Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

Özet

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Özet

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Giriş

CD4 ⁺ T hücreleri adaptif bağışıklık tepkisinin önemli Orkestraya bulunmaktadır. Naif CD4 ⁺ T hücreleri, birkaç farklı efektör T hücrelerinin (örneğin Th 1, Th2 Th17, vs.) halinde gelişme yetisine sahip olan, yerel mikro ¹ bağlı olarak karakteristik bir sitokinler ve transkripsiyon faktörleri, kendi seti, her biri. T hücreleri yapmak soy kararları kendine hem koruyucu bağışıklığın ve hoşgörü için önemlidir. Th17 hücreleri hücre-dışı bakteriler ve mantarlar ile mücadele için bilinen T hücrelerinin bir alt kümesi, ancak bunların uygun olmayan tepkiler aynı zamanda, mültipl skleroz ve psoriasisin ^{2, 3} gibi çok otoimmün ve inflamatuar hastalıkların patogeneziyle edilir. İnsan Th17 hücreleri uygun bir polarizasyon çevre ⁴ sağlayarak, in vitro olarak naif CD4 ⁺ T hücrelerinden üretilebilir. Vario sitokinlerin bize kombinasyonları, IL-1β, IL-23, TGFp, ve IL-6, insan Th17 hücrelerinin gelişimi için kullanılmıştır. İnsan Th17 hücreleri CCR6 yaygın olarak bu hücre popülasyonu tespit etmek için kullanılır ve esas transkripsiyon faktörü (RORC tarafından kodlanan) RORγt ^{5, 6} ekspresyonu ile tanımlanır bir kemokin reseptörünü eksprese eder. Th17 hücreler birden fazla sitokinleri ifade etme yeteneğine sahiptir, ancak, IL-17A, bu hücreler tarafından üretilen soy tanımlayan efektör sitokindir. Biz, insan Th17 in vitro farklılaşma deneyinde sağlamlığını belirlemek için her üç Th17-ilişkili markörler (CCR6, RORγt IL-17A) ifadesini inceledi. Buna ek olarak, bu, Th17 markerlerin ekspresyonu çok düşük ya da sıfır olması gerektiği için hiçbir sitokinler ya da bloke edici antikorlar, bir negatif kontrol olarak kullanmak için, kültür ortamına ilave edildi olmayan polarizasyon koşulları altında, insan CD4 ⁺ T hücrelerinin kültive edilmiştir.

ve_content "> normal insan T hücresi gelişimini ve biyolojisi okumak için bir yolu, gelişimi esnasında gen ekspresyonunu değiştirmek için. Kısa müdahale RNA (siRNA) protein kodlayıcı mRNA'ları hedefleyebilir ve spesifik gen ekspresyonunu azaltmak için kullanılabilir sentetik küçük RNA molekülleridir . MikroRNA'lar (miRNA'lar) post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu modüle etmek için bilinen bir endojen kodlayıcı olmayan küçük RNA'larıdır. miRNA'lann Th17 hücreleri ^{7, 8, 9,} de dahil olmak üzere, murin ve insan T hücresi biyolojisi hem de önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu gen ifadesi ve nihayetinde insan T hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için insan T hücrelerinde küçük RNA aktivitesini manipüle güvenilir yöntemler olması çok önemlidir. Burada, biz tanıştırmak için geliştirilen bir, kullanımı kolay, tutarlı ve güvenilir protokol açıklar küçük sentetik RNA ve kilitli nükleik asitleri (LNA'lar, kimyasal stabilite artışı olan modifiye edilmiş nükleik asitleri)bağışıklık hücrelerine ve özellikle insan Th17 hücrelerine.

Genel olarak, kimyasal, biyolojik veya fiziksel kategoriye ¹⁰ girer memeli hücrelerine dahil etmek küçük RNA'ların sokulması çeşitli alternatif yöntemler vardır. lipid bazlı transfeksiyonları ve kalsiyum fosfat transfeksiyonlar dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan kimyasal metotlar, daha etkili bir şekilde hücreler tarafından alınır kimyasal DNA kompleksleri temel almaktadır. Genel olarak, kimyasal yöntemler, birincil T hücrelerinin transfeksiyonu için etkili değildir. En yaygın biyolojik yöntem doğrudan doğal replikasyon döngüsünün bir parçası olarak bir konakçıya yabancı RNA ekler bir viral vektör (örneğin, retrovirüs veya lentivirüs) kullanmaktır. Viral transdüksiyon tipik olarak bir proviral plazmid moleküler klonlanması için zaman dahil edilen, özellikle tamamlamak için daha uzun sürer. Buna ek olarak, virüs transdüksiyon vektörleri, insan araştırmacılar için zararlı olabilir. Elektroporasyon fiziksel mNükleik asitler, geçici olarak kendi hedef üzerinde hareket edebilir hücre içine girmesine izin verir, yüksek voltaj darbeleri hücreleri tabi tutulması ile membran geçirgenliği indükleme bu yöntemde. Geleneksel elektroporasyon araçlar primer lenfositler transfekte etmek için etkili değildi. Bununla birlikte, optimum nesil elektroporasyon malzeme küçük RNA'dır Transfekte edilecek, özellikle de çok yüksek bir verimle, T hücrelerini transfekte edebilen olduğu kanıtlanmıştır. Terimi, yeni nesil gevşek geleneksel elektroporasyon makineleri ile iki yeni platformları (örneğin, neon, Amaxa) ayırt etmek için kullanılır. Buna ek olarak, bu yöntem tek bir deneyde yaklaşık 120 küçük RNA, kadar, genellikle geçerli sentetik reaktif maddeler kullanılarak orta derecede verimli taramalara kolayca ölçeklendirilebilir. Önemli olarak, başarılı bir şekilde transfeksiyon, T hücresi aktivasyonundan sonra az 16 olarak saat içinde elde edilebilir. Bu yöntemin dezavantajı, ancak stabil genomik incorporati neden olmamasıdırüzerinde ve dolayısıyla geçicidir. Bu nedenle, bu şekilde bir viral vektör içine paketlenmiş ve başarılı bir şekilde küçük bir RNA uzun süreli ekspresyonu gereken durumlarda T-hücrelerinde ifade edilebilir dengeli bir ifade yapısı oluşturmak için ilave çaba değerdir.

Farklı amaçlarla ^{11, 12, 13} için çeşitli sentetik tek veya çift-sarmallı RNA ya da LNA oligonükleotid araçlar sağlamak için, yeni nesil bir transfeksiyon (örneğin, neon) kullandık. Etkin RNA interferans çift sarmallı kısa karışan RNA (siRNA) kullanılarak primer fare ve insan T-hücrelerinde indüklenebilir. Bu protokol, insan Th17 hücrelerinde bu tekniği kullanarak için optimize koşulları açıklar. siRNA'lar ek olarak, ticari olarak temin edilebilen sentetik MiRNA taklit ve inhibitörler MiRNA kazanç ve fonksiyon kaybı incelemek için kullanılabilir. MiRNA taklit siRNA'lar çok benzer iki-şeritli RNA molekülü, ancak designeEndojen olgun miRNA'lann dizisi ile d. MiRNA inhibitörleri doğal miRNA'lara bağlanan ve fonksiyonunu antagonize RNA ve / veya LNA göre tek zincirli oligonükleotidler kimyasal olarak modifiye edilir. Biz bu araçların tümü dahil, kültürlü birincil T lenfositler etkin kullanılan ancak insan Th17 hücreleri ile sınırlı değildir edilebileceğini bulmuşlardır.

Protokol

Bu protokol, insan araştırma etiği için UCSF yönergelerine uyar.

T Hücre Kültürü, CD4 ⁺ T hücrelerinin elde edilmesi, ve, Th17 polarizasyon hazırlanması 1.

1. Gün 0, CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 1.5 mL ile kat 6 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C.
   1. Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C'de plakalar. parafilm plakaları sarın.
2. üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyan santrifüjü ile kordon kan mononükleer hücreleri (CBMCs) hazırlayın.
   DİKKAT: dikkatle çalışın ve kan yoluyla bulaşan patojenlere maruz kalma riskini önlemek için insan kanı tutarken aşınmış uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) sağlamak.
3. Tek çekirdekli hücreler izole edilmiş ve yıkanmış sonra, negatif sele insan CD4 ⁺ T hücresi izolasyon yerinection ticari bir insan CD4 ⁺ T hücre kiti kullanılarak.
   Not: mononükleer hücre izole edildikten sonra, kırmızı kan hücresi kontaminasyon olması durumunda, isteğe bağlı bir kırmızı kan hücre parçalama, CD4 ⁺ T hücresi izolasyon adımları önce gerçekleştirilebilir. yalıtım tamponu (PBS içinde% 2 FBS) 1 mL mononükleer hücrelerin tekrar. 1x yokedici çözeltisi 5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra pelet hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de izole tamponu ve santrifüj 5 ml.
   1. Yeni 5 mL'lik bir tüp içerisinde izolasyon tamponunda 500 uL başına 50 x 10 ⁶ yoğunluğunda tek çekirdekli hücreleri tekrar.
   2. FBS, 100 uL ve sonra iyice karışana kadar bir orbital çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca 4 ° C 'de, her tüp inkübe tüp başına Antikor Mix 100 uL ekleyin.
   3. İnkübasyondan sonra, Hücreleri yıkamak için izolasyon tamponunda 3-4 ml. pelet hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 300 x g'de hücreleri santrifüjleyin. Dikkatle supe aspirernatant.
   4. Bu dönüş sırasında, manyetik boncuk önceden yıkayın. (1 kullanılmıştır: hücreler ile 1), yeni bir tüp içine manyetik boncuk istenilen miktarda aktarın ve boncuk yıkamak için izolasyon tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin. 1 ml mikropipet kullanılarak İyice karıştırın ve daha sonra en az 1 dakika için mıknatıs tüp yerleştirin. Dikkatle süpernatant aspire. ilk yıkama öncesinde transfer aynı hacimde manyetik boncukları süspanse.
   5. izolasyon tamponunda 500 ul her bir tüp içinde hücrelerin tekrar ve önceden yıkanmış manyetik boncuk 500 uL ekleyin.
   6. iyice karıştırmak için oda sıcaklığında (25 ° C, 18 ° C) bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca manyetik boncuklarla inkübe hücreleri.
   7. İnkübasyondan sonra, iyice 1 ml mikropipet en az 10 kez kullanarak hücreleri pipetleyin. Daha sonra yalıtım tamponu 3-4 ml ilave edilir ve 2 dakika süre ile mıknatıs her tüp yerleştirin.
   8. Dikkatle içindedir olumsuz seçilen CD4 ⁺ T hücreleri transferiyeni bir tüpe yüzer.
4. CD4 ⁺ T hücre izolasyonu tamamlandıktan sonra, hemositometre ile hücrelerin sayısı ve buz üzerinde hücreleri tutun.
5. PBS ile antikor kaplı plakalar iki kez yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa, Th17-polarize edici ortam 1.5 mL 2x karışımı ekleyin: Anti-insan IFN-y (20 ug / ml), anti-insan IL-4 (20 ng / ml), insan TGF (10 ng / ml), insan IL-1β (40 ng / ml) insan IL-23 (40 ng / ml) insan IL-6 (50ng / ml) her 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş serumsuz bir baz ortam (seyreltilmiş 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat ve 100 uM 2-merkaptoetanol).
   Not: Transfeksiyon ve RNA interferans serum ihtiva eden ortam içinde çalışır. Bu protokol ile serumsuz ortam kullanılarak amacı daha, IL-17A üretimini sağlamaktır.
6. Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de insan CD4 ⁺ T hücreleri, topak hücrelere. Dikkatle supernat aspirekarınca. Daha sonra nihai hacim oyuk başına 3 ml ve polarize sitokinler 1x nihai konsantrasyonda şimdi de o kadar başına 1.5 mL içinde 3 x 10 ⁶ bir yoğunlukta hücreler serumsuz baz ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve plaka.
   1. % 5 _CO2, iki gün boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin.

2. Elektroporasyon in vitro Polarize İnsan Th17 Hücreleri

1. 2. günde CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 250 uL ile kat 48 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C.
   1. Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C'de plakalar. parafilm plakaları sarın.
2. Transfeksiyon için küçük RNA'lar hazırlayın. Her transfeksiyon için, bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine bir siRNA 5 uM stok çözeltisi alikosu 1 uL. Uygun kimyasal eşlemeli küçük RNA Contr dahilol. buz üzerinde tüm tüpleri tutun.
3. PBS ile antikor kaplı plakalar iki kez yıkayın. İnsan TGF (5 ng / ml) insan IL-anti-insan IFN-y (10 ug / ml), anti-insan IL-4 (10 ng / ml): O 500 uL 1X her bir oyuğa ortamı Th17-polarize ekleyin 1β (20 ng / ml) insan IL-23 (20 ng / ml) insan IL-6 (25 ng / ml) her 2 mM L-glutamin, 100 U ile takviye edilmiş serumsuz bir baz ortamında (seyreltildi / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat ve 100 uM 2-merkaptoetanol).
4. kültür plakaları ve transfeksiyon reaktifleri hazırlandıktan sonra, 1 ml mikropipet, pipetle hücreler yavaşça ama tüm hücreler kuyularının tabanından ayrılmış sağlamaktan yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri havuzda toplayın.
   NOT: Burada sunulan dört günlük protokolü daha uzun kültür dönemleri için hücreler bu aynı protokolü kullanan her 3 günde yaklaşık transfekte edilmelidir. Adım 2Farklı küçük RNA ile tedavi edilen hücreler toplanmış olmamalıdır çünkü .4 ancak modifiye edilmelidir. test edilen durumların hepsi toplanmış, sayılmış ve ayrıca transfekte edilmesi gerekir.
5. Dikkatle süpernatanı havalandırın, ve daha sonra yıkama PBS en az 1 mL hücreleri tekrar süspansiyon. Ve daha sonra bir mikro santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak (canlılığını değerlendirmek için Tripan Mavi dışlama kullanarak hemositometre ile örneğin) canlı Th17 hücre sayımı.
6. pelet hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin.
7. Dikkatle süpernatanı havalandırın, ve daha sonra mL başına 2.5-4 x 10 ⁷ hücre yoğunluğunda transfeksiyon sistemi 10 uL kit temin yeniden süspansiyon tamponu kullanılarak tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında hücreleri tutun.
   NOT: Bir kural olarak, 30 dakika içinde transfekte edilebilir olarak sadece kadar çok hücreler hazırlamak deneyin. Çoklu toplu karşılaştırılabilir.
8. Her microC küçük RNA'nın 1 uL hücre 9 uL ekleyinentrifuge tüpü. Pipet sonra bir kez verilen pipet elektrot ucu yüklemek hücreler transfeksiyon için ve küçük RNA'ların karıştırın.
   Not: Genellikle, transfeksiyondan önce pipeti elektrot ucu kabarcıklar oluşturmak önlemek için karışımın yeterli olduğundan emin olmak için, hücre süspansiyonunun 9.5 uL ekleyin.
9. Oda sıcaklığında Elektrolitik Tampon E İlan 3 mL pipet istasyon içinde küvet sahip küveti doldurun ve sonra küvet içindeki bir konumda içine pipet yerleştirin.
10. Hemen aşağıdaki parametreler kullanılarak hücreler ve küçük RNA her biri 10 uL karışımı electroporate: Darbe gerilimi 1,500-1,550 V, nabız 10 ms genişlik ve 3 bakliyat transfeksiyon cihazda toplam.
11. elektroporasyon işlemi tamamlandıktan sonra, doğrudan doğruya 1X bir kültür plakasının hazırlanmış kuyu ortamı Th17-polarize 500 uL hücre karışımı ekleyin. % 5 _CO2, iki gün boyunca 37 ° C inkübatör içinde bir yer plakalar.
    NOT: pipetleme pipet elektrot ucu yıkayınyukarı ve aşağı PBS içinde her bir transfeksiyon arasında.

3. Hasat İnsan Th17 Hücreleri

1. hafifçe pipetleme ancak tüm hücreler kuyularının tabanından ayrılmış sağlamak, bir mikropipet ile kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. işlevsel ve / veya gen ekspresyonu deneyleri için hücreler hazırlayın.
   Not: Rutin olarak, yeterli miktarda hücrelerin transfekte Th17 hücreleri tek bir kuyudan elde edilir yüzey işaretleyici ve hücre içi sitokin ve transkripsiyon faktör boyama akış sitometri analizi için veya gen ekspresyon analizi için RNA hazırlanması için kullanılır.

Sonuçlar

Başarılı bir şekilde insan Th17 hücrelerini elektroporat güvenilir bir sistem geliştirmek için ilk adım nitro farklılaşmış insan Th17 hücre kültürlerinde sağlam oluşturmak oldu. Th17-polarize koşullar altında kültür T hücreleri kemokin reseptörü CCR6 ve transkripsiyon faktörü RORγt (Şekil 1A, sol) olarak ifade edilmiştir. T hücreleri (sağ Şekil 1A) olmayan polarizasyon (THN) koşullar altında kültüre ...

Tartışmalar

Bu protokol, insan Th17 hücrelerine küçük RNA verilmesi için geliştirilmiş bir yöntemi temin etmektedir. İnsan Th17 hücreleri burada kullanılmış olsa da, küçük RNA ile elektroporasyon bu yöntem, Th1, Th2 ve Tregs gibi primer insan T yardımcı alt grupları, birlikte kullanılabilir. Hücreler transfeksiyondan önce kültür içinde etkinleştirilmiş olmalıdır böylece saf CD4 ⁺ T hücreleri için, iyi sonuçlar vermemiştir. Bu protokol için, ilk olarak daha iyi bir IL-17A üretimi için...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use