Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

Riepilogo

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Abstract

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introduzione

Cellule T CD4 ⁺ sono orchestrators cruciali della risposta immunitaria adattativa. Naive cellule T CD4 ⁺ sono capaci di svilupparsi in diversi cellule T effettrici (es Th1, Th2, Th17, ecc), ciascuno con la propria serie di citochine e fattori di trascrizione caratteristici, a seconda del microambiente locale ^1. Le decisioni lignaggio che le cellule T fanno sono fondamentali sia per l'immunità protettiva e la tolleranza per sé. Cellule Th17 sono un sottogruppo di cellule T conosciuti per combattere batteri extracellulari e funghi, ma le loro risposte improprie sono anche implicati nella patogenesi di più malattie autoimmuni e infiammatorie come la sclerosi multipla e psoriasi ^{2, 3.} Cellule Th17 umane possono essere generati da cellule T CD4 ⁺ naive in vitro fornendo loro un appropriato ambiente polarizzazione ^4. Vario ci combinazioni delle citochine IL-1β, IL-23, TGF, e IL-6 sono stati utilizzati per lo sviluppo delle cellule Th17 umane. Cellule Th17 umane esprimono CCR6, un recettore delle chemochine che viene comunemente utilizzato per identificare questa popolazione cellulare e sono definite dall'espressione del loro fattore di trascrizione principale, RORγt (codificata dal RORC) ^{5, 6.} cellule Th17 hanno la capacità di esprimere molteplici citochine, ma IL-17A è la citochina effettore lignaggio definizione prodotta da queste cellule. Abbiamo esaminato l'espressione di tutti i tre marcatori Th17-associato (CCR6, RORγt, IL-17A) per valutare la robustezza della nostra analisi umana Th17 in vitro differenziazione. Inoltre, abbiamo coltivato le cellule T CD4 ⁺ umane in condizioni non polarizzante, in cui sono stati aggiunti citochine o anticorpi bloccanti al mezzo di coltura da usare come controllo negativo in quanto espressione di questi marcatori Th17 dovrebbe essere molto bassa o assente.

ve_content "> Un modo per studiare il normale sviluppo delle cellule T umane e la biologia è quello di manipolare l'espressione genica durante il loro sviluppo. A breve RNA interferenti (siRNA) sono sintetici piccole molecole di RNA che hanno come target mRNA codificanti proteine ​​e possono essere utilizzati per ridurre l'espressione genica specifica . I microRNA (miRNA) sono endogeni non codificanti piccoli RNA noti per modulare l'espressione genica post-trascrizionale. miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante sia murine e biologia delle cellule T umane, anche in cellule Th17 ^{7, 8, 9.} e ' è fondamentale avere metodi affidabili di manipolare piccola attività di RNA nelle cellule T umane per studiare i loro effetti sulla espressione genica e, infine, sulla biologia delle cellule T umano. Qui, descriviamo un protocollo facile da usare, affidabile e coerente che abbiamo sviluppato per l'introduzione piccoli RNA sintetici e acidi nucleici bloccati (LNA, chimicamente modificati acidi nucleici con maggiore stabilità)nelle cellule del sistema immunitario, e in particolare nelle cellule Th17 umane.

Ci sono diversi metodi alternativi di introdurre piccoli RNA in cellule di mammifero, che generalmente rientrano in chimici, biologici o fisici categorie ^10. metodi chimici comunemente usati, tra trasfezioni base di lipidi e trasfezioni calcio-fosfato, si basano sulla creazione di complessi chimico-DNA che vengono più efficacemente assorbiti dalle cellule. In generale, i metodi chimici non sono efficienti per la trasfezione di cellule T primarie. Il metodo biologico più comune è quella di utilizzare un vettore virale (ad esempio retrovirus o lentivirus), che inserisce direttamente RNA estraneo in un host come parte del suo ciclo di replica naturale. trasduzione virale richiede in genere più tempo per completare, soprattutto quando si tiene conto in tempo per la clonazione molecolare di plasmidi provirale. Inoltre, i vettori di trasduzione virali possono essere potenzialmente dannosi per i ricercatori umani. L'elettroporazione è una m fisicoetodo di indurre permeabilizzazione della membrana sottoponendo cellule di impulsi di alta tensione, permettendo agli acidi nucleici di entrare transientemente nella cella dove possono agire per suo bersaglio. strumenti elettroporazione tradizionali non sono stati efficaci per trasfezione linfociti primari. Tuttavia, ottimizzato generazione elettroporazione accanto ha dimostrato di essere in grado di trasfettare cellule T ad altissima efficienza, specialmente quando il materiale da transfettate è piccolo RNA. La prossima generazione termine è genericamente usato per differenziare le due piattaforme più recenti (ad esempio, neon, Amaxa) dalle macchine tradizionali elettroporazione. Inoltre, questo metodo è facilmente scalabile per schermi di throughput moderati con fino a circa 120 piccoli RNA in un singolo esperimento, spesso utilizzando reagenti convalidati sintetici. Soprattutto, trasfezioni successo può essere raggiunto in appena 16 h dopo l'attivazione delle cellule T. Lo svantaggio di questo metodo, tuttavia, è che non comporti stabile incorporati genomicasu, ed è quindi transitoria. Quindi, vale la pena lo sforzo supplementare per creare un costrutto di espressione stabile che può essere confezionato in un vettore virale ed espresso con successo in cellule T nei casi in cui è richiesta l'espressione a lungo termine di un piccolo RNA.

Abbiamo utilizzato un trasfezione prossima generazione (ad esempio, neon) per fornire diversi strumenti semplice o doppio filamento di RNA o LNA oligonucleotidici per scopi diversi ^{11, 12, 13.} RNA interferenza efficiente può essere indotta nel topo primaria e cellule T umane usando RNA corto interferenti doppio filamento (siRNA). Questo protocollo descrive condizioni ottimizzate per l'utilizzo di questa tecnica in cellule Th17 umane. Oltre a siRNA, disponibili in commercio imita miRNA sintetiche e inibitori possono essere utilizzati per studiare guadagno miRNA e perdita di funzione. imita miRNA sono molecole di RNA a doppio filamento molto simili a siRNA, ma designed con la sequenza dei miRNA maturi endogeni. inibitori miRNA sono chimicamente modificati RNA e / o LNA basato oligonucleotidi cavo rigido che si legano a miRNA nativi e antagonizzano la loro funzione. Abbiamo scoperto che tutti questi strumenti possono essere utilizzati efficacemente in coltura i linfociti T primari, compreso ma non limitato alle cellule Th17 umane.

Protocollo

Questo protocollo aderisce alle linee guida del UCSF per l'etica della ricerca umana.

1. Preparazione di T coltura cellulare, Isolamento di cellule T CD4 ⁺ e Th17 polarizzazione

1. Al giorno 0, cappotto 6 pozzetti di coltura tissutale con 1,5 ml per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C.
   1. In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm.
2. Preparare le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMCs) di densità centrifugazione in gradiente le istruzioni del produttore.
   ATTENZIONE: Lavorare con cura e garantire la corretta dispositivi di protezione individuale (DPI) è indossare durante la manipolazione del sangue umano per evitare ogni rischio di esposizione ad agenti patogeni.
3. Una volta che le cellule mononucleate sono state isolate e lavati, eseguire isolamento delle cellule T CD4 ⁺ umano sele negativoction utilizzando un kit commerciale di cellule T CD4 ⁺ umana.
   NOTA: Se c'è contaminazione globuli rossi dopo l'isolamento di cellule mononucleate, una lisi dei globuli rossi opzionale può essere eseguita prima delle fasi di isolamento delle cellule T CD4 ^+. Risospendere le cellule mononucleari in 1 ml di tampone di isolamento (2% FBS in PBS). Aggiungere 5 ml di soluzione di lisi 1x. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quindi 5 ml di tampone di isolamento e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule.
   1. Risospendere le cellule mononucleari ad una densità di 50 x 10 ⁶ per 500 microlitri nel buffer isolamento in una nuova provetta 5 ml.
   2. Aggiungere 100 ml di FBS e 100 microlitri della miscela di anticorpi per provetta poi incubare ciascun tubo a 4 ° C per 20 minuti in un agitatore orbitale per mescolare bene.
   3. Dopo l'incubazione, aggiungere 3-4 mL di tampone isolamento per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 300 xg per 8 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. aspirare accuratamente la supernatant.
   4. Durante questo spin, pre-lavare le sfere magnetiche. Trasferire la quantità desiderata di perline magnetiche in un nuovo tubo (usato a 1: 1 con le cellule) e aggiungere un uguale volume di tampone di isolamento per lavare le perline. Mescolare bene con una micropipetta mL 1 e quindi inserire il tubo nel magnete per almeno 1 min. Con attenzione aspirare il surnatante. Risospendere le sfere magnetiche nello stesso volume inizialmente ceduto prima del lavaggio.
   5. Risospendere le cellule in ciascuna provetta con 500 ml di tampone di isolamento e aggiungere 500 ml di perline magnetiche pre-lavati.
   6. Incubare le cellule con le perline magnetiche per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) miscelare bene.
   7. Dopo l'incubazione, pipettare accuratamente le cellule utilizzando una micropipetta 1 mL almeno 10 volte. Quindi aggiungere 3-4 ml di tampone isolamento e posizionare ciascun tubo nel magnete per 2 min.
   8. Trasferire accuratamente le cellule T CD4 ⁺ negativamente selezionati che sonoil surnatante in una nuova provetta.
4. Una volta che l'isolamento delle cellule T CD4 ⁺ è stata completata, contare le cellule con un emocitometro e mantenere le cellule in ghiaccio.
5. Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 1,5 mL di 2x mix di media Th17-polarizzazione in ciascun pozzetto: IFNy anti-umana (20 mg / ml), anti-IL-4 (20 mg / ml), TGF umana (10 ng / mL), umano IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 umana (50 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo).
   NOTA: Transfection e RNA interference fa il lavoro in supporto contenente siero. Lo scopo di utilizzare supporti privo di siero con questo protocollo è quello di ottenere una migliore produzione di IL-17A.
6. Centrifugare le cellule umane T CD4 ⁺ a 500 xg per 5 min a 4 ° C a pellet cellule. Aspirare accuratamente la supernatformica. Poi risospendere le cellule in base privo di siero e piastra le cellule ad una densità di 3 x 10 ⁶ in 1,5 ml per pozzetto in modo che il volume finale è di 3 ml per pozzetto e citochine polarizzanti sono ora ad una concentrazione finale 1x.
   1. Posizionare le piastre in 5% CO _2, 37 ° C incubatore per due giorni.

2. Le cellule elettroporazione di In Vitro polarizzato Th17 umana

1. Il giorno 2, cappotto 48-pozzetti di coltura tissutale con 250 microlitri per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C.
   1. In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm.
2. Preparare piccoli RNA per la trasfezione. Per ogni trasfezione, aliquota 1 ml di 5 mM soluzione stock di siRNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Includi appropriata chimica-abbinato piccolo contr RNAolo. Tenere tutti i tubi in ghiaccio.
3. Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 500 ml di 1X Th17-polarizzazione media per ogni pozzetto: IFNy anti-umana (10 mg / ml), anti-IL-4 (10 mg / ml), TGF umano (5 ng / mL), IL-umano 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 umana (25 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo).
4. Dopo che le piastre di coltura e reagenti di trasfezione sono preparati, risospendere le cellule con 1 ml micropipetta, pipettando gentilmente ma assicurando che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Raggruppare le cellule in una provetta conica e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   NOTA: Per periodi più lunghi di cultura del protocollo di quattro giorni qui presentate, le cellule devono essere trasfettate circa ogni 3 giorni usando lo stesso protocollo. Passo 2.4 dovrebbe essere modificato tuttavia, poiché le cellule trattate con differenti piccoli RNA non dovrebbero essere convogliati. Tutte le condizioni in fase di test devono essere raccolti, contati e trasfettate separatamente.
5. aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule in almeno 1 ml di PBS per lavare. Contare le cellule Th17 vive (ad esempio con un emocitometro utilizzando Trypan Blue esclusione per valutare la vitalità) e poi trasferire le cellule in una provetta.
6. Centrifugare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule.
7. Aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule usando il tampone di risospensione fornito dal sistema di transfezione 10 microlitri kit ad una densità di 2,5-4 x 10 ⁷ cellule per ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
   NOTA: Come linea guida, provare a preparare solo il maggior numero di cellule, come si può transfettate entro 30 min. lotti multipli possono essere confrontati.
8. Aggiungere 9 ml di cellule per 1 ml di piccoli RNA in ogni MicroCtubo entrifuge. Dispensare una volta per mescolare le cellule e piccoli RNA per trasfezione quindi caricare nella punta dell'elettrodo pipetta.
   NOTA: Tipicamente, aggiungere 9,5 ml di sospensione cellulare per garantire il della miscela per evitare la creazione di bolle nella punta dell'elettrodo pipetta prima trasfezione.
9. Riempire la vaschetta fornito con 3 ml di temperatura ambiente elettrolitico Buffer E. Posizionare la cuvetta all'interno della stazione pipetta e quindi inserire la pipetta in posizione all'interno della provetta.
10. elettroporazione immediatamente ogni 10 ml mix di cellule e piccoli RNA utilizzando i seguenti parametri: tensione ad impulsi 1,500-1,550 V, larghezza di impulso di 10 ms, e 3 impulsi totale sul dispositivo trasfezione.
11. Dopo l'elettroporazione è completa, aggiungere direttamente la miscela di cellule per 500 ml di 1X Th17-polarizzante media in pozzetti preparati dei piastra di coltura. Piastre posto in un 5% di CO _2, 37 ° C incubatore per altri due giorni.
    NOTA: Lavare l'elettrodo pipetta pipettandosu e giù in PBS tra ogni trasfezione.

3. Cellule raccolta Th17 umane

1. Risospendere le cellule in coltura con una micropipetta, pipettando gentilmente ma garantire che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Preparare le cellule per analisi di espressione funzionale e / o geni.
   NOTA: Di routine, abbastanza cellule vengono ceduti da un singolo pozzo di cellule Th17 trasfettate da utilizzare per l'analisi di citometria di flusso del marcatore di superficie e intracellulare di citochine e fattori di trascrizione colorazione o per la preparazione di RNA per l'analisi di espressione genica.

Risultati

Il primo passo per lo sviluppo di un sistema affidabile di electroporating successo cellule Th17 umane era di generare robusta in vitro differenziato colture di cellule Th17 umane. Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili espresso il recettore delle chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione RORγt (Figura 1A, sinistra). Questi marcatori non sono stati espressi quando le cellule T sono state coltivate in condizioni non polarizzante (THN)

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per la consegna di piccoli RNA in cellule Th17 umane. Sebbene le cellule Th17 umane sono stati usati qui, questo metodo di elettroporazione con piccoli RNA può essere utilizzato con altri sottoinsiemi helper umana primaria T, come Th1, Th2 e Tregs. Esso non funziona bene per le cellule T CD4 ⁺ naive quindi le cellule devono essere attivati in coltura prima della trasfezione. Per questo protocollo, abbiamo prima ottimizzato il sistema di coltura in vitro in<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use