만성 수축 부상으로 쥐에 있는 자동화 된 걸음 걸이 분석

요약

Neuropathic 동물 모델에서 고통 응답의 정확한 평가 통증 질환의 병 태 생리학을 조사 하 고 새로운 진통제 개발에 중요 한. 우리는 뒷 다리 발 자동된 보 행 분석 시스템에 의해 설치류의 감각 기능을 결정 하는 과민 하 고 객관적인 방법을 제시.

초록

폰 Frey 테스트 neuropathic 고통 동물의 감각 기능 검사에 널리 이용 되는 고전적인 방법 이다. 그러나, 그것은 주관적인 데이터와 같은 몇 가지 단점이 고 숙련 된, 경험 있는 실험의 요구 사항이 있다. 날짜 하려면, 다양 한 수정 폰 Frey 방법 개선 하지만 여전히 몇 가지 한계가 있다. 최근 보고서는 걸음 걸이 분석 neuropathic 동물에서 더 정확 하 고 객관적인 데이터를 생성 하는 건의 했다. 이 프로토콜을 쥐에 neuropathic 고통의 결정 자동화 된 걸음 걸이 분석을 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 새 환경 순응의 몇 일 후 쥐 발자국을 밝히는 유리 바닥에 자유롭게 걸을 허용 되었다. 발자국과 걸음 걸이의 정량화 발 인쇄, 그네 시간, 발, 등 의 각도의 영역 등 다양 한 걷는 매개 변수 자동 분석 비디오 클립을 통해 수행 된 다음,

이 연구의 주요 목적은 자동화 된 걸음 걸이 분석의 방법론을 설명 하 고 간단히 폰 Frey 필 라 멘 트를 사용 하 여 고전적인 감각 테스트에서 데이터와 비교 하는 것입니다.

서문

외상, 대사 장애, 염증, 감염, 허 혈에 의해 유도 된 신경의 병 적인 변화 또는 자가 면역 질환은 때때로 neuropathic 고통, 병 변 또는 질병의 직접적인 결과로 발생 하는 통증으로 정의 되는 결과 somatosensory 시스템¹에 영향을 미치는. Neuropathic 고통을 일반적으로 견딜 수 이며 불행 하 게도, 기존의 진통제 일반적으로 생성 하지 않습니다 충분 한 고통 릴리프². Neuropathic 고통의 주요 기능은 자연과 자극 갖는 (즉, 용어인 및 통) 통증을 포함합니다. 용어인 가벼운 터치 등 따뜻한 자극 일반적으로 비-고통 스러운 자극에 나타나는 nociceptive 응답 이다. 통 유해 기계적 또는 열 자극³에 향상 된 고통 응답을 나타냅니다. 비록이 두 증상 모두 비판적으로 환자의 삶의 질 저하, 기계적 용어인 부드러운 촉각 자극에 의해 불러 일으켰다는 가장 악화 증상 부드러운 접촉은 일상 생활에서 피하기 어렵다 때문입니다.

기본 메커니즘 및 neuropathic 고통의 처리를 위한 새로운 진통제를 조사, 고통 응답의 정확한 측정은 필수적입니다. 수많은 neuropathic 고통을 동물 모델 개발 nociceptive 답변은 뒷 다리에 때문에 그것의 높은 접근성^4,5,,67지역 발. 따라서, 대부분 통증 응답 평가 폰 Frey 필 라 멘 트 같은 특별 한 악기를 사용 하 여 기계적 자극을 적용 하 여 뒷 발 발바닥 또는 등 쪽 표면에 수행 되었습니다. 가장 자주 사용 되는 방법 중 하나는 최대 이며 딕슨에 의해 설명 하는 방법을 아래로⁸ 그리고 나중 수정 버전^9,10. 그러나, 매우 숙련 된, 경험 있는 경험 폰 Frey 테스트를 수행 하는 데 필요한 되며 결과 주관적 일 수 있습니다.

자동된 보 행 분석 시스템은 자유롭게 이동 하는 설치류에서 걷기의 다양 한 매개 변수를 측정 하 여 신경 및 신경 근육 학 장애를 조사할 수 있습니다. 다양 한 신경 손상 동물 모델에서에서 nociception 정도와 여러 치료의 antinociceptive 효과 평가 될 수는 고통 자극^11,12,13, 를 추가 하지 않고 ¹⁴.이 분석 시스템 같은 정적 및 동적 걸음 걸이 매개 변수를 검색할 수 있습니다: 인쇄 영역 (바닥 연락처 전체 발 인쇄의 영역)를 발, 발 강도 (접촉 발 영역의 평균 강도), 길이 (보 폭 같은 발의 연속 게재 위치 사이의 거리), 자세 단계 (단일 뒷 발에 대 한 지상 접촉의 기간), 단계 시퀀스 (순서는 4 발 바닥에 배치 됩니다), 스윙 (스윙 단계 기간), 그리고 스윙 속도 (계산 기간에서 보 폭 길이 스윙과 초당 픽셀으로 표시). 이 종이 사용 분석 시스템 및 하 고 만성 수축 부상 (CCI) neuropathic 마우스를 사용 하 여 폰 Frey 테스트와 함께 데이터의 간단한 비교를 제공 합니다.

프로토콜

모든 실험 통증 연구에 대 한 국제 협회의 윤리 지침에 따라 실시 했다와 충남대 (에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 대전, 한국).

1. 좌 골 신경에 CCI 유도

1. 집 남성 ICR 마우스 제어 실내 온도 (20-25 ° C에서 유지 하는)와 습도 (40-60%), 12 h 명암 주기에서 20-25 g 무게 무료 음식에 접근 하 고 물입니다. 수술 하기 전에 적어도 일주일의 동물 관리 실에서 쥐에 대 한 새 환경 순응 기간 허용.
   1. 주택, 동안 모양 및 마우스의 동작을 관찰 하 고 비정상적인 운동 활동을 보여주는 마우스를 사용 하지 마십시오.
      참고: CCI 수술 전에 1 일 폰 Frey 필 라 멘 트를 적용 하 여 뒷 발을의 기계적 감도 측정 하 고 정상적인 기준선 값 자동된 걸음 걸이 분석을 수행. 마우스 제어 및 실험적인 그룹에 무작위로 할당 다음,.
2. 수술 당일, 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, 복 (IP))를 주입 하 여 마우스 anesthetize.
   참고: 외과 용 가운, 장갑, 마스크 등 개인 보호 장비를 착용 하십시오.
3. 2,2,2 tribromoethanol의 2.5 g의 무게와 5 mL의 최종 볼륨을 2-메 틸-2-buthanol를 추가 합니다. 멀리 빛 솔루션 유지 (예를 들어, 어두운 컨테이너를 사용 하 여 또는 호 일에 포장).
   1. 40 ° C에가 열 하 고 10-30 분에 대 한 교 반에 의해 완전히 분해를 허용 시 약
   2. 증류수 200 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고 잘 혼합 때까지 저 어.
   3. 4 ° C에서 aliquots를 저장 하 고 어둠 속에서 계속. 2 주 후, 마 취 새로운 aliquots로 대체 되어야 합니다.
   4. 주사 1 g 몸 무게 당 20 µ L의 볼륨. 예를 들어 마우스의 몸 무게는 25 g, 500 µ L의 솔루션을 제공 합니다. 이 마 취의 일반적인 기간은 1 h.
      참고:이 솔루션 빛에 노출 되 면 유독한 될 것입니다 하거나 열 빛과 열에 노출 하지 않도록 조심 해야 합니다. IP 주입 경로 사용 하지 않는 것이 좋습니다.
4. 마우스 깊은 마 취에 빠지고 때 (즉, 발생 하기 쉬운 위치)를 등 쪽으로 운영 테이블에 그것을 배치 하 고 70% 알코올 면봉으로 오른쪽의 외부 중반 허벅지 영역 소독.
   참고: 꼬 집 거 나 뒷 발 또는 꼬리에 자극 압력에 응답의 부족을 확인 하 여 깊은 마 취 확인.
5. 마우스 오른쪽 좌 골 신경에 CCI 유도.
   1. 메스 칼 날 길이가 1.0-1.5 cm의 중반 허벅지 주변 피부에 절 개를 만들기.
   2. 노골적 노출 좌 골 신경에 마이크로-모기 hemostat와 허벅지 근육을 해 부.
   3. 3 번 4-0 크롬 다 봉합 사를 사용 하 여 1.0-1.5 m m 간격으로 노출 된 좌 골 신경 선.
      참고: 가벼운 떨고 동측 뒷 발에 나타날 때까지 좌 골 신경에서 매 여 느슨한 ligations를 확인 합니다. 쥐의 가짜 그룹 받은 신경 결 찰 하지 않고 제외 하 고 비슷한 조건에서 같은 외과 여.
6. 3-4 5-0 실크를 사용 하 여 간단한 중단 봉합 수술 열기를 닫고 povidone 요오드 수술의 바깥 영역의 살 균 소독.
7. 수술 후,가 열 패드에서 깨끗 한 장에 마우스 장소. 동물 마 취에서 회복은 때 케이지 그들의 가정 그들이 돌아갑니다.
   참고:이 연구에서 항생제 안 사용 되었다. 일단 긍정적인 제어로 매일 50 mg/kg의 복용량에 CCI + GBP 받은 그룹 IP gabapentin (GBP).

2. 기계적인 용어인의 측정 (테스트 폰 Frey)

참고: 동측 뒷 발의 발바닥 표면에 폰 Frey 필 라 멘 트의 1 g를 사용 하 여 기계적 자극에 철수 응답의 주파수를 평가.

1. 각 시험 당일 행동 테스트 룸에 마우스를가지고 하 고는 테스트 하기 전에 적어도 30 분 동안 그들의 자신의 가정 장에 마우스 적응
   참고: 외과 용 가운, 장갑, 마스크 등 개인 보호 장비를 착용.
2. 금속 메쉬 바닥에 투명 한 아크릴 상자에 마우스를 놓고 마우스 30 분에 대 한 적응
3. 부드럽게 1 g 폰 Frey 필 라 멘 트의 뒷 발의 발바닥 표면에 적용 하는 필 라 멘 트 굴절 될 때까지.
4. 적용 필 라 멘 트 자극 동측 뒷 다리를 10 번 이상 10 s 간격으로 발 하 고 결과 기록.
   참고:이 연구에서 10 타석에서 발 철수 응답 수 발 철수 주파수 (PWF, %)의 비율로 표시 됩니다. 폰 Frey 테스트 CCI 수술 후 매 2 일 수행한.

3. 걸음 걸이 분석 자동화

참고: 동물 걷고는 및 매개 변수를 자동으로 다양 한 걸음 걸이 분석 하는 동안 각 발 인쇄를 시각화 하는 걸음 걸이 분석 시스템, 등으로 발 인쇄, 강도, 보 폭 길이, 발 자세 위상, 스텝 시퀀스, 스윙, 스윙 속도, 등이 연구에서 우리는 발 인쇄 영역 및 백분율 데이터 변환 후 하나의 자세 변경 contralateral 사이 왼쪽 동측 오른쪽 뒷 발 대 보였다. 따라서, 50%의 결과 나타냅니다 발 인쇄의 크기와 바닥, 왼쪽과 오른쪽 사이의 접촉 발 지역 기간 동일한. 또한 0%에 접근 하는 더 낮은 데이터 값 표시 크기와 접촉의 기간 contralateral 측면에 비해 동측 뒷 발에 감소 (참조 그림 2의 B 패널 및 그림 3).

1. 새 환경 순응, 계속 10 분 걸음 걸이 분석 장치 내에서 마우스 CCI 수술 전 5 일 하루에 한 번.
   참고: 새 환경 순응을 포함 한 걸음 걸이 분석 테스트는 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.
2. 걸음 걸이 분석을 위한 검사 실에 쥐 하 고는 테스트 하기 전에 적어도 30 분 동안 그들의 가정 장에 적응
   1. 프로그램 메뉴의 설정 탭에서 설정는 " 산책로 길이 " 30 cm, 그리고 설정 하는 " 기간을 실행 하는 최대 " 5 s와 " 변화를 실행 하는 최대 " 50%.
   2. 선택에서 등록 된 카메라는 ' 설치 '의 탭은 ' 프로그램 ' 메뉴.
   3. 선택 " 수집 열 "에서 ' 취득 '의 탭에서 ' 프로그램 ' 메뉴.
   4. 상태 메시지 다음 클릭은 ' 배경 스냅 ' (즉, 빈) 빈 보도의 배경 그림을 버튼.
3. 클릭는 ' 수집을 시작 ' 버튼 및 산책로;에 마우스를 놓고 녹음 마우스의 움직임에 따라 자동으로 시작 됩니다.
   참고: 때 마우스는 명확 하 게 산책로에서 산책, 프로그램 자동으로 분류로이 이동 " 준수 실행 " 녹색 아이콘. 소프트웨어를 발 인쇄를 검색 하지 못했습니다, 경우는 실험 빨간색 아이콘을 볼 것 이다 하 고 녹음을 반복 해야 합니다. 적어도 5 개의 성공적인 준수 실행 분석을 위해 필요 하다.
4. 선택 테스트 후 ' 실행 분류 '의 취득 탭에서는 ' 프로그램 ' 메뉴.
5. 선택 분석 및 클릭에 대 한 실행은 ' 자동 분류 ' 단추.
   참고: 분류, 후 모든 통계 매개 변수는 자동으로 저장 하 고는 실험 클릭 하 여 결과 찾을 수 있습니다 " 보기 실행 통계 " 분석 메뉴에서.

결과

우리 폰 Frey 테스트를 수행 하 고 CCI 수술 후 10 일 이내 CCI 쥐에서 걸음 걸이 분석을 자동화. 통계 분석에 대 한 양방향 분산 분석 (ANOVA)의 반복된 측정 전반적인 효과 결정 하 고 Dunnett의 게시물-특별 분석 실험 그룹 중 p-값을 결정 하기 위해 수행 합니다.

그림 1 에 표시 된 결과 고전 폰 Frey 테스트 ?...

토론

현재 폰 Frey 필 라 멘 트를 사용 하 여 기계적 용어인의 측정은 가장 널리 방법 고통 동물 모델에서 보여 주기 위해 사용 촉각 과민 증. Neuropathic 고통에 대 한 동물 모델 개발을 계속, 감각 기능에 대 한 평가의 방법론이 되었습니다 또한 향상 된^8,,910,15. 그 보고서에서 그것은 이러한 수정 이전 방법에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	JW Pharmaceutical	N/A	Vehicle for drugs
1ml syringe	BD Plastipak	300013	Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity)	Sigma	T48402	Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity)	Sigma	152463	Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness)	AILEE	C442	Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin	Sigma	Y0001280	Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps	F.S.T	11051-10	Surgical instrument
Heating Pad	DAESHIN ELECTRONICS	M-303AT	Regulation of body temperature
ICR Mouse	Samtaco	N/A	Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness)	ETHICON	W598H	Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito	F.S.T	13010-12	Surgical instrument
Micro-scissors	F.S.T	14090-09	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Povidone Iodine	Firson	N/A	Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments	North Coast	NC12775-99	Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation