Auflösen in 2 M Glycin pH 7,5, mit der weiteren Zugabe von 1x PIC und 0,05% Natriumazid hergestellt wird.
   2. Pellet G4-SPB an der Seite des Rohres mit einem Magneten und den Überstand verwerfen (G4-SPB, wie in Schritt 4.2) hergestellt. 1 mL 3x Res Buffer zur G4-SPB und Pipette zu mischen.
   3. Pipette dieses 1 ml G4-SPB suspendiert in 3x Res Puffer in das 15 ml-Röhrchen mit ~ 2 ml proteinhaltigen HEB / EDTA (Eluat aus Schritt 4.4). Inkubieren für 15 min in einem 37 ° C warmen Wasserbad unter gelegentlichem Rühren, so dass die Perlen nicht absetzen.
   4. Auf Eis, pelletieren Sie die proteingebundenen G4-SPB an der Seite des Rohres mit einem Magneten. Zum Waschen 1 mL 4x SSC + 0,4% Lactalbumin (+ 0,5 ul / ml BME) und Pipette die Perlen zu resuspendieren. Pellet-Perlen mit ter Magnet auf Eis. Wiederholen Sie diese Wäsche für insgesamt 2 Wäschen.
      HINWEIS: Geduld wird während des Waschvorgangs erforderlich zwischen Waschungen alle magnetischen Perlen wurden pelletiert wurden , um sicherzustellen , dass. Dies gilt insbesondere für die erhöhte Viskosität der Lösung, die infolge der Glycerin in den Res Puffer enthalten sind.
   5. Waschen Sie die G4-SPB 1x mit 1 ml 3x Res puffern.
   6. Vorbereitung Elutionspuffer (EB): 0,5 ml 3x Res Puffer, 0,1 ml 0,1 M ATP, und 0,4 ml H ₂ O.
   7. Vorwärmen 1 ml EB bis 37 ° C in PCR-Röhrchen über den Heizblock eines Thermocyclers auf 37 ° C eingestellt verteilt.
   8. Pellet G4-SPB mit dem Magneten auf Eis und resuspendieren die Perlen in 100 ul vorgewärmtes EB. Unmittelbar übertragen Sie die Perlen auf einer vorgewärmten PCR-Röhrchen und bei 37 ° C für 30 s inkubiert.
   9. 12 & mgr; l 5 M NaCl Unverzüglich hinzufügen und Pipette nach oben und unten kräftig 20 - 30 mal. Die Kombination der hohen Salz und ATP in der EB enthaltenendient rG4R1 von den G4-Perlen zu eluieren.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig , die Anzahl von Blasen während des Pipettierprozeß gebildet zu minimieren, wie Blasen , die das Protein denaturieren können.
   10. Unmittelbar Pellet die G4-SPB mit einem Magneten und übertragen das Protein enthaltenden Eluats in ein frisches PCR-Röhrchen auf Eis (mit dem Datum beschriftet).
   11. Wiederholen Sie die Elution und die Übertragung in den Schritten 4.5.8-4.5.10; Das Endprodukt dieses Verfahrens ist somit ~ 200 & mgr; l, enthaltend EB rG4R1 gereinigt. Nehmen Sie sich zwei 7 & mgr; l-Aliquots (in PCR-Röhrchen mit dem entsprechenden Datum beschriftet) für den Einsatz in der Qualitätskontrolle enzymatische Aktivität Test, testen, ob hochaktive rG4R1 hat in der Tat gereinigt worden.
   12. Speichern das gereinigte rG4R1 bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Aktivitätstest.

5. Qualitätskontrolle enzymatischen Aktivität Assay von gereinigtem rG4R1

1. Für jede Zubereitung von rG4R1 getestet werden, bereiten 300 & mgr; lvon Resolvase Testpuffer (RAB), wobei jeweils 30 & mgr; l 0,2 pmol von TAMRA-markierten Z33 G4-DNA enthält (in Schritt 2) hergestellt; Die Zusammensetzung der RAB ist wie folgt: 0,1 ml 3x Res Puffer, 0,01 ml 0,2 pmol / & mgr; l G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP und 0,16 ml H ₂ O. In einem Streifen von 6 PCR Rohre, Pipette 40 ul RAB in das erste Rohr und 30 ul RAB in die verbleibenden Rohre (halten an dieser Stelle die Röhrchen auf Eis).
2. Rufen Sie eine der 7 ul rG4R1 Aliquots (aus Schritt 4.5.11) und legen Sie es auf Eis. Mit einer p20 Pipette auf 5 & mgr; l, Pipette vorsichtig nach oben und unten ein paar Mal in der aliquoten und Transfer 5 ul mit dem ersten Rohr des Streifens von 6 PCR-Röhrchen, die rG4R1 zu mischen (die, die 40 & mgr; l von RAB enthält). Danach können Sie die Pipette auf 10 & mgr; l und übertragen seriell 10 & mgr; l auf die verbleibenden Röhrchen PCR RAB enthält.
3. Unmittelbar inkubieren diesen Streifen von PCR-Röhrchen bei 37 ° C für 30 min in einem thermischen Cycler von einem 4 ° C gehalten, gefolgt.Öffnen der Rohre, während sie bei 4 ° C gehalten werden und mit 2 ul 0,5 M EDTA pH 8 zu jedem Röhrchen (zum Anhalten der enzymatischen Reaktion).
4. Gießen Sie eine 10% Acrylamid / 1x TBE / 10% Glycerin-Gel. Nach Entfernung des Kamms, waschen Sie die Vertiefungen mit 1x TBE. Werden 5 ul einer hoher Masse, hydrophiles Polysaccharid (30% Ficoll in H ₂ O) in jedes Röhrchen und Last 15 ul aus jedem Röhrchen (die Beladung von Vertiefungen kann wieder beobachtet werden , unter Verwendung von Schlieren Linien).
   1. Als Kontrolle für G4-DNA Mobilität, fügen 4 ul einer hohen Masse aus hydrophilen Polysacchariden auf 20 & mgr; l RAB und Last 15 ul; als Kontrolle für die abgewickelte monomeren Z33, Wärme 20 ul RAB bei 98 ° C für 10 min, 4 hinzufügen ul einer hohen Masse aus hydrophilen Polysacchariden und Last 15 & mgr; l.
5. Führen Sie das Gel bei 120 V für 2 h mit 1x TBE als Laufpuffer. Bild das Gel auf einem multimodalen Imager mit Fluoreszenz-Imaging-Fähigkeit TAMRA-spezifische Filter verwendet werden (erregen mit einem 532 nm grünen Laser und verwenden Sie einen 580 nm Bandpass-Filter 30 (580 BP 30)).
   ANMERKUNG: Eine sehr aktive Vorbereitung von rG4R1 nachgeben vollständige Auflösung von TAMRA-markierten Z33 in den ersten drei Spuren , die auf das Gel geladen wurden, wie in Abbildung 2 dargestellt.

6. Pooling von Highly Active rG4R1 Preps, Aliquotierung und Lagerung

Hinweis: Dieser Schritt 2 Personen erfordert. Die Anzahl und die enzymatische Anforderungen der nachgeschalteten Assays, die das gereinigte rG4R1 verwendet wird, in die bestimmen, wie viele Präparate vor erforderlich sind, um Aliquotieren. Eine typische große Vorbereitung besteht aus der Zusammenlegung von 8 hochaktiven Zubereitungen (also insgesamt 16 induziert 500 ml Bakterienkulturen verwendet wird), aber dies ist eine willkürliche Zahl und Laborspezifisch.

1. Berechnen des Gesamtvolumens der hochaktiven, gereinigt rG4R1, die zu aliquotiert ist. Typischerweise werden 7 & mgr; l Aliquots in Downstream-Assays verwendet. Füllen Sie den Block eines thermischen zykler auf 4 ° C mit PCR-Röhrchen Streifen (diese portioniert in sein wird, da die feste Natur des Blocks wird die rasche Schließung der PCR-Streifen beschleunigen).
2. Rufen Sie die PCR-Röhrchen hochaktiven rG4R1 von -80 ° C enthält, und schnell die Röhrchen in der Hand auftauen; wenn eine kleine Menge an Eis in dem Rohr belassen wird, legen die Röhrchen auf Eis. Kombinieren Sie alle die schnell aufgetauten Präparate in eine vorgekühlte, 15 ml-Röhrchen und gut mischen, um sicherzustellen, Blasen zu minimieren.
3. Unter Verwendung eines automatischen Repetierpipette, verzichtet die gewünschte aliquoten Volumen in die vorgekühlte PCR Streifen Rohre in den Thermocycler. Sobald 1-2 Streifen abgeschlossen sind, haben die zweite Person den Deckel schließen und sie auf 96-Well-Wafer, die in flüssigem Stickstoff schweben (Flash Einfrieren notwendig ist, die enzymatische Aktivität zu erhalten).
   HINWEIS: Nehmen Sie nicht mehr als etwa 200 & mgr; l rG4R1 in die Spitze des automatischen Pipette in einer Zeit , die Zeit zu reduzieren , dass das Enzym nicht bei 4° C.
4. Sobald die vorgekühlten PCR-Streifen Röhrchen in den Thermocycler wurden mit Aliquots und richtig gefroren, schnell übertragen mehr vorgekühlte PCR-Streifen Rohre aus Eis zu den Thermocycler und weiterhin Aliquotierung gefüllt worden. Weiter auf diese Weise, bis der Rest des Enzyms wurde aliquotiert wurde, in flüssigem Stickstoff eingefroren, und an Trockeneis. Schließlich übertragen die Aliquoten bis -80 ° C zur Langzeitlagerung.

7. Die Quantifizierung von gereinigtem rG4R1 Konzentration

1. Gießen Sie eine Standard-5% Stapeln / 12% Lösung Acrylamid / SDS-Gel zur Proteintrennung.
2. Thaw etwa 50 & mgr; l aliquotiert rG4R1, verbinden sich zu einem Rohr, und gut mischen. Messen Sie die exakte Volumen mit einer Pipette und füge eine gleiche Menge von 2 x Laemmli-Probenpuffer (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (w / v) Glycerol, 2,1% SDS und 0,02% Bromphenolblau) + BME (50 ul / 950 & mgr; l 2x Laemmli-Puffer). Denaturiert das Protein bei 98 ° C für 10 min.
3. Bereiten Verdünnungen von Weitbereichs MW Marker in 1x Probenpuffer + BME, so daß die folgenden Mengen Protein auf das Gel als Standards geladen werden können: 31,3, 62,5, 125, 250 und 500 ng.
   Hinweis: Jeder Standard - Protein in den breiten Bereich MW Marker enthielt vorliegt bei 0,1 & mgr; g / & mgr; l, mit Ausnahme des 50 kDa - Protein, das bei 0,3 & mgr; g / & mgr; l vorhanden ist. Diese Marker brauchen keine Wärme denaturiert werden.
4. Nehmen Sie den Kamm aus dem Gel und waschen Sie die Vertiefungen mit Standard 1x SDS / Glycin-Laufpuffer. Legen Sie das Äquivalent von 25 und 12,5 & mgr; l rG4R1 (die 50 und 25 & mgr; l des denaturierten Protein ist), obwohl das optimale Volumen von Enzym sollte zum Laden durch den Benutzer bestimmt werden, da die Konzentration der enzymatischen Zubereitungen variieren (beispielsweise 35 ul wurden auf dem Gel in Figur 3 geladen). Legen Sie die Protein-Standards, hergestellt in Schritt 7.3. Stellen Sie sicher, dass die Pipetten richtig kalibriert sind, und stellen Sie sicher, so präzise wie possib seinle mit Pipettiertechnik, um eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten.
5. Führen Sie das Gel bei 120 V, bis die Farbstofffront etwa 2/3 des Gels durchlaufen hat (um eine ordnungsgemäße Trennung der Proteine, die die breite Palette MW Marker bilden).
6. Entfernen Sie das Gel und entsorgen Sie den Teil des Gels, das Protein nicht mit einem durch Schneiden sie weg Rasierklinge enthalten wird. Legen Sie das Gel in einem Glas Auflaufform oder eine Steckdose. Fleck des Gels mit Coomassie - Farbstoff (50 mg Coomassie R-250 pro 100 ml 50:10:40 v / v Methanol: Essigsäure: H ₂ O , das durch ein Filterpapiertrichter filtriert wurde) O / N bei RT auf einem Orbitalschüttler Satz ausreichende Bewegung des Gels zu gewährleisten.
7. De-Fleck das Gel mit 30:10:60 v / v Methanol: Essigsäure: H ₂ O geballt-up, fusselfreies Seidenpapier mit Entfärben zu beschleunigen. Ändern Sie die Entfärbelösung nach Bedarf. Weiter Entfärben, bis der Hintergrund ausreichend niedrig ist rG4R1 und Proteinstandards zu visualisieren; ein typisches Gel bei dieserStufe ist in Abbildung 3 dargestellt.
8. Legen Sie das entfärbt Gel zwischen einem Blattschutz und scannen Sie das Gel bei ≥300 dpi Auflösung. Öffnen Sie das gescannte Bild in einer Bildanalyse-Software-Programm (wie Fuji Multiguage oder gleichwertig) und bereiten Standardkurven aus den Protein-Standards, die 75, 100 entsprechen, und 150 kDa (die Kurven repräsentieren Gramm Mengen im Vergleich zu densitometrischen Messwerte). Stellen Sie sicher, dass der Hintergrund von jeder Spur zu subtrahieren während des Prozesses der Gewinnung densitometrischen Werte quantifiziert werden.
9. Unter der Annahme, dass die Volumenmenge der rG4R1, die auf dem Gel enthält eine Menge von Protein geladen wurde, die im linearen Bereich dieser Standardkurven ist, geladen, um die Gramm Menge an Protein pro Mikroliter rG4R1 kann hochgerechnet werden.
10. Wandeln die Extrapolation gram Menge rG4R1 in einer molaren Menge das Molekulargewicht des G4R1 Verwendung, was 120.000 g / mol.
    HINWEIS: Für jedes Gel werden drei hochgerechneten Werte seinerzeugt (eine für jede der drei Protein-Marker verwendet, um die Standardkurven zu erzeugen: 75, 100 und 150 kDa). Führen Sie zwei weitere Gele und Fleck und zu quantifizieren, sie durch Schritte 7.1 Wiederholung - 7.10. Mit den Ergebnissen der Quantifizierung des ersten Gel, wird der Benutzer in der Lage sein, zu beurteilen, wie viel rG4R1 weiter Gele geladen werden muss, eine Menge zu ergeben, die innerhalb des linearen Bereichs der Proteinstandards ist. Insgesamt extrapolieren neun Werte, um die Konzentration von hochaktiven, gereinigt rG4R1 darstellt. Durchschnitt dieser Werte die endgültige chargenspezifische rG4R1 Konzentration zu ergeben, die typischerweise im Bereich von 20-100 nm liegt. Berechnen der Standardabweichung aus diesen Werten (n = 9).

Ergebnisse

Dieses Protokoll (Abbildung 1) ergibt routinemäßig fast rein, katalytisch aktive rG4R1. Als Maß der enzymatischen Aktivität wird typischerweise beobachtet , dass 50% von 0,2 pmol von TAMRA-markierten tetra G4-DNA in Monomere innerhalb der 0,2 umgewandelt wird - 0,013 uL Bereich von rG4R1 durch die G4 - Aktivitätstest getestet , wie oben (Abbildung dargelegt 2). Coomassiefärbung von gereinigtem rG4R1 zeigt eine einzelne Bande bei der erwarteten 120 kDa Größe, mit...

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine hocheffiziente Expression, Reinigung und Quantifizierung Schema für die Isolierung des DHX36 Genprodukts, G4-Resolvase1 (G4R1, auch Rhau und DHX36 genannt) (Abbildung 1). Dieses Protokoll verwendet zwei Reinigungsschritte: His-Tag Affinitätsreinigung an Kobalt Affinitätsbeads und enzymatische Reinigung auf G4-DNA-konjugierten Perlen. Der letzte Schritt ist einzigartig, da es die Vorteile der engen Affinität nimmt, hohe Spezifität und katalytische Aktivität, die Abwicke...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (from chicken egg white)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7	Universal Scientific Supply Co.	1966	or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8			For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8			For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	or from standard source
70% Ethanol			From standard source
Magnesium chloride (1 M solution)	Life Technologies	AM9530G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptin hemisulfate	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidin paramagnetic beads	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	0718	or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6	Universal Scientific Supply Co.		From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)	Sigma-Aldrich	L5385
Cobalt metal affinity beads	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Universal Scientific Supply Co.	1667	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	or from standard source
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV lamp			Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)			Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge			Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath			For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria			For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria			For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer			capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer			From standard source
PCR strip tubes			From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene)			From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)			From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene)	Thermo Scientific	3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes			From standard source
Gel-loading tips			From standard source
Automatic repeating pipette			For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler			From standard source
Liquid Nitrogen			From standard source
Dry ice			From standard source
Laemlli sample buffer	Biorad	161-0737
Apparatus for running large slab gels	Biorad		We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet	Life Technologies	12301D	We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades			From standard source
Filter paper and funnel			From standard source
Glass casserole dish			From standard source
Orbital shaker			From standard source
Kimwipes			From standard source
Clear sheet protectors			From standard source
Scanner and associated TWAIN software			From standard source
Image analysis software			Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel			Or equivalent