Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

Резюме

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Аннотация

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Введение

CD4 ⁺ Т - клетки являются важными оркестраторами адаптивного иммунного ответа. Наивные CD4 ⁺ Т - клетки способны превращаться в нескольких различных эффекторных Т - клеток (например , Th1, Th2, Th17 и т.д.), каждый со своим собственным набором характерных цитокинов и факторов транскрипции, в зависимости от местного микроокружения ^1. Решения линии преемственности, что Т-клетки составляют критичны как для защитного иммунитета и толерантности к себе. Th17 клетки представляют собой одно подмножество Т - клеток , известных для борьбы с внеклеточных бактерий и грибков, но их неправильные ответы также участвуют в патогенезе множества аутоиммунных и воспалительных заболеваний , таких как рассеянный склероз и псориаз ^{2, 3.} Человеческие клетки Th17 могут быть получены из нативных CD4 ⁺ Т - клеток в пробирке путем предоставления им соответствующей поляризационной среды ^4. Vario нас комбинации цитокинов IL-1β, IL-23, TGF-beta, и IL-6 были использованы для развития клеток Th17 человека. Человек Th17 клетки экспрессируют CCR6, рецептор хемокинов , который обычно используется , чтобы идентифицировать эту популяцию клеток и определяется выражением их основного фактора транскрипции, RORγt (кодируемого) RORC ^{5, 6.} Th17 клетки обладают способностью выражать несколько цитокинов, но IL-17A является родословная определяющего эффектор цитокин, продуцируемый этими клетками. Мы исследовали экспрессию всех трех Th17-ассоциированных маркеров (CCR6, RORγt, IL-17A) для оценки надежности нашего человеческого Th17 в пробирке дифференциации анализа. Кроме того, мы культивировали человеческие CD4 ⁺ Т - клеток в неполяризующих условиях, в которых не добавл ли никакого цитокины или блокирующие антитела к культуральной среде , чтобы использовать в качестве отрицательного контроля , так как экспрессия этих маркеров Th17 должно быть очень низким или отсутствует.

ve_content "> Один из способов изучить нормальное развитие клеток человека T и биологии, чтобы манипулировать экспрессии генов в процессе их развития. Краткосрочные вмешательства РНК (миРНК) представляют собой синтетические небольшие молекулы РНК, которые нацелены на белок-кодирующих мРНК, и могут быть использованы для уменьшения специфической экспрессии гена . MicroRNAs (миРНК) является эндогенным некодирующим малым РНКОМ , известным для модуляции экспрессии гена посттранскрипционно. микроРНК , как было показан , играет важную роль как в мышином и биологии Т - клетки человека, в том числе в Th17 клетках ^{7, 8, 9.} Это очень важно иметь надежные методы манипулирования небольшой РНК-активности в Т-клетках человека, чтобы изучить их влияние на экспрессию генов и в конечном счете на человеческой клеточной биологии T. Здесь мы опишем простой в использовании, последовательный и надежный протокол, который мы разработали для введения небольшой синтетический РНК и запертые нуклеиновые кислоты (МШИТ, химически модифицированные нуклеиновые кислоты с повышенной стабильностью)в клетки иммунной системы, а именно в Th17-клеток человека.

Есть несколько альтернативных способов введения малого РНКА в клетки млекопитающих, которые обычно попадают в химические, биологические или физические категории ^10. Обычно используемые химические методы, в том числе на основе липидов и трансфекций кальция-фосфатной трансфекции, полагаются на создание комплексов химико-ДНК, которые более эффективно поглощаются клетками. В общем, химические методы не являются столь эффективными для трансфекции первичных Т-клеток. Наиболее распространенный биологический метод является использование вирусного вектора (например , ретровирус или лентивирус), который непосредственно вставляет внешний РНК в хозяин в качестве части своего естественного цикла репликации. Вирусные трансдукции, как правило, занимает больше времени, чтобы закончить, особенно когда факторы во время для молекулярного клонирования провирусных плазмид. Кроме того, вирусные векторы трансдукции могут быть потенциально опасными для человека исследователей. Электропорация является физическим менит индуцировать мембраны пермеабилизации, подвергая клетки воздействия высоких импульсов напряжения, позволяя нуклеиновые кислоты, чтобы транзиторно войти в камеру, где они могут действовать на своей цели. Традиционные электропорации инструменты не являются эффективными для трансфекции первичных лимфоцитов. Тем не менее, оптимизированная для следующего поколения электропорации, оказалось способной трансфекция Т-клеток при очень высокой эффективности, особенно когда материал для трансфекции мал РНК. Термин следующего поколения свободно используется , чтобы различать две новые платформы (например, неоновые, Amaxa) от традиционных электропорации машин. Кроме того, этот метод легко масштабируется для умеренных экранов пропускной способности с до приблизительно 120 малых РНК в одном эксперименте, часто с использованием проверенных синтетических реагентов. Важно отметить, что успешная трансфекция может быть достигнута в качестве всего лишь 16 ч после активации Т-клеток. Недостаток этого способа, однако, является то, что она не приводит к стабильной геномной incorporatiна, и поэтому преходяще. Следовательно, стоит дополнительных усилия, чтобы создать стабильную экспрессирующую конструкцию, которая может быть упакована в вирусный вектор и успешно высказанную в Т-клетках в тех случаях, когда требуется долгосрочное выражение малой РНК.

Мы использовали следующее поколение трансфекции (например, неон) для доставки различных синтетических одно- или двухцепочечных РНК или МШАТ олигонуклеотидных инструментов для различных целей ^{11, 12, 13.} Эффективное РНК-интерференции может быть вызван в первичной мыши и Т-клеток человека с помощью двухцепочечной короткого вмешательства РНК (миРНК). Этот протокол описывает оптимизированные условия для использования этого метода в клетках Th17 человека. В дополнении к киРНКу, коммерчески доступный синтетический микроРНК подражает и ингибиторы могут быть использованы для изучения усиления микроРНКа и потери функции. микроРНК имитирует являются двухцепочечной молекулы РНК, очень похожие на киРНК, но Дизайнд с последовательностью эндогенного зрелого микроРНКа. ингибиторы микроРНК химически модифицированной РНК и / или LNA на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, которые связываются с носителями микроРНК и противодействуют их функции. Мы обнаружили, что все эти инструменты могут быть эффективно использованы в культивируемых первичных Т-лимфоцитов, в том числе, но не ограничиваясь клеток Th17 человека.

протокол

Этот протокол придерживается принципов UCSF для исследовательской этики человека.

1. Получение Т - клеточная культура, выделение CD4 ⁺ Т - клетки, и Th17 поляризации

1. На день 0, пальто 6-луночных культуры тканей пластины с 1,5 мл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и анти-CD28 человека (4 мкг / мл) в PBS с кальцием и магнием в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
   1. В качестве альтернативы, слой пластины в течение ночи при 4 ° С. Оберните пластины в парафине.
2. Подготовьте одноядерные клетки пуповинной крови (CBMCs) путем центрифугирования в градиенте плотности в соответствии с инструкциями изготовителя.
   ВНИМАНИЕ: Работа тщательно и обеспечить надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) носится при обращении с человеческой крови, чтобы избежать любого риска контакта с кровью патогенами.
3. После того , как мононуклеарные клетки были выделены и промывают, выполняют изоляцию CD4 ⁺ Т - клеток человека с помощью отрицательного Селефикция с использованием набора для коммерческого человеческого CD4 ⁺ Т - клеток.
   Примечание: Если есть красное загрязнение клеток крови после выделения мононуклеарных клеток, необязательные эритроциты лизис может быть выполнен до тех стадий выделения клеток CD4 ⁺ T. Ресуспендируют мононуклеарных клеток в 1 мл буфера изоляции (2% FBS в PBS). Добавьте 5 мл лизирующего раствора 1x. Инкубирую в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл буфера изоляции и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
   1. Ресуспендируют мононуклеарных клеток при плотности 50 × 10 ⁶ в 500 мкл в буфере изоляции в новой 5 мл трубки.
   2. Добавьте 100 мкл ФБС и 100 мкл антител смеси в пробирке, затем инкубировать каждую пробирку при 4 ° С в течение 20 мин на орбитальном шейкере, чтобы хорошо перемешать.
   3. После инкубации, добавьте 3-4 мл буфера изоляции, чтобы промыть клетки. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 8 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Тщательно аспирата Супаrnatant.
   4. Во время этого вращения, предварительно моют магнитные шарики. Передача желаемого количества магнитных шариков в новую пробирку (используется при 1: 1 с клетками) и добавляют равный объем буфера изоляции мыть шарики. Хорошо перемешать с помощью 1 мл микропипетки, а затем поместить трубку в магнит, по меньшей мере, 1 мин. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют магнитные шарики в том же объеме, первоначально переданного до стирки.
   5. Ресуспендируют клеток в каждую пробирку с 500 мкл буфера выделения и добавить 500 мкл предварительно промытых магнитных шариков.
   6. Инкубируйте клетки с магнитными шариками в течение 15 мин на орбитальном шейкере при комнатной температуре (18 ° C до 25 ° C), чтобы хорошо перемешать.
   7. После инкубации тщательно пипетка клеток с использованием 1 мл микропипеткой, по меньшей мере в 10 раз. Затем добавляют 3-4 мл буфера выделения и поместить каждую трубку в магните в течение 2 мин.
   8. Тщательно передачи отрицательно отобранных CD4 ⁺ Т - клетки , которые находятся всупернатант в новую пробирку.
4. После того, как выделение CD4 ⁺ Т - клеток завершается, подсчет клеток с помощью гемоцитометра и сохранить клетки на льду.
5. Промыть пластины покрытых антителами два раза PBS. Затем добавляют 1,5 мл 2 раза смесь Th17-поляризационной средств массовой информации в каждую лунку: анти-человеческий IFN & gamma; (20 мкг / мл), анти-человеческий ИЛ-4 (20 мкг / мл), TGF-beta человека (10 нг / мл), человек ИЛ-1β (40 нг / мл), человеческий IL-23 (40 нг / мл), человеческий IL-6 (50 нг / мл), все разводили в бессывороточной базовой средах (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
   Примечание: Трансфекция и РНК-интерференции делает работу в содержащей сыворотку средах. Цель использования бессывороточной среды с этим протоколом для достижения лучшего производства IL-17A.
6. Центрифуга человека CD4 ⁺ Т - клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Тщательно аспирата supernatмуравей. Затем клетки вновь суспендируют в бессывороточной базовых сред и пластины клеток при плотности 3 × 10 ⁶ в 1,5 мл на лунку так, чтобы конечный объем 3 мл на лунку и поляризационные цитокины теперь на 1x конечной концентрации.
   1. Поместите планшеты в 5% СО _2, 37 ° C инкубатора в течение двух дней.

2. электропорации в пробирке Поляризованные Человеческие клетки Th17

1. На 2 -й день, пальто 48-луночных культуры тканей пластины с 250 мкл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и анти-CD28 человека (4 мкг / мл) в PBS с кальцием и магнием в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
   1. В качестве альтернативы, слой пластины в течение ночи при 4 ° С. Оберните пластины в парафине.
2. Приготовьте небольшой РНК для трансфекции. Для каждой трансфекции, аликвота 1 мкл 5 мкМ исходного раствора киРНКа в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Включите соответствующую химию соответствием небольшой РНК CONTRол. Храните все трубы на льду.
3. Промыть пластины покрытых антителами два раза PBS. Затем добавляют 500 мкл 1X Th17-поляризационная средств массовой информации в каждую лунку: анти-IFN & gamma; человека (10 мкг / мл), анти-человеческий ИЛ-4 (10 мкг / мл), человеческого TGF-beta (5 нг / мл), человеческого IL- 1β (20 нг / мл), человеческий IL-23 (20 нг / мл), человеческий IL-6 (25 нг / мл), все разводили в бессывороточной базовой средах (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
4. После того, как культуральные планшеты и трансфекция реагенты получают, ресуспендирование клеток с 1 мл микропипетки, пипеткой осторожно, но обеспечивающие, что все клетки отделяют от дна лунки. Бассейн клеток в коническую пробирку и центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
   Примечание: Для периодов культуры дольше, чем протокол четырех дней, представленных здесь, клетки должны быть трансфицированы приблизительно каждые 3 дня, используя этот же протокол. Шаг 2.4 должны быть изменены, однако поскольку клетки, обработанные различными малыми РНК не должны быть объединены. Все условия испытывалось должны быть собраны, подсчитывают и трансфицируют отдельно.
5. Тщательно аспирата супернатант, а затем ресуспендирования клеток, по крайней мере, 1 мл PBS для мытья. Количество живых клеток Th17 (например , с помощью гемоцитометра с использованием трипанового синего для оценки жизнеспособности) , а затем перенести клетки в микроцентрифужной трубку.
6. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре для осаждения клеток.
7. Тщательно аспирата супернатанта, а затем ресуспендирование клеток с помощью прилагаемого ресуспендирования буфера из мкла набора для трансфекции системы 10 с плотностью 2,5-4 × 10 ⁷ клеток на мл. Держите клетки при комнатной температуре.
   Примечание: В качестве ориентира, старайтесь готовить только столько ячеек, сколько может быть трансфицированы в течение 30 мин. Несколько партий можно сравнить.
8. Добавить 9 мкл клеток в 1 мкл малых РНК в каждом MicroCentrifuge трубки. Пипетка один раз, чтобы смешать клетки и малый РНК для трансфекции затем загрузить в предусмотренном для наконечника пипетки электрода.
   Примечание: Как правило, добавляют 9,5 мкл клеточной суспензии, чтобы обеспечить в достаточном количестве смеси для предотвращения образования пузырьков в наконечник пипетки электрода до трансфекции.
9. Заполните представленную кювету 3 мл при комнатной температуре Электролитических буферов E. Место кюветы внутри пипетки станции, а затем поместить пипетку в положение внутри кюветы.
10. Немедленно электропорации 10 мкл каждой смеси клеток и малых РНК с использованием следующих параметров: импульсного напряжения 1,500-1,550 В, длительность импульса 10 мс и 3 импульсов в общей сложности на устройстве трансфекции.
11. После того, как электропорация завершена, непосредственно добавьте смесь клеток в 500 мкл 1X Th17-поляризационные среды в подготовленных скважинах культуральной пластины. Место пластины в 5% СО _2, 37 ° C инкубаторе в течение еще двух дней.
    Примечание: Промыть кончик пипетки электрода с помощью пипеткивверх и вниз в PBS между каждой трансфекции.

3. Заготовка Человеческие клетки Th17

1. Ресуспендируют клетки в культуральной среде с помощью микропипетки, пипетка осторожно, но обеспечение того, чтобы все клетки отделяют от дна лунки. Подготовка клеток для функциональных и / или экспрессии генов анализов.
   Примечание: Регулярно, достаточное количество клеток получали из одной скважины трансфицированных клеток Th17, которые будут использоваться для проточной цитометрии анализа поверхностных маркеров и внутриклеточных цитокинов и фактора транскрипции окрашивания или для получения РНК для анализа экспрессии генов.

Результаты

Первый шаг к разработке надежной системы успешно электропорации клеток Th17 человека было создание надежной в пробирке дифференцированы культур человека Th17 клеток. Т - клетки , культивированные в Th17-поляризационных условиях выразили хемокинов рецептор CCR6 и факто?...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает улучшенный способ доставки малых РНК в клетки Th17 человека. Хотя клетки Th17 человека здесь были использованы, этот метод электропорации с малым РНКОМ может быть использован с другими хелперами подмножествами первичного человеческим Т, такими как Th1, Th2, и Tregs. О?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use