Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

Resumo

G4 Resolvase1 liga-se a (G4) estruturas G-quadruplex com mais apertados afinidade reportada para uma proteína de ligação e G4 representa a maior parte da actividade de desenrolamento-G4 ADN em células HeLa. Nós descrevemos um protocolo romance que aproveita a afinidade e atividade desenrolamento dependente de ATP G4-Resolvase1 para purificar especificamente G4R1 recombinante cataliticamente ativo.

Resumo

estruturas de ácidos nucleicos de ordem superior chamado G-quadruplexes (G4S, estruturas G4) podem formar em regiões ricas em guanina de ADN e ARN e são altamente termicamente estável. Existem> 375.000 sequências formando-G4 putativos no genoma humano, e são enriquecidos em regiões promotoras, regiões não traduzidas (UTRs), e dentro da repetição telomérica. Devido ao potencial para estas estruturas de afectar os processos celulares, tais como a replicação e transcrição, a célula tem evoluído enzimas para geri-los. Uma tal enzima é uma resolvase G4 (G4R1), que foi co-bioquimicamente caracterizado pelo nosso laboratório e Nagamine et al. e verificou-se ligam-se muito bem para ambas G4-ADN-ARN e G4 (K _d no intervalo de baixo pM). G4R1 é a fonte da maioria da actividade de resolução de G4 em lisados ​​de células HeLa, e desde então sido implicada como desempenhando um papel no metabolismo dos telómeros, linfa desenvolvimento, a transcrição do gene, a hematopoiese, e vigilância imunitária. A capacidade de eftemente expressar e purificar cataliticamente activa G4R1 é de importância para os laboratórios interessados ​​em ganhar mais conhecimento sobre a interação cinética das estruturas G4 e enzimas resolver G4. Aqui, nós descrevemos um método detalhado para a purificação de G4R1 recombinante (rG4R1). O procedimento descrito incorpora a purificação baseada em afinidade tradicional de uma enzima de histidina marcada com C-terminal expressa em bactérias com codões optimizados humanos com a utilização da capacidade de se ligar e rG4R1 relaxar G4-ADN para purificar a enzima altamente activo numa ATP etapa de eluição dependente. O protocolo também inclui um passo de controlo de qualidade em que a actividade enzimática da rG4R1 é medida examinando a capacidade da enzima purificada para relaxar G4-ADN. Um método é também descrito que permite a quantificação de rG4R1 purificado. adaptações alternativas deste protocolo são discutidos.

Introdução

estruturas G4 são estruturas secundárias de ácido nucleico altamente estáveis ​​que se formam dentro de regiões ricas em guanina de ADN e ARN. Estruturas G4 são estabilizadas através de interacções de ligação de Hoogsteen-e coordenadas de ligação dentro da cavidade central com catiões monovalentes (isto é. ^De K ⁺ e Na ^+), que contribuem de forma significativa para a estabilidade térmica notável de estruturas G4 ^{1, 2.} Bioinformática estudos anteriores sugeriram que o genoma humano contém> 375.000 "potencial de formação de motivos G4" ^{3, 4.} Estimativas mais recentes sugerem que o número de motivos G4 é maior por um factor de 2-5 ^5, enquanto outro estudo prevê 716,310 potenciais sequências formando-G4 distintos no genoma humano ^6. G4-forming sequências são evolutivamente conservados e não disperso aleatoriamente emdo genoma. Motivos G4 são enriquecidos em regiões codificantes dos genes, e para cima de 40% de todos os promotores de genes contêm G4 motivos ^7. Interessantemente, o grau de enriquecimento de motivos G4 em um gene tem sido demonstrada para sugerir a função do gene. Por exemplo, os proto-oncogenes e genes envolvidos no desenvolvimento têm significativamente maior enriquecimento de estruturas G4 do que os genes supressores de tumor ^{8, 9.}

Com altas estabilidades térmicas, uma presença quase onipresente em todo o genoma, e o potencial de afetar significativamente principais processos celulares, não é surpreendente descobrir que a célula evoluiu enzimas para gerir essas estruturas. Uma tal enzima é G4 Resolvase1 (G4R1; também chamado RHAU e DHX36), o que foi caracterizado como a fonte da maioria da actividade resolver G4-ADN em tetramolecular (HeLa) ¹⁰ células humanas. Desde então, tem sido demonstrado THAt G4R1 liga firmemente e cataliticamente desenrola G4-DNA tetramolecular e unimolecular e G4-RNA com as mais apertadas KDs relatada para uma proteína de ligação G4 ^{11, 12, 13.} Além disso, a actividade de resolução de G4 do G4R1 tem sido implicada numa ampla gama de processos bioquímicos e celulares, incluindo a dos telómeros / telomerase Biology ^{11, 14, 15, 16,} transcrição e de emenda ^{17, 18, 19, 20,} de desenvolvimento ^21, hematopoiese ²¹ e imune regulação ^{22, 23.} Com uma preponderância de sequências G4 especificamente situado ao longo do genoma e a diversidade p celularrocesses que G4R1 recentemente foi implicado por estar envolvido com, a capacidade de expressar e eficiente purificar altamente ativa rG4R1 será da maior importância para a elucidação dos mecanismos bioquímicos e comportamentos desta proteína.

Aqui, nós demonstramos uma expressão nova e esquema de purificação (Figura 1) que tira proveito da, atividade de resolução de G4 dependente de ATP rG4R1 para isolar eficiente enzima ativa. Este esquema pode ser adaptado para purificar outras enzimas de ácidos nucleicos dependentes de ATP para o qual o produto da reacção enzimática não é mais um substrato para a ligação, como é o caso para G4R1.

Protocolo

1. Preparação de estruturas de ADN G4 a ser utilizado para a purificação de rG4R1 (Formação de ADN biotinilado G4-G-Quadruplex)

1. Encomendar o seguinte oligômero DNA, chamado Z33-Bio, em uma escala �ole 1: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'. Assegure-se que a porção de biotina está na extremidade 3 'do oligómero.
2. Preparar tampão 10x G4: Tris-HCl a 450, pH 8, EDTA 25 mM, e NaCl 2500 mM.
3. Ressuspender o oligómero Z33 em 250 mL de água (de modo que a concentração oligómero é ~ 2,5 mM). Adicionar 25 ul de tampão 10X G4 e misturar. Incubar o oligómero a 50 ° C durante ~ 48 h.
4. Resumidamente girar o tubo para recolher a condensação (~ 1.000 xg, 10 s). Adicionar ~ 50 ul de uma massa de alta, polissacárido hidrófilo (30% de Ficoll em H ₂ O) e misturar. Pour um gel de 10% acrilamida / 1x TBE / 10% de glicerol (dimensões de gel: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Uma vez que o gel é polimerizado, lave os poços com TBE 1x e cargao formado Z33-Bio oligômero uniformemente em toda a maior parte do gel (pista carregamento de amostras podem ser visualizados com linhas Schlieren).
   1. Em uma pista no final do gel, carregar uma pequena fracção do oligómero que foi aquecida a 98 ° C durante 10 minutos (isto irá servir como um controle não estruturados), bem como uma pequena quantidade de corante de carregamento de gel noutro pista para monitorar o quão longe o gel foi executado.
5. Use TBE 1x como o tampão de gel de correr e rodar o gel a 120 V até a frente do corante tenha atravessado pelo menos 1/3 do gel.
6. Coloque uma placa de cromatografia em camada fina com a sua face para cima lado áspero em um protetor da folha (ou cubra com filme plástico). Retirar uma das placas de vidro e transferência do gel para a superfície do protector de folha. Desligue as luzes e sombra UV gel (de longo comprimento de onda: 365 nm). Usar uma lâmina de barbear fresco e cortar a faixa G-quadruplex-Z33-Bio, que irá ser visto como sendo executado na parte superior do gel (que tem mobilidade mais lenta) em relação à massa fundidacontrole ed.
7. Coloque a fatia de gel contendo o ADN G4-formada num tubo de 50 mL e adicionar tampão de imersão apenas o suficiente para cobrir a fatia de gel (tampão de imersão consiste em 1/3 do volume de 10x TBE, 1/3 do volume de acetato de sódio saturada, e 1/3 volume de _H2O). Colocar o tubo num banho a 37 ° C incubadora (nonhumidified) e incubar O / N.
8. Transferir a solução para um tubo de 15 mL e adicionar 1/10 do volume de glicogénio (glicogénio estoque a 20 mg / mL em Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 2,5 mM, pH 8, e 0,05% de azida de sódio) e ~ isopropanol 1,2x .
   NOTA: A azida sódica é altamente tóxico, assim use com cuidado!
   1. Misturar e colocar o tubo à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 2 h. Girar o tubo em 2.700 xg numa centrífuga de mesa arrefecida a 4 ° C durante 12 min. Suavemente decantar a solução do G4-ADN sedimentado. Lava-se a pelete 3 vezes com EtOH a 70% + 50 mM de NaCl (o sal na lavagem é crítica para a estabilidade G4). Wick o excesso de líquido com papel de tecido que não solte fiapos.
9. Lugar, colocaro sedimento lavado no frigorífico durante pelo menos 2 horas para hidratar o sedimento e permitem a ressuspensão fácil. Ressuspender o sedimento em 50 mL de tampão TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 50 mM, e 0,05 mM de EDTA, pH 8).
10. Coloque 5 mL deste ADN G-quadruplex formado em 495 mL de H ₂ O e quantificar, usando um espectrofotómetro, que permite que o coeficiente de extinção a ser determinada introduzindo a composição de nucleótidos do oligómero (o coeficiente de extinção do oligómero de ADN Z33 com um composição de base de A = 8, C = 3, G = 15, e T = 7 é 341.946 L / mol / cm). Digite o fator de diluição como 25 (não 100), como o formado G-quadruplex consiste em 4 fitas de DNA.
11. Alíquota o volume equivalente de 3 ODS (OD ₂₆₀ unidades) por tubo e armazenar a -20 ° C; Por exemplo, se as 5 mL, que foram adicionados a 495 mL de _H2O dá uma OD ₂₆₀ de leitura 3, em seguida, preparar aliquotas de 5 uL.

2. Preparação de estruturas de ADN G4 para ser utilizado num ensaio Actividade Enzimática de rG4R1 (Formação de TAMRA-rotulados G4-ADN)

1. Encomendar o seguinte oligômero DNA, chamado Z33-TAM, em uma escala �ole 1: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Assegure-se que a porção TAMRA está na extremidade 5 'do oligómero.
2. Seguir o mesmo processo como descrito na Secção 1 para a formação do G-quadruplex, excepto que a luz ultravioleta (UV) sombreamento não é necessário porque o tetrametilrodamina (TAMRA) marcado com G-quadruplex será facilmente visível a olho nu. Mais uma vez, certifique-se de incluir um controle derretida no gel.
3. Depois de tomar uma leitura do espectrofotómetro ADN G-quadruplex TAMRA-marcado, tal como no passo 1, dilui-se a G-quadruplex formada para 0,2 pmol / uL com tampão TNE. Finalmente, adicionar glicerol a uma concentração final de 10% e armazenar a -20 ° C.

3. Transformar (DE3) pLysS competentes com PTRiEx4-DHX36 (plasmídeo G4R1 Humano) e crescer / Induzir grandes culturas bacterianas

1. Obter o plasmídeo TriEx4-DHX36.
2. Alíquota as bactérias em alíquotas de 20 ul e armazená-las a -80 ° C. Alíquota o meio SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, _MgCl2 10 mM, _MgSO4 10 mM e glucose 20 mM) em 80 mL alíquotas e armazenar a -80 ° C.
3. Prepare carbenicilina (CARB) / cloranfenicol (CAM) placas de LB-agar. As concentrações de Stock de carb e CAM são de 50 mg / ml em H ₂ O e 35 mg / mL em EtOH a 70%, respectivamente, e estes são 1.000x concentrada; Assim, as concentrações finais nas placas de selecção de agar LB 50 ug / mL e 35 ug / ml, respectivamente.
4. Colocar uma alíquota de bactérias em gelo e coloque uma alíquota de meio SOC à TA. Adicionar 1 ug de plasmídeo pTriEx4-DHX36 para as bactérias e agite suavemente com a ponta da pipeta para misturar. Incubar em gelo durante mais 5 min e em seguida choque térmico a 42 & #176; C durante 30 s. Colocar em gelo durante 2 min e adicionar o meio SOC.
5. Placa as bactérias transformadas sobre placas de selecção pré-aquecida (tipicamente, placa um pequeno volume, tal como 5 - 10 mL, para garantir a baixa densidade de colónia de modo que as colónias individuais podem ser facilmente em grandes culturas inoculadas) e incubar a 37 ° CO / N.
6. Prepare Terrific Broth de acordo com as instruções do fabricante ^24. Faça 500 ml por frasco grande (certifique-se de adicionar glicerol) e autoclave em um ciclo líquida curta.
7. Adicionar CARB / CAM (50 ug / mL / 35 ng / mL) para o caldo e depois inocular as culturas de agar, tendo tampões (usando uma pipeta P1000) contendo uma única colónia bacteriana e pipetando para o caldo. Agitar as culturas vigorosamente para arejar-los e, em seguida, incubar as culturas a 37 ° CO / N sem agitação.
8. No dia seguinte, coloque as culturas em um agitador C 37 ° e agitar a ~ 225 rpm. Crescem as culturas até o OD ₆₀₀ é cerca de 0,4 -0,6, que irá tipicamente ter cerca de 4-6 horas, dependendo da densidade celular inicial.
   NOTA: Isto irá exigir um acompanhamento densidade periódica através de leituras espectrofotométricas, e isso é fundamental para não crescem as culturas a muito acima de 0,5 ods. Como um branco para leituras espectrofotométricas, girar para baixo 1 ml de bactérias e utilizar o caldo clarificado como a solução de apagamento.
9. Uma vez que a OD ₆₀₀ adequada é obtida, colocar imediatamente as culturas em gelo e rapidamente arrefecer os a 10 ° C. Monitorar a temperatura usando um termômetro limpo com etanol 70%. Acelerar o resfriamento girando rapidamente os frascos, enquanto no gelo, pois isso irá limitar ainda mais o crescimento bacteriano antes da indução de proteínas recombinantes.
10. Adicionar IPTG até uma concentração final de 1 mM (~ 120 mg / 500 mL de cultura) e em seguida, agitar a 80 rpm a 14 ° C durante ~ 17-18 h. A temperatura ideal para a indução da proteína foi encontrada para ser 14 ° C; para melhor atingir isso, use um agitador loc banho de água arrefecidaado numa sala fria convencional e verificar manualmente a temperatura do banho de água com um termómetro.
    NOTA: Como alternativa, usar um refrigerado a ar agitador / incubadora, embora seja necessário testar o digitalmente-set ajuste de temperatura irá produzir a temperatura do líquido desejada (teste esta por incubação num balão de água com um termómetro nele e agitação a 80 rpm por algumas horas, ajustando a temperatura digital de definição de acordo até 14 ° C é atingida).
11. Coloque as culturas no gelo e resfriá-los rapidamente, como no passo 3.9. Dê uma pequena alíquota de bactérias e tomar um OD ₆₀₀ leitura; idealmente, as culturas terá dobrado durante a indução até cerca de 0,8-1,2 OD _600.
12. Transferir as bactérias para 500 tubos mL de centrífuga e equilibrá-los manualmente usando cultura bacteriana para equilibrar o peso entre os tubos. Uma vez equilibrado, centrifugar-los em 3840 xg durante 20 min a 4 ° C. Deitar fora o caldo clarificado e congelar a pel bacterianadeixa-se a -80 ° C até ao momento da purificação de proteínas.

4. Purificação de rG4R1 Humana

1. Descongelar e lisar peletes bacterianas.
   1. Descongelar o sedimento bacteriano em 3 ml de tampão TN à TA (tampão TN consiste em Tris 100 mM, pH 7,5 e NaCl 50 mM). Manter as garrafas na mão e agite para descongelar / colocar o agregado bacteriano. Uma vez descongeladas e de modo relativamente uniforme suspenso, levar o volume até 5 ml com tampão TN (nova suspensão pode ser realizado através pipetando para cima e para baixo com uma pipeta 5).
      NOTA: É típico para descongelar / prep 2 ou 4 garrafas no dia da preparação, dependendo do nível do usuário de conforto com o procedimento de purificação.
   2. Dissolve-se 20 mg de lisozima em 250 mL de H ₂ O (por cultura) e para adicionar as bactérias em suspensão. Permitir que a lisozima de digerir as bactérias para ~ 5 - 10 min enquanto agita as garrafas na mão.
      NOTA: A cor do SUSpensão começará a clarear um pouco como a digestão prossegue, e a suspensão será relativamente não-viscoso. Se as culturas forem demasiado cheio (isto é, muito maior do que 1,2 OD _600), em seguida, ADN cromossómico bacteriano pode causar viscosidade indesejável nesta fase.
   3. Adicionar 250 uL de mistura de inibidores de protease (PIC) e uma alíquota de 10 uL de leupeptina. Homogeneizar.
   4. Coloque no gelo e adicione 10 ml de tampão TN fria e 22 mL de BME. Transferir para um tubo de 50 mL.
   5. Sonicate as bactérias no gelo com um sonicador digitais definido para 30% da amplitude. Pulso em 2 s ON e 2 s OFF durante 1 min. Repetir a sonicação 3 vezes, permitindo que as amostras a arrefecer em gelo durante pelo menos 2 minutos entre as etapas de sonicação.
      NOTA: Com múltiplas culturas, sonicate um de cada vez antes de repetir as iterações de sonicação. Durante sonicação, ter o cuidado de manter a ponta sonicação suficientemente submerso no lisado bacteriano, mas não tocar the os lados do tubo, como isso vai gerar calor em excesso.
   6. Adicionar um volume igual (15 ml) frio de SSC 4x + 20 ul de BME + 50 uL de uma aliquota + PIC de leupeptina e misturar.
   7. Em uma centrífuga de mesa pré-arrefecida a 4 ° C, centrifugar os lisados ​​a 2.300 xg durante 20 min. Transferir o sobrenadante para tubos frescos 50, pré-arrefecida ml (um tubo por grande cultura a ser preparado).
2. Prepare esferas G4-magnético.
   1. Tome 1 mL de talão estreptavidina paramagnética (SPB) suspensão (por 1 L de cultura) e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. SPB sedimentar as com um magneto e lavar 2x com SSC 2x + EDTA 5 mM, pH 8. Ressuspender o SPB lavados em 200 mL da mesma solução usada para a lavagem das pérolas.
   2. Adicionar um 3 OD alíquota de-DNA G4 (Z33-Bio G4 preparada no ponto 1) para a suspensão SPB e misture rapidamente pipetando cima e para baixo várias vezes. Colocar os tubos num rotor gire e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos (e até 60 minutos).
   3. à réer esse período de rotação, bloquear o SPB-bound G4, adicionando 1 ml de 0,4% de lactalbumina, e manter em gelo até ser necessária. Dilui-se a lactalbumina a 0,4% a partir do estoque de lactalbumina 4% usando 1x Tris-glicina.
      NOTA: O% lactalbumina estoque 4 (w / v) é inicialmente preparado por dissolução em 2 M de glicina, pH 7,5, com a adição posterior de 1x PIC e 0,05% de azida de sódio.
3. Bind histidina marcada com rG4R1 a contas de cobalto (CB) (continuação da etapa 4.1).
   1. Adicionar 1 mL de lama de CB (equivalente a um volume de cordão 0,5 mL) a cada tubo de 50 ml contendo lisado clarificado bacteriana. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo.
      NOTA: o volume do grânulo de 0,5 mL é utilizado por 1 L de lisado clarificado; por exemplo, se dois 500 culturas bacterianas mL são preparadas, só adicionar CB para o tubo de 50 mL contendo lisado clarificado a partir de uma das culturas a este ponto, como o lisado a partir da segunda cultura vai ser ligado em série com a mesma 0,5 ml de CB em rep 4.3.3).
   2. Girar CB a 110 xg durante 5 min num 4 ° C mesa centrífuga. Aspirar o líquido cuidadosamente, e deixar um par mL de líquido de modo a não perturbar a CB sedimentadas. Lavar com 10-15 mL de frio 4x SSC + BME (0,5 mL de BME / mL de 4x SSC).
      NOTA: Para as lavagens, verter a 10-15 ml directamente sobre as pérolas peletizadas de cobalto em vez de pipetagem, aquando da pipetagem fará com que os grânulos para ficar preso para o interior da pipeta e a proteína irá ser perdida.
   3. Agregar a CB novamente através de centrifugação e em seguida despeje a próxima ligado clarificado (30 mL, representando a ^2ª grande cultura bacteriana induzida) na CB peletizada. Incubar durante mais 20 min a RT no rotor e, em seguida, lavar duas vezes com 10-15 mL de 4x SSC + BME. Pelete a 110 xg durante 5 min a 4 ° C.
   4. Após a segunda lavagem, aspirar o líquido e deixar cerca de 2 mL de grânulos / líquido na parte inferior do tubo. Transferir a CB ligado às proteínas para um tubo pré-arrefecida de 2 ml pelausando um 1 mL "wide-bore" ponta da pipeta.
      NOTA: Usar uma lâmina de barbear para cortar fresco a fim de a ponta antes da transferência, tal como o uso desta "grande calibre" ponta de pipeta irá reduzir a perda de pérolas de cobalto ligado a proteína.
   5. Resumidamente centrifugar as esferas no tubo de 2 mL em alta velocidade (~ 18.000 xg) numa microcentrífuga a 4 ° C (~ 5 - 10 s é tudo o que é necessário para a granulação rápida). Remova cuidadosamente e descartar o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perder o CB ligado às proteínas.
4. Eluir rG4R1 de CB.
   1. Incubar a CB em 0,5 ml de tampão de eluição histidina (Hb) num agitador rotativo durante 5 minutos numa sala fria. Mais uma vez, quando se adiciona HEB, apenas os 0,5 ml pipeta sobre as esferas (para eliminar a perda de CB) e ressuspender as esferas invertendo o tubo. HB é de 0,7 M de L-histidina pH 6 (o pH é ajustado com ácido acético).
   2. Centrifuga-se a 18000 xg numa microcentrífuga a 4 ° C durante 1 min. Transferir o sobrenadantea um pré-arrefecida tubo de 15 ml. Suavemente remover e transferir o sobrenadante que continha a proteína por pipetagem cuidadosa, deixando uma pequena quantidade de líquido na parte superior do CB.
   3. Repita os passos 4.4.1 e 4.4.2 para um total de 3 eluições HEB.
   4. Elui-se uma vez com 0,2 M de EDTA, pH 6,0; a cor do CB irá mudar de cor de rosa para branco como o EDTA quela o cobalto.
   5. Depois desta quarta e última eluição foi transferido para o tubo de 15 ml, pipetar o tampão de eluição a partir do CB residual utilizando uma ponta de gel de carga na extremidade de uma pipeta de 1 mL de ponta; mergulhando a ponta para a parte inferior do tubo, de tampão de eluição contendo a proteína residual pode ser recolhido.
5. Ligam-se a rG4R1 SPB-bound G4 e eluir a enzima recombinante de uma forma dependente de ATP.
   1. Prepare Res 5x Tampão: 250 mM de Tris-acetato, pH 7,8, NaCl 250 mM, MgCl ₂ 2,5 mM e glicerol a 50%. Preparar tampão de 3x Res: 0,915 mL de _H2O, 2 mL de 5x Tampão Res, 0,33 mL de 0,4% de lactalbumina (diluted de 4% de lactalbumina com 1x Tris-glicina), 0,010 mL de BME, 0,015 mL de 1 M _{de MgCl2,} 0,050 mL de PIC, e 0,010 mL de leupeptina. Manter em gelo.
      NOTA: O% lactalbumina estoque 4 (w / v) é inicialmente preparado por dissolução em 2 M de glicina, pH 7,5, com a adição posterior de 1x PIC e 0,05% de azida de sódio.
   2. Pellet G4-SPB para o lado do tubo com um magnete e desprezar o sobrenadante (G4-SPB, tal como preparado no passo 4.2). Adicionar 1 ml de 3x Tampão Res ao G4-SPB e pipeta para misturar.
   3. Pipetar este 1 mL de G4-SPB suspensas em tampão 3x Res para dentro do tubo 15 mL contendo ~ 2 mL de HB / EDTA contendo proteína (eluato a partir do passo 4.4). Incubar por 15 min em um 37 ° C banho de água com agitação ocasional para que as esferas não se contentar.
   4. Em gelo, sedimentar a proteína ligada a G4-SPB para o lado do tubo com um íman. Para lavar, adicionar 1 mL de 4x SSC +% lactalbumina 0,4 (+ 0,5 mL / mL BME) e pipeta para voltar a suspender as esferas. grânulos de pellets com tele ímã em gelo. Repita esta lavagem para um total de 2 lavagens.
      NOTA: A paciência é necessária durante o processo de lavagem para assegurar que todas as pérolas magnéticas foram sedimentadas entre lavagens. Isto é especialmente verdadeiro tendo em conta o aumento da viscosidade da solução, devido ao glicerol contido nos buffers Res.
   5. Lava-se a G4-SPB 1x com 1 ml de tampão de 3x Res.
   6. Preparar tampão de eluição (EB): 0,5 mL de Tampão de 3x Res, 0,1 mL de 0,1 M de ATP e 0,4 mL de H ₂ O.
   7. Pré-aquecido 1 ml de EB para 37 ° C em tubos de PCR distribuídos em todo o bloco de aquecimento de um termociclador ajustado para 37 ° C.
   8. Pellet G4-SPB com o íman em gelo e voltar a suspender as pérolas em 100 mL de EB pré-aquecido. Imediatamente transferir os grânulos a um tubo de PCR pré-aquecido e incubar durante 30 s a 37 ° C.
   9. Prontamente adicionar 12 mL de NaCl 5 M e pipeta cima e para baixo vigorosamente 20 - 30 vezes. A combinação da elevada de sal e ATP contido no EBserve para eluir rG4R1 das G4-grânulos.
      NOTA: É muito importante para minimizar o número de bolhas formadas durante o processo de pipetagem, como as bolhas podem desnaturar a proteína.
   10. sedimentar imediatamente o G4-SPB com um ímã e transferir o eluato contendo proteína para um tubo de PCR fresco no gelo (rotulados com a data).
   11. Repetir a eluição e transferência descrito nos passos 4.5.8-4.5.10; o produto final deste processo é, portanto, ~ 200 mL de EB contendo purificados rG4R1. Separe duas 7 mL alíquotas (em tubos de PCR marcados com a data adequada) para uso no ensaio de actividade enzimática de controle de qualidade que irá testar se rG4R1 altamente ativa, de fato foi purificado.
   12. Armazenar o rG4R1 purificado a -80 ° C até ao momento do ensaio de actividade.

5. Controle de Qualidade enzimática Ensaio de Actividade de Purificada rG4R1

1. Para cada preparação de rG4R1 a ser ensaiada, preparar 300 uLde tampão de ensaio resolvase (RAB), onde cada um contém 30 mL de 0,2 pmol de ADN G4-Z33 TAMRA-rotulado (preparada na etapa 2); a composição do RAB é como se segue: 0,1 ml de Tampão 3x Res, 0,01 mL de 0,2 pmol / uL G4-Z33-TAM, 0,03 mL de ATP 0,1 M e 0,16 mL de H ₂ O. Em uma faixa de 6 de PCR tubos de pipetas, 40 mL de RAB para dentro do primeiro tubo e 30 ul de RAB para os restantes tubos (manter os tubos em gelo, neste ponto).
2. Recuperar uma das alíquotas de 7 mL rG4R1 (do passo 4.5.11) e colocá-lo em gelo. Com uma pipeta de p20 ajustado para 5 uL, gentilmente pipeta cima e para baixo algumas vezes para misturar o rG4R1 na alíquota e de transferência 5 uL ao primeiro tubo da tira de 6 tubos de PCR (aquele que contém 40 mL de RAB). Em seguida, defina a pipeta de 10 mL e transferir serialmente 10 mL para os tubos de PCR restantes contendo RAB.
3. Incubar imediatamente esta tira de tubos de PCR a 37 ° C durante 30 minutos num termociclador, seguidos por uma espera 4 ° C.Abrir os tubos, enquanto eles estão a ser realizadas a 4 ° C e adiciona-2 ul de EDTA 0,5 M pH 8 para cada tubo (para parar a reacção enzimática).
4. Pour um gel de TBE / 10% de glicerol a 10% de acrilamida / 1x. Depois de retirar o pente, lave os poços com TBE 1x. Adicionar 5 uL de uma massa de alta, polissacárido hidrófilo (30% de Ficoll em H ₂ O) a cada tubo e da carga 15 ul de cada tubo (a carga de poços pode ser novamente observada com linhas Schlieren).
   1. Como um controlo para a mobilidade de ADN G4, adicionar 4 mL de uma massa elevada, polissacárido hidrofílico para 20 mL de RAB, e carga de 15 ul; como um controlo para desenrolada Z33 monomérica, de calor 20 mL de RAB a 98 ° C durante 10 min, adicionar 4 mL de uma massa elevada, polissacárido hidrófilo, e carga de 15 ul.
5. Submeter o gel a 120 V durante 2 horas com TBE 1x como o tampão de corrida. Imagem do gel em um imager multimodal com capacidade de fluorescência de geração de imagens usando filtros TAMRA-específico (excitar com um laser verde nm 532 e usar um 58banda 0 nm passar 30 filtro (580 BP 30)).
   NOTA: Uma preparação altamente activa de rG4R1 irá produzir a resolução completa de Z33 TAMRA-marcado nas 3 primeiras pistas que foram carregados sobre o gel, como se mostra na Figura 2.

6. Agrupamento de Highly Active rG4R1 Preps, alíquotas, e Armazenamento

NOTA: Este passo requer 2 pessoas. O número e requisitos enzimáticas dos ensaios a jusante que o rG4R1 purificado serão utilizados em vai determinar quantos preparações são necessários antes de alíquotas. Uma preparação típica grande consiste no agrupamento de 8 preparações altamente activa (utilizando, portanto, um total de 16 culturas bacterianas induzidas 500 ml), mas este é um número arbitrário e é específico do laboratório.

1. Calcular o volume total de rG4R1 altamente activos, purificada que é para ser aliquotado. Tipicamente, 7 mL alíquotas são utilizados em ensaios de jusante. Encha o bloco de um CYCL térmicaer definido para 4 ° C com os tubos de PCR tira (estes serão divididas em alíquotas para, como a natureza sólida do bloco irá acelerar o fechamento rápido das tiras de PCR).
2. Recuperar os tubos de PCR contendo rG4R1 altamente ativa de -80 ° C e rapidamente descongelar os tubos na mão; quando uma pequena quantidade de gelo é deixado no tubo, colocar os tubos em gelo. Combinar todos os preparativos rapidamente descongelado em um, 15 tubo prechilled mL e misture bem, certificando-se de minimizar bolhas.
3. Usando uma pipeta de repetição automática, dispensar o volume da alíquota desejado no pré-refrigerada tira tubos de PCR no ciclizador térmico. Assim que 1 - 2 tiras são concluídas, tem a segunda pessoa feche as tampas e transferi-los para wafers de 96 poços que estão flutuando em nitrogênio líquido (flash congelamento é necessário para preservar a atividade enzimática).
   NOTA: Não tome mais do que cerca de 200 mL de rG4R1 para a ponta da pipeta automática numa altura para reduzir o tempo que a enzima não é de 4° C.
4. Uma vez que os tubos previamente arrefecido de tira de PCR no ciclizador térmico ter sido preenchido com alíquotas e congelada adequadamente, transferir rapidamente os tubos de PCR mais tiras pré-refrigerada de gelo para o termociclador e continuar alíquotas. Continuar desta forma até que o restante da enzima foi aliquotada, rapidamente congelados em azoto líquido, e transferido para gelo seco. Finalmente, transferir as aliquotas a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

7. Quantificação de Purificada Concentração rG4R1

1. Despeje um padrão de 5% de empilhamento / 12% resolver acrilamida gel / SDS para a separação de proteínas.
2. Thaw cerca de 50 mL de rG4R1 alíquotas, combinam em um tubo, e misture bem. Medir o volume exacto com uma pipeta e adicionar uma quantidade igual de tampão de amostra 2x Laemmli (Tris-HCl 65,8 pH 6,8, 26,3% (w v) de glicerol /, 2,1% SDS, e 0,02% de azul de bromofenol) + BME (50 uL / 950 uL de tampão de Laemmli 2x). Desnaturar a proteína a 98 ° C durante 10 min.
3. Preparar diluições de marcadores de PM de gama alargada em tampão de amostra 1x + BME de tal modo que as seguintes quantidades de proteínas podem ser carregadas no gel como padrão: 31,3, 62,5, 125, 250, e 500 ng.
   NOTA: Cada padrão de proteína contida nos marcadores de PM de gama alargada está presente a 0,1 mg / mL, excepto para a proteína de 50 kDa, o qual está presente a 0,3 mg / mL. Estes marcadores não precisa ser calor-desnaturado.
4. Remover o pente do gel e lave os poços com tampão de corrida / glicina SDS 1x padrão. Carregar o equivalente de 25 e 12,5 mL de rG4R1 (que é de 50 e 25 uL de proteína desnaturada), embora o volume óptimo da enzima a carga deve ser determinada pelo utilizador, como a concentração das preparações enzimáticas irá variar (por exemplo, 35 mL foi carregado no gel na Figura 3). Carregar os padrões proteicos preparados na etapa 7.3. Certifique-se de que as pipetas estão devidamente calibrado, e certifique-se de ser tão precisa quanto possible com técnica de pipetagem para assegurar a quantificação exacta.
5. Submeter o gel a 120 V até a frente do corante tiver percorrido cerca de 2/3 do gel (para assegurar uma separação adequada das proteínas que constituem os marcadores de largo espectro MW).
6. Remover o gel e dispor da porção do gel que não contêm proteína, cortando-a com uma lâmina de barbear. Coloque o gel em uma caçarola de vidro ou um recipiente equivalente. Corar o gel com corante Coomassie (50 mg de Coomassie R-250 por 100 mL de 50:10:40 v / v de metanol: ácido acético: _H2O que foi filtrada através de um funil de filtro de papel) O / N à TA num conjunto agitador orbital de assegurar agitação adequada do gel.
7. De-manchar o gel com 30:10:60 v / v metanol: ácido acético: _H2O usando balled-up, papel de tecido que não solte fiapos para agilizar descoloração. Alterar a solução de descoloração, conforme necessário. Continue descoloração até que o fundo é suficientemente baixo para visualizar padrões rG4R1 e proteína; um gel típico nestefase é mostrado na Figura 3.
8. Coloque o gel descorados entre um protetor da folha e digitalizar o gel a resolução ≥300 dpi. Abra a imagem digitalizada em um programa de imagem de software de análise (como Fuji Multiguage ou equivalente) e preparar curvas padrão a partir dos padrões de proteínas que correspondem a 75, 100 e 150 kDa (as curvas representam os valores gram contra leituras densitométricos). Certifique-se de subtrair o fundo de cada pista a ser quantificados durante o processo de obtenção de valores densitométricos.
9. Supondo que a quantidade de volume de rG4R1 que foi carregada sobre o gel contém uma quantidade de proteína que está dentro da gama linear das curvas padrão, a quantidade de proteína por grama de microlitro rG4R1 carregados podem ser extrapolados.
10. Converter a quantidade de gramas extrapolada rG4R1 em uma quantidade molar com o peso molecular de G4R1, que é de 120.000 g / mol.
    NOTA: Para cada gel, três valores extrapolados serágerado (um para cada um dos três marcadores proteicos utilizados para gerar as curvas padrão: 75, 100, e 150 kDa). Executar mais dois géis e mancha e quantificá-los, repetindo os passos 7,1-7,10. Com os resultados de quantificação para o primeiro gel, o utilizador irá ser capaz de medir quanto rG4R1 precisa de ser carregado em géis mais para se obter um valor que se encontra dentro do intervalo linear de os padrões de proteína. No total, nove extrapolar os valores que representam a concentração de altamente activo, rG4R1 purificada. Calcular a média destes valores para dar a concentração rG4R1 específica do lote final, que é tipicamente na gama de 20-100 nM. Calcular o desvio padrão a partir destes valores (n = 9).

Resultados

Este protocolo (Figura 1) rotineiramente produz quase puro, rG4R1 cataliticamente ativo. Como uma medida da actividade enzimática, que é tipicamente observado que 50% de 0,2 pmol de G4-ADN tetramolecular TAMRA-marcado é convertido em monómeros dentro do 0,2 - gama uL 0,013 de rG4R1, como ensaiado pelo ensaio de actividade G4 acima referido (Figura 2). Coloração com Coomassie de rG4R1 purificada indica uma única banda no 120 tamanho esperado kDa, com uma banda contaminante menor a...

Discussão

Este protocolo representa uma expressão, purificação e quantificação regime altamente eficiente para o isolamento do produto do gene DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, também chamado RHAU e DHX36) (Figura 1). Este protocolo utiliza dois passos de purificação: His-tag de purificação por afinidade em esferas de afinidade de cobalto e purificação enzimática em grânulos-G4-ADN conjugado. O último passo é o único que aproveita a afinidade apertado, alta especificidade e atividade catalítica desenr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (from chicken egg white)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7	Universal Scientific Supply Co.	1966	or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8			For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8			For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	or from standard source
70% Ethanol			From standard source
Magnesium chloride (1 M solution)	Life Technologies	AM9530G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptin hemisulfate	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidin paramagnetic beads	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	0718	or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6	Universal Scientific Supply Co.		From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)	Sigma-Aldrich	L5385
Cobalt metal affinity beads	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Universal Scientific Supply Co.	1667	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	or from standard source
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV lamp			Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)			Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge			Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath			For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria			For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria			For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer			capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer			From standard source
PCR strip tubes			From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene)			From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)			From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene)	Thermo Scientific	3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes			From standard source
Gel-loading tips			From standard source
Automatic repeating pipette			For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler			From standard source
Liquid Nitrogen			From standard source
Dry ice			From standard source
Laemlli sample buffer	Biorad	161-0737
Apparatus for running large slab gels	Biorad		We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet	Life Technologies	12301D	We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades			From standard source
Filter paper and funnel			From standard source
Glass casserole dish			From standard source
Orbital shaker			From standard source
Kimwipes			From standard source
Clear sheet protectors			From standard source
Scanner and associated TWAIN software			From standard source
Image analysis software			Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel			Or equivalent