Kronik daralma Yaralanmalı farelerde otomatik yürüyüş analizi

Özet

Ağrı yanıt nöropatik hayvan modeli olarak hassas bir değerlendirme ağrı hastalıkları Patofizyoloji araştırmak ve yeni analjezikler geliştirmek çok önemlidir. Biz bir otomatik yürüyüş analizi sistemi tarafından hind pençe kemirgen duyusal işlev belirlemek için hassas ve objektif bir yöntem mevcut.

Özet

Von Frey test yaygın olarak nöropatik ağrı hayvanların duyusal işlev incelemek için kullanılan klasik bir yöntemdir. Ancak, bazı dezavantajları öznel verileri gibi ve yetenekli, deneyimli deneyci şartı vardır. Bugüne kadar değişiklikler çeşitli gelişmiş von Frey yöntemi, ama yine de birkaç sınırlaması vardır. Son raporlar yürüyüş analizi nöropatik hayvanlardan daha doğru ve objektif verileri üreten tavsiye ettiler. Bu iletişim kuralı, farelerde nöropatik ağrı derecesini belirlemek için otomatik yürüyüş analizi gerçekleştirmek gösterilmiştir. Calıştıkları birkaç gün sonra fareler serbestçe ayak izleri aydınlatmak için cam zemin üzerinde yürümek için izin verildi. O zaman, miktar ayak izleri ve yürüyüş gerçekleştirilen alan pençe baskı, swing zaman, Agiz pençe, vb gibi çeşitli yürüyüş parametreleri otomatik olarak analiz ile video klipler aracılığıyla

Bu çalışmanın temel amacı otomatik yürüyüş analizi yöntemi açıklamak ve kısaca klasik duyusal test von Frey filament kullanarak verilerle karşılaştırın etmektir.

Giriş

Sinir sisteminin patolojik değişiklikler travma, metabolik fonksiyon bozukluğu, iltihap, enfeksiyon, iskemi indüklenen veya Otoimmün hastalık bazen bir lezyon ya da hastalığı doğrudan bir sonucu ortaya çıkan bir ağrı olarak tanımlanan nöropatik ağrı neden somatosensor sistem¹etkileyen. Nöropatik ağrı genellikle dayanılmaz ve ne yazık ki, geleneksel analjezikler genellikle yeterli ağrı Rölyef²üretmek değildir. Nöropatik ağrı önemli bir özelliği spontan ve stimülasyon uyarılmış (Yani, allodynia ve hyperalgesia) ağrıları içerir. Allodynia Kısaca bastırmak veya sıcak stimülasyon gibi normalde ağrılı uyaranlara karşı oluşan nosiseptif bir yanıttır. Hyperalgesia mekanik ve/veya termal zararlı uyaranlara³için bir gelişmiş acı tepki gösterir. Her ne kadar bu iki belirtiler her iki kritik hastanın yaşam kalitesini bozabilir, yumuşak Kontakt günlük yaşamda önlemek zor olduğu için mekanik allodynia nazik dokunsal uyarım tarafından uyarılmış en sinir bozucu semptomdur.

Nöropatik ağrı tedavisinde yeni analjezikler ve temel mekanizması araştırmak için hassas ölçüm ağrı yanıtının esastır. Çok sayıda nöropatik ağrı hayvan modelleri geliştirdik hind nosiseptif yanıtları pençe alan onun yüksek erişilebilirlik^4,5,6,7yüzünden. Böylece, çoğu ağrı yanıt Değerlendirmeler arka pençe plantar veya dorsal yüzeyi mekanik uyaranlara von Frey filamentler gibi özel araçlar kullanarak uygulama tarafından gerçekleştirilmiş. En sık kullanılan yöntem biri yukarı ve aşağı Dixon tarafından açıklanan yöntemi sürümleri^9,108 ve daha sonra değiştirilebilir. Ancak, çok yetenekli, deneyimli Denemecileri von Frey testi gerçekleştirmek için gerekli olan ve sonuçları öznel olabilir.

Otomatik yürüyüş analiz sistemi nörolojik ve nöromüsküler hastalıklar kemirgenler serbestçe hareket yürüyüş çeşitli parametreler ölçerek araştırabilirsiniz. Sinir yaralanma hayvan modelleri çeşitli, duyusuna derecesini ve çeşitli tedaviler antinociceptive etkisini bir ağrı stimülasyon^11,12,13, eklemeden değerlendirilebilir ¹⁴. bu analiz sistemi statik ve dinamik yürüyüş parametreleri, aşağıdaki gibi algılayabilir: yazdırma alanı (zemin ile bağlantı kurduğunda tam pençe baskı alanı) pençe, yoğunluğu (kontak pençe alanının ortalama yoğunluğu) pençe, adım uzunluğu ( Art arda gelen yerleşimleri aynı pençe arasındaki mesafe), duruş (süresi yere temas için bir tek arka pençe), adım dizisi (içinde dört paws sipariş yere yerleştirilir) faz (salıncak faz süresi) salıncak ve salıncak hız (hesaplanan uzunluğu stride ve salıncak süresi ve piksel / saniye olarak ifade). Bu kağıt bir analiz sistemi kullanımı gösterilmiştir ve kronik daralma yaralanma (CCI) nöropatik fare kullanarak von Frey testi ile veri kısa bir karşılaştırma sağlar.

Protokol

tüm deneylerin Uluslararası Birliği etik kurallarına uygun olarak ağrı çalışma için yapılmıştır ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış Chungnam Ulusal Üniversitesi () Daejeon, Güney Kore).

1. indüksiyon CCI siyatik sinir üzerindeki

1. ev erkek ICR fareler ile kontrollü oda sıcaklığında (20-25 ° C'de muhafaza) ve nem (40-%60), bir 12 h açık/koyu döngüsü altında 20-25 g ağırlığında ücretsiz Gıda erişim ve su. Ameliyattan önce fareler hayvan bakım odasında bir calıştıkları süre en az 1 hafta izin.
   1. Konut sırasında fareler davranışını ve görünümünü gözlemlemek ve anormal Lokomotor aktivite gösteren fareler kullanmayın.
      Not: Bir gün CCI ameliyat öncesi von Frey filamentler uygulayarak arka pençe mekanik duyarlılığı ölçmek ve normal temel değerlerini elde etmek için otomatik yürüyüş analizi gerçekleştirin. Ardından, fare rasgele kontrol ve deneysel gruplara izin atama.
2. 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, mayi (IP)) enjekte edilerek ameliyat günü, fareler anestezi.
   Not: Cerrahi önlük, eldiven ve maske gibi kişisel koruyucu ekipman giymek.
   1. 2,2,2 tribromoethanol 2.5 g tartmak ve 2-metil-2-buthanol 5 mL son hacim için ekleyin. Çözüm ışıktan uzak tutmak (örneğin, karanlık bir kapsayıcı kullanın veya şal folyo).
   2. 40 ° C'de Isıtma ve 10-30 dk. karıştırarak tarafından tamamen erimesi için izin ver reaktifler
   3. Distile su 200 mL son hacmi ekleyin ve iyi kadar karışık karıştırın.
   4. Aliquots 4 ° C'de depolayın ve karanlıkta tut. İki hafta sonra anestezi ile yeni aliquots değiştirilmelidir.
   5. 1 g vücut ağırlığı başına 20 µL hacmi enjekte. Vücut ağırlığı fare ile 25 g ise, örneğin, çözeltinin 500 µL ver. Bu anestezi tipik süresi 1 h. olduğu
      Not: Bu çözüm ışığa maruz zaman zehirli olacak ve/veya ısı ışık ve ısı maruz önlemek dikkatli olun. IP enjeksiyon yolu önerilir.
3. Fare derin anestezi düştüğünde, dorsal yüzü (Yani, yüzükoyun) kadar ameliyat masasında yerleştirin ve sağ tarafta bir % 70 alkol bez ile dış orta uyluk bölgeyi sterilize.
   Not: derin anestezi yanıt-e doğru tutam veya uyarıcı arka paws veya kuyruk basınç eksikliği kontrol ederek onaylayın.
4. Üzerinde fare sağ siyatik sinir CCI neden.
   1. Bir neşter bıçakla orta uyluk bölgesinin kalbinde 1.0-1.5 cm uzunluk çevresindeki deri bir kesi yapmak.
   2. Açık açık siyatik sinir ortaya çıkarmak için mikro-sivrisinek hemostat ile uyluk kasları teşrih.
   3. 4-0 fotokromik akorduna dikiş kullanarak 3 kez 1.0-1.5 mm aralıkları ile maruz siyatik sinir ligate.
      Not: hafif sallayarak Ipsilateral arka pençe üzerinde görünene kadar siyatik sinir bağlayarak gevşek d alın. Sham grup farelerin aynı cerrahi açılış sinir ligasyonu olmadan dışında benzer koşullarda alınan.
5. 5-0 ipek kullanarak 3-4 basit kesintiye uğramış dikiş ile cerrahi açılış kapatın ve cerrahi dış çevrenin dezenfeksiyonunda povidone iyot ile sterilize.
6. Ameliyattan sonra bir Isıtma yastığını temiz bir kafeste fareyi getirin. Anesteziden hayvanlar kurtarıldı sonra onları ev onların kafes dönün.
   Not: Bu çalışmada, antibiyotik kullanılmadı. Bir doz 50 mg/kg pozitif kontrol olarak günde bir kez, CCI + GBP alınan grup IP gabapentin (GBP).

2. Mekanik Allodynia ölçümü (von Frey Test)

Not: 1 g Ipsilateral arka pençe plantar yüzeyine von Frey filament kullanarak para çekme yanıt mekanik uyaranlara karşı sıklığını değerlendirmek.

1. Her test günü, fareler davranış test odasına getir ve en az 30 dk önce test için kendi ev kafeste fareler alışmana
   Not: Cerrahi önlük, eldiven ve maske gibi kişisel koruyucu ekipman giymek.
2. Şeffaf Akrilik kutu metal kafes yerde fare koymak ve fareyi 30 dakika süreyle alışmana
3. Filaman virajlı kadar yavaşça von Frey filament 1 g arka pençe plantar yüzeyine uygulamak.
4. Uygula filaman uyarmaya Ipsilateral hind pençe ile 10 kez en az 10 s aralıklarını ve sonuç kayıt.
   Not: Bu çalışmada, pençe çekilme yanıt--dan 10 deneme sayısını pençe çekilme frekans (PWF, %) yüzdesi olarak gösterilir. Von Frey test iki günde CCI ameliyat sonrası gerçekleştirildi.

3. Yürüyüş çözümlemesini otomatik

Not: hayvan yürüyor ve otomatik olarak çeşitli yürüyüş parametreleri çözümler yürüyüş analiz sistemi her pençe baskı görüntüler, böyle paw baskı, pençe gibi yoğunluk, adım uzunluğu, duruş faz adım dizisi, salıncak, salıncak, hız vb bu çalışmada pençe yazdırma alanı ve yüzde veri dönüştürme sonra tek tutumunu değiştirmek kontralateral arasında sola karşı Ipsilateral sağ arka pençe gösterdik. Böylece, bir sonuç % 50 pençe baskı boyutunu ve pençe alan kat, sağ ve sol arasında temas süresi aynı olduğunu gösterir. Buna ek olarak, temas süresi ve boyutu ile karşılaştırıldığında kontralateral yan Ipsilateral arka pençe içinde azalma % 0 yaklaşan alt veri değerlerini belirtmek (bkz: Şekil 2 Masası B ve Şekil 3).

1. Calıştıkları için günde bir 5 gün CCI ameliyattan önce başlayan yürüyüş analiz cihazı 10 dk içinde fareler devam.
   Not: yürüyüş analizi testi calıştıkları dahil olmak üzere karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
2. Fareler için yürüyüş analizi test odası getirmek ve en az 30 dk önce test için onların ev kafeste alışmana
   1. Kur sekmesinde program menüsünü " geçit uzunluğu " 30 cm ve küme için " maksimum süresi çalıştırmak " 5 s ve " maksimum varyasyon çalıştırmak " % 50'ye.
   2. Kayıtlı bir kameradan seçin ' kurulum ' sekmesinde ' programı ' menü.
   3. Seçin " açın edinme " üzerinden ' elde ' sekmesinde ' programı ' menü.
   4. Durum iletisi tıklatın ' snap arka plan ' boş (Yani, boş) geçit arka plan resmini çekmek için düğmesini.
3. 'I tıklatın ' başlamak satın alma ' düğme ve yer bir fare üzerinde geçit; kaydı otomatik olarak fare hareket göre başlar.
   Not: fare açıkça geçit arasında yürürken, program otomatik olarak bu hareket olarak sınıflandırır " çalıştırmak uyumlu " yeşil bir simge ile. Yazılım ayak basmak algılamak başarısız olduysa, deneyci kırmızı bir simge göreceksiniz ve kayıt yinelemeniz gerekir. En az beş başarılı uyumlu çalışır analiz için ihtiyaç vardır.
4. Testten sonra seçin ' ishal sınıflandırmak ' edinme sekmesinden ' programı ' menü.
5. Analizi ve tıklama için çalışır seçin ' otomatik sınıflandırmak ' düğmesini.
   Not: sınıflandırma sonra tüm istatistik parametreleri otomatik olarak kaydedilir ve deneyci tıklatarak sonuçları bulabilirsiniz " görünüm istatistikleri çalıştırmak " Çözümle menüsünde.

Sonuçlar

Biz von Frey testi gerçekleştirilen ve CCI ameliyattan sonra 10 gün kadar yürüyüş analizi CCI farelerde otomatik. İstatistiksel analiz için iki yönlü Varyans analizi (ANOVA) tekrarlanan ölçüleri belirleyen genel etkileri ve Dunnett'ın post-hoc analizi deneysel grupları arasında p değeri belirlemek için gerçekleştirildi.

Şekil 1 ' de gösterilen sonuçları zamanlı Kur...

Tartışmalar

Von Frey filamentler kullanarak mekanik allodynia şu anda, en yaygın ağrı hayvan modellerinde dokunsal aşırı duyarlılık göstermek için kullanılan yöntem ölçümdür. Nöropatik ağrı için hayvan modeller geliştirilmeye devam etmiş gibi duyusal işlev için değerlendirme metodolojisi de geliştirilmiş^8,9,10,15olmuştur. Bu raporları, bu değişiklikler eski yöntemleri daha ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	JW Pharmaceutical	N/A	Vehicle for drugs
1ml syringe	BD Plastipak	300013	Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity)	Sigma	T48402	Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity)	Sigma	152463	Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness)	AILEE	C442	Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin	Sigma	Y0001280	Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps	F.S.T	11051-10	Surgical instrument
Heating Pad	DAESHIN ELECTRONICS	M-303AT	Regulation of body temperature
ICR Mouse	Samtaco	N/A	Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness)	ETHICON	W598H	Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito	F.S.T	13010-12	Surgical instrument
Micro-scissors	F.S.T	14090-09	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Povidone Iodine	Firson	N/A	Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments	North Coast	NC12775-99	Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation