Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

Résumé

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Résumé

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introduction

Cellules T CD4 ⁺ sont orchestrateurs essentiels de la réponse immunitaire adaptative. Naïf cellules T CD4 ⁺ sont capables de se développer en plusieurs différentes cellules T effectrices (par exemple , Th1, Th2, Th17, etc.), chacun avec son propre ensemble de cytokines caractéristiques et des facteurs de transcription, en fonction du micro - environnement local ^1. Les décisions de la lignée que les cellules T font sont essentielles tant pour l'immunité protectrice et la tolérance à l'auto. Les cellules Th17 sont un sous - ensemble de cellules T connues pour lutter contre les bactéries extracellulaires et les champignons, mais les réponses inappropriées sont également impliqués dans la pathogenèse de multiples maladies auto - immunes et inflammatoires telles que la sclérose en plaques et le psoriasis ^{2, 3.} Th17 cellules humaines peuvent être générées à partir de cellules naïves T CD4 ⁺ in vitro en leur fournissant un environnement approprié de polarisation ^4. Vario nous combinaisons ont été utilisées des cytokines IL-1β, IL-23, TGFß, et l'IL-6 pour le développement des cellules Th17 humaines. Th17 cellules humaines expriment CCR6, un récepteur de chimiokine qui est couramment utilisé pour identifier cette population de cellules et sont définies par l'expression de leur facteur de transcription principale, RORγt (codée par RORC) ^{5, 6.} les cellules Th17 ont la capacité d'exprimer des cytokines multiples, mais IL-17A est la cytokine effectrice définissant lignée produite par ces cellules. Nous avons examiné l'expression des trois marqueurs associés Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) pour évaluer la solidité de notre essai de différenciation Th17 in vitro humaine. De plus, nous avons cultivé des cellules T CD4 ⁺ humains dans des conditions non-polarisation, où aucune des cytokines ou des anticorps bloquants ont été ajoutés aux milieux de culture à utiliser comme contrôle négatif puisque l' expression de ces marqueurs Th17 devrait être très faible ou absente.

ve_content "> Une façon d'étudier le développement normal des cellules T humaines et de la biologie est de manipuler l'expression génique au cours de leur développement. ARN court interférent (ARNsi) sont des petites molécules d'ARN synthétiques qui ciblent les ARNm codant pour des protéines et peuvent être utilisés pour réduire l'expression d'un gène spécifique . Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants endogènes connus pour moduler miARN post-transcriptionnelle l' expression génique. ont été montré à jouer un rôle important dans les deux murin et la biologie des cellules T humaines, y compris dans les cellules Th17 ^{7, 8, 9.} Il est essentiel de disposer de méthodes fiables de manipulation petite activité d'ARN dans les cellules T humaines pour étudier leurs effets sur l'expression des gènes et, finalement, sur la biologie des cellules T humaines. ici, nous décrivons un outil facile à utiliser, protocole cohérent et fiable que nous avons développé pour l'introduction les petits ARN et des acides nucléiques verrouillés (LNA synthétiques, des acides nucléiques modifiés chimiquement avec une stabilité accrue)dans les cellules immunitaires, et plus spécifiquement dans les cellules Th17 humaines.

Il existe plusieurs méthodes alternatives de l' introduction de petits ARN dans les cellules de mammifères, qui se situent généralement dans des catégories chimiques, biologiques ou physiques ^10. Couramment utilisés méthodes chimiques, y compris transfections à base de lipides et transfections calcium-phosphate, reposent sur la création de complexes ADN chimique qui sont plus efficacement absorbé par les cellules. En général, les méthodes chimiques ne sont pas aussi efficaces pour la transfection de cellules T primaires. Le procédé biologique la plus courante consiste à utiliser un vecteur viral (par exemple, retrovirus ou lentivirus), qui insère directement l' ARN étranger dans un hôte en tant que partie de son cycle de replication naturel. transduction virale prend généralement plus de temps, en particulier lorsque l'on tient compte du temps pour le clonage moléculaire des plasmides proviraux. En outre, des vecteurs de transduction viraux peuvent être potentiellement dangereux pour les chercheurs humains. L'électroporation est une physique méthode d'induire la perméabilisation de la membrane en soumettant les cellules à des impulsions à haute tension, ce qui permet d'entrer des acides nucléiques de manière transitoire dans la cellule où ils peuvent agir sur leur cible. Les instruments traditionnels de électroporation ne sont pas efficaces pour transfecter les lymphocytes primaires. Cependant, l'électroporation de la prochaine génération optimisée est avérée être capable de transfecter des cellules T à un rendement très élevé, en particulier lorsque le matériau à transfecter est un petit ARN. Le terme de nouvelle génération est vaguement utilisé pour différencier les deux nouvelles plates - formes (par exemple, Neon, Amaxa) de machines d'électroporation traditionnelles. En outre, cette méthode est facilement extensible pour des écrans de débit modéré avec jusqu'à environ 120 petits ARN en une seule expérience, souvent en utilisant des réactifs de synthèse validés. Il est important, transfections succès peut être atteint en moins de 16 h après l'activation des lymphocytes T. L'inconvénient de cette méthode, cependant, est qu'il ne donne pas lieu à incorporati génomique stablesur, et est donc transitoire. Par conséquent, il vaut l'effort supplémentaire pour créer une construction d'expression stable qui peut être emballé dans un vecteur viral et exprimé avec succès dans les cellules T dans les cas où l'expression à long terme d'un petit ARN est nécessaire.

Nous avons utilisé une transfection de prochaine génération (par exemple, le néon) pour délivrer ARN simple brin ou double brin synthétiques ou divers outils oligonucléotides LNA à des fins différentes ^{11, 12, 13.} L'interférence ARN efficace peut être induite chez la souris et les cellules T primaires humains en utilisant l'ARN court interférant double brin (siRNA). Ce protocole décrit les conditions optimales pour l'utilisation de cette technique dans les cellules Th17 humaines. En plus de siARN, imitateurs miARN synthétiques et les inhibiteurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour étudier le gain miARN et la perte de la fonction. imite miARN sont des molécules d'ARN double brin très semblables à ARNsi, mais designed avec la séquence de miARN matures endogènes. les inhibiteurs de miARN sont d'ARN modifiés chimiquement et / ou LNA à base d'oligonucléotides simple brin qui se lient aux miRNAs natifs et antagonisent leur fonction. Nous avons constaté que tous ces outils peuvent être utilisés efficacement dans les lymphocytes T primaires en culture, y compris, mais sans s'y limiter, les cellules Th17 humaines.

Protocole

Ce protocole est conforme aux directives de l'UCSF pour l'éthique de la recherche humaine.

1. Préparation de T culture cellulaire, l' isolement des cellules T CD4 ^+, et Th17 Polarisation

1. Le jour 0, le manteau 6 puits des plaques de culture de tissu avec 1,5 ml par puits d'anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C.
   1. En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper les plaques dans parafilm.
2. Préparer les cellules mononucléaires de sang de cordon (CBMCs) par centrifugation à gradient de densité selon les instructions du fabricant.
   ATTENTION: Travailler avec soin et assurer l'équipement de protection individuelle (EPI) est porté lors de la manipulation du sang humain afin d'éviter tout risque d'exposition à des agents pathogènes transmissibles par le sang.
3. Une fois que les cellules mononucléaires ont été isolées et lavées, effectuer CD4 ⁺ humaines isolement des cellules T par SELE négativection utilisant un kit commercial CD4 humain ⁺ T cellulaire.
   NOTE: En cas de contamination de globules rouges après l' isolement des cellules mononucléaires, une lyse des globules rouges en option peut être effectuée avant les étapes d'isolement des cellules T CD4 ^+. Remettre en suspension les cellules mononucléaires dans 1 ml de tampon d'isolement (FBS à 2% dans du PBS). Ajouter 5 ml de solution 1x lyser. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Puis ajouter 5 ml de tampon d'isolement et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules.
   1. Remettre en suspension les cellules mononucléaires à une densité de 50 x 10 ⁶ par 500 ul dans le tampon d'isolement dans un nouveau tube de 5 ml.
   2. Ajouter 100 pl de FBS et 100 ul du mélange d'anticorps par tube puis incuber chaque tube à 4 ° C pendant 20 min sur un agitateur orbital pour bien mélanger.
   3. Après l'incubation, ajouter 3-4 ml de tampon d'isolement pour se laver les cellules. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 8 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. Aspirer soigneusement le supernatant.
   4. Au cours de cette rotation, pré-laver les billes magnétiques. Transférer la quantité voulue de billes magnétiques dans un nouveau tube (utilisé à 1: 1 avec les cellules) et ajouter un volume égal de tampon d'isolement pour laver les perles. Bien mélanger à l'aide d'une micropipette de 1 ml, puis placer le tube dans l'aimant pendant au moins 1 min. Aspirer délicatement le surnageant. Remettre en suspension les billes magnétiques dans le même volume initialement transféré avant le lavage.
   5. Resuspendre les cellules dans chaque tube 500 ul du tampon d'isolement et ajouter 500 ul de billes magnétiques prélavés.
   6. Incuber les cellules avec les billes magnétiques pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) pour bien mélanger.
   7. Après l'incubation, pipeter soigneusement les cellules en utilisant une micropipette de 1 ml au moins 10 fois. Puis ajouter 3-4 ml de tampon d'isolement et de placer chaque tube dans l'aimant pendant 2 min.
   8. Transférer délicatement les cellules T CD4 ⁺ négativement sélectionnés qui sontle surnageant dans un nouveau tube.
4. Une fois CD4 ⁺ T isolement cellulaire est terminée, compter les cellules avec un hémocytomètre et maintenir les cellules sur la glace.
5. Laver les plaques revêtues d'anticorps deux fois avec du PBS. Puis ajouter 1,5 ml de 2 x mélange de médias Th17-polarisation dans chaque puits: IFNy anti-humain (20 ug / mL), IL-4 (20 ug / mL), le TGFß humain (10 ng / ml), anticorps anti-humain IL-1β (40 ng / mL), IL-23 (40 ng / mL), IL-6 (50 ng / mL) humain tout dilué dans un milieu de base exempt de sérum (supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 humaine U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 10 mM de HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM et 100 pM de 2-mercaptoéthanol).
   REMARQUE: Transfection et l'interférence ARN ne fonctionne dans un milieu contenant du sérum. Le but de l'utilisation des milieux sans sérum avec ce protocole est de parvenir à une meilleure production d'IL-17A.
6. Centrifuger les cellules T CD4 ⁺ humaines à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C pour les cellules pastille. Aspirer soigneusement le supernatfourmi. Ensuite , remettre en suspension les cellules dans des milieux de base sans sérum et plaquer les cellules à une densité de 3 x 10 ⁶ à 1,5 ml par puits de sorte que le volume final est de 3 mL par puits et cytokines polarisantes sont maintenant à une concentration finale 1x.
   1. Placer les plaques dans 5% de _CO2, 37 ° C incubateur pendant deux jours.

2. électroporation in vitro humaine Th17 cellules polarisants

1. Le jour 2, le manteau 48 puits des plaques de culture tissulaire de 250 ul par puits d'anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C.
   1. En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper les plaques dans parafilm.
2. Préparer les petits ARN pour la transfection. Pour chaque transfection, une aliquote ul d'une solution mère de 5 pM de siRNA dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Inclure petit ARN Contr adapté de la chimie appropriéeol. Gardez tous les tubes sur la glace.
3. Laver les plaques revêtues d'anticorps deux fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 500 ul de milieux 1X Th17 polarisant à chaque puits: IFNy anti-humain (10 ug / mL), IL-4 anti-humain (10 ug / ml), le TGFß humain (5 ng / ml), IL-humain 1β (20 ng / mL), IL-23 (20 ng / mL) humaine, l'IL-6 (25 ng / mL) humain tout dilué dans un milieu de base exempt de sérum (supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 10 mM de HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM et 100 pM de 2-mercaptoéthanol).
4. Après que les plaques de culture et les réactifs de transfection sont préparés, remettre en suspension les cellules avec 1 mL d'une micropipette, mais un léger pipetage assurant que toutes les cellules sont détachées du fond des puits. Regrouper les cellules dans un tube conique et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
   NOTE: Pour les périodes de culture plus longues que le protocole de quatre jours présenté ici, les cellules doivent être transfecté environ tous les 3 jours en utilisant ce même protocole. Étape 2.4 devrait être modifié cependant, puisque ne doivent pas être mis en commun les cellules traitées avec différentes petits ARN. Toutes les conditions à l'essai doivent être collectées, comptées, et transfectés séparément.
5. Aspirer délicatement le surnageant, puis remettre les cellules dans au moins 1 ml de PBS à laver. Compter les cellules Th17 vivantes (par exemple , avec un hémocytomètre en utilisant l' exclusion Trypan Bleu pour évaluer la viabilité) et ensuite transférer les cellules à un tube de microcentrifugeuse.
6. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot des cellules.
7. Aspirer soigneusement le surnageant, remettre en suspension et ensuite les cellules en utilisant le tampon de remise en suspension fourni par le système de transfection kit 10 ul à une densité de 2,5-4 x 10 ⁷ cellules par ml. Gardez les cellules à la température ambiante.
   NOTE: À titre indicatif, essayez de préparer uniquement autant de cellules que peuvent être transfectées dans les 30 minutes. Plusieurs lots peuvent être comparés.
8. Ajouter 9 uL de cellules à 1 ul de petits ARN dans chaque MicroCTube entrifuge. Pipeter une fois pour mélanger les cellules et les petits ARN pour la transfection puis charger dans l'embout avec l'électrode de pipette.
   NOTE: En règle générale, ajouter 9,5 ul de suspension de cellules pour assurer qu'il y a suffisamment du mélange pour éviter la formation de bulles dans la pointe de l'électrode de pipette avant la transfection.
9. Remplir la cuvette fournie avec 3 ml de la température ambiante tampon E. Placer Electrolytic la cuvette dans la station de pipette, puis placer la pipette en position à l'intérieur de la cuvette.
10. Immédiatement électroporation chaque mélange 10 pl de cellules et de petits ARN en utilisant les paramètres suivants: tension d'impulsion 1,500-1,550 V, largeur d'impulsion de 10 ms, et 3 impulsions du total sur le dispositif de transfection.
11. Après l'électroporation est terminée, ajouter directement le mélange de cellules à 500 pi de milieu polarisant Th17 1X dans des puits préparés d'une plaque de culture. Placer les plaques dans 5% de CO _2, incubateur à 37 ° C pendant deux jours.
    REMARQUE: Lavez la pointe d'électrode de pipette par pipetagede haut en bas dans du PBS entre chaque transfection.

3. Récolte Th17 cellules humaines

1. Resuspendre les cellules dans des milieux de culture avec une micropipette, un léger pipetage, mais faire en sorte que toutes les cellules sont détachées du fond des puits. Préparer les cellules pendant fonctionnels et / ou des essais d'expression génique.
   NOTE: En routine, on obtient des résultats suffisamment de cellules à partir d'un seul puits de cellules transfectées Th17 à utiliser pour l'analyse cytométrique d'écoulement du marqueur de surface et de cytokine intracellulaire et coloration facteur de transcription ou pour la préparation de l'ARN pour l'analyse de l'expression génique.

Résultats

La première étape pour l' élaboration d' un système fiable de électroporation avec succès les cellules Th17 humaines était de générer in vitro robuste différenciées des cultures de cellules Th17 humaines. Les cellules T cultivées dans des conditions de polarisation de Th17 ont exprimé le récepteur de chimiokine CCR6 et le facteur de transcription RORγt (figure 1A, gauche). Ces marqueurs ne sont pas exprimés lorsque les lymphocytes T ont ?...

Discussion

Ce protocole fournit un procédé amélioré pour la livraison de petits ARN dans des cellules Th17 humains. Bien que les cellules Th17 humains ont été utilisés ici, cette méthode de électroporation avec de petits ARN peut être utilisé avec d'autres sous-ensembles T auxiliaires humain primaire, comme Th1, Th2 et Treg. Il n'a pas bien fonctionné pour naïfs cellules T CD4 ⁺ de sorte que les cellules doivent être activées dans la culture avant la transfection. Pour ce protocole, nous avons opt...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use