Analisi automatizzata di andatura in topi con lesione da costrizione cronica

Riepilogo

La valutazione precisa della risposta di dolore in un modello animale neuropatico è fondamentale per studiare la fisiopatologia di malattie dolore e sviluppare nuovi analgesici. Presentiamo un metodo sensibile e oggettivo per determinare la funzione sensoriale del roditore posteriore della zampa di un sistema di analisi automatizzata di andatura.

Abstract

Il test di von Frey è un metodo classico che è stato ampiamente utilizzato per esaminare la funzione sensoriale degli animali di dolore neuropatico. Tuttavia, essa ha alcuni svantaggi come dati soggettivi e il requisito di uno sperimentatore qualificato, con esperienza. Ad oggi, una varietà di modifiche hanno migliorato il metodo di von Frey, ma ha ancora alcuni limiti. I rapporti recenti hanno suggerito che l'analisi di andatura produce dati più accurati e oggettivi dagli animali neuropatici. Questo protocollo viene illustrato come eseguire l'analisi automatizzata di andatura per determinare il grado di dolore neuropatico nei topi. Dopo diversi giorni di acclimatazione, i topi sono stati permessi camminare liberamente il piano di vetro per illuminare le impronte. Allora, quantificazione delle impronte e andatura sono stati effettuati attraverso video clip con analisi automatica dei vari parametri a piedi, come zona di zampa stampa, swing tempo, angolo di zampa, ecc.

Lo scopo principale di questo studio è di descrivere la metodologia di analisi automatizzata di andatura e brevemente confrontarlo con i dati della prova sensoriale classica utilizzando filamento di von Frey.

Introduzione

Alterazioni patologiche del sistema nervoso indotto da disfunzione metabolica, infiammazione, infezione, trauma, ischemia, o malattia autoimmune occasionalmente provocare dolore neuropatico, che è definito come un dolore derivanti come conseguenza diretta di una lesione o malattia che interessano il sistema somatosensoriale¹. Il dolore neuropatico è solito insopportabile e purtroppo, analgesici convenzionali generalmente non producono sufficiente dolore sollievo². Delle principali caratteristiche del dolore neuropatico contiene spontanei ed evocato da stimolazione dolori (cioè, allodinia e iperalgesia). Allodynia è una risposta nocicettiva che si verifica a stimoli normalmente non doloroso, come tocco leggero o stimolazione calda. Iperalgesia indica una risposta avanzata dolore a stimoli nocivi di meccanica e/o termica³. Anche se questi due sintomi sia criticamente compromettere la qualità della vita del paziente, allodinia meccanica evocata dalla stimolazione tattile delicata è il sintomo più aggravante perché contatto soffice è difficile da evitare nella vita quotidiana.

Per studiare il meccanismo sottostante e nuovi analgesici per il trattamento del dolore neuropatico, la misura precisa della risposta dolore è essenziale. Numerosi modelli animali di dolore neuropatico hanno sviluppato risposte nocicettive su hind zampa zona a causa della sua elevata accessibilità^4,5,6,7. Così, la maggior parte delle valutazioni di risposta di dolore sono stata effettuata sulla superficie plantare o dorsale della zampa posteriore mediante l'applicazione di stimoli meccanici utilizzando strumenti speciali, come filamenti di von Frey. Uno del metodo più frequentemente usato è il su e giù metodo descritto da Dixon⁸ e la successiva modifica versioni^9,10. Tuttavia, gli sperimentatori molto qualificati, esperti sono necessari per eseguire il test di von Frey e i risultati possono essere soggettivi.

Il sistema di analisi automatizzata di andatura può indagare disturbi neurologici e neuromuscolari misurando vari parametri di camminare liberamente commoventi roditori. In una varietà di modelli animali di lesione del nervo, il grado di nocicezione e l'effetto antinocicettivo di parecchi trattamenti può essere valutati senza l'aggiunta di un dolore stimolazione^{11,12,13, 14}. questo sistema di analisi in grado di rilevare i parametri statici e dinamici di andatura, come: zampa stampa area (area di stampa completa zampa che entra in contatto con il pavimento), paw intensità (l'intensità media della zona come contattare zampa), (la lunghezza della falcata atteggiamento di distanza tra successivi posizionamenti della zampa stessa), fase (la durata del contatto con il terreno per una sola zampa posteriore), sequenza di passi (l'ordine in cui i quattro zampe sono collocati al piano), (la durata della fase dinamica) e velocità (calcolata di rotazione dalla lunghezza della falcata swing durata ed espressi in pixel al secondo). Questo documento viene illustrato l'utilizzo di un sistema di analisi e fornisce un breve confronto dei dati con il test di von Frey utilizzando topi costrizione cronica lesioni (CCI).

Protocollo

tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche dell'associazione internazionale per lo studio del dolore e sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale presso l'Università nazionale di Chungnam ( Daejeon, Corea del Sud).

1. induzione di CCI sul nervo sciatico

1. topi ICR maschii di casa pesa 20-25 g sotto un ciclo luce/buio di 12 h a temperatura ambiente controllata (mantenuta a 20-25 ° C) e umidità (40-60%), con libero accesso al cibo e acqua. Consentire un periodo di acclimatazione per topi in camera cura degli animali di almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico.
   1. Durante l'alloggiamento, osservare l'aspetto e il comportamento dei topi e non utilizzare topi risultati anormali attività locomotrice.
      Nota: Un giorno prima dell'intervento CCI, misurare la sensibilità meccanica della zampa posteriore applicando filamenti di von Frey ed eseguire l'analisi di andatura automatizzati per ottenere valori basali normali. Quindi, assegnare casualmente topi di controllo e nei gruppi sperimentali.
2. Il giorno dell'intervento, anestetizzare topi iniettando 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, intraperitoneale (IP)).
   Nota: Indossare dispositivi di protezione individuale come camice chirurgico, guanti e maschera.
   1. Pesare 2,5 g di 2,2,2-tribromoethanol e aggiungere 2-metil-2-buthanol al volume finale di 5 mL. Mantenere la soluzione lontano dalla luce (ad esempio, utilizzare un contenitore scuro o avvolgere in un foglio).
   2. Attendere che i reagenti per sciogliere completamente da riscaldamento a 40 ° C e mescolare per 10-30 min.
   3. Aggiungere acqua distillata fino al volume finale di 200 mL e mescolare fino a quando mescolati bene.
   4. Conservare le aliquote a 4 ° C e tenere all'oscuro. Dopo due settimane, l'anestetico deve essere sostituito con nuove aliquote.
   5. Iniettare un volume di 20 µ l per peso corporeo di 1 g. Ad esempio, se il peso del corpo del mouse 25g, dare 500 µ l di soluzione. La durata tipica di questa anestesia è 1 h.
      Nota: Questa soluzione diventa tossica quando esposto alla luce e/o calore quindi state attenti a evitare l'esposizione alla luce e al calore. Una route di iniezione IP è altamente raccomandata.
3. Quando il mouse cade in anestesia profonda, metterla sul tavolo operatorio con il lato dorsale alto (cioè, posizione prona) e sterilizzare l'area metà coscia esterna del lato destro con un tampone di alcool al 70%.
   Nota: Confermare l'anestesia profonda controllando la mancanza di risposta a pizzicare o pressione stimolo sulla zampe posteriori o coda.
4. Indurre il CCI sul nervo sciatico destro del mouse.
   1. Fare un'incisione sulla pelle intorno alla zona di metà coscia di 1.0-1.5 cm di lunghezza con una lama per bisturi.
   2. Senza mezzi termini sezionare i muscoli della coscia con il micro-zanzara pinza emostatica per esporre il nervo sciatico.
   3. Legare il nervo sciatico esposto 3 volte con intervalli di 1.0-1.5 mm utilizzando una sutura in catgut cromico 4-0.
      Nota: Assicurarsi di legature sciolti legando fuori il nervo sciatico fino a lieve agitazione sulla zampa posteriore ipsilateral. Il gruppo sham dei topi ha ricevuto la stessa apertura chirurgica in condizioni simili tranne senza legatura del nervo.
5. Chiudere l'apertura chirurgica con 3-4 i suturare interrotti semplici usando la seta di 5-0 e sterilizzare con povidone iodio per la disinfezione della zona esterna della chirurgia.
6. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse in una gabbia pulita su un rilievo di riscaldamento. Quando gli animali vengono recuperati dall'anestesia, restituirli alla loro gabbia casa.
   Nota: In questo studio, gli antibiotici non sono stati usati. CCI + GBP gruppo ricevuto IP gabapentin (GBP) ad una dose di 50 mg/kg una volta al giorno come controllo positivo.

2. Misurazione di allodinia meccanica (Test di von Frey)

Nota: valutare la frequenza della risposta agli stimoli meccanici ritiro utilizzando 1 g di filamento di von Frey sulla superficie plantare della zampa posteriore ipsilateral.

1. Su ogni giorno di prova, portare i topi in camera test comportamentali e acclimatare i topi nella propria gabbia a casa per almeno 30 minuti prima del test.
   Nota: Indossare dispositivi di protezione individuale come camice chirurgico, guanti e maschera.
2. Mettere il mouse in una scatola trasparente acrilico al piano di maglia metallica e acclimatazione il mouse per 30 min.
3. Applicare delicatamente 1 g di filamento di von Frey alla superficie plantare della zampa posteriore, fino a quando il filamento piega.
4. Stimolazione filamento applica a ipsilateral hind zampa 10 volte con intervalli di almeno 10 s e registrare il risultato.
   Nota: In questo studio, il numero di risposte di ritiro della zampa da 10 prove è indicato come percentuale della frequenza di ritiro della zampa (PWF, %). Il test di von Frey è stato effettuato ogni due giorni dopo l'intervento chirurgico CCI.

3. Esecuzione di analisi di andatura automatizzato

Nota: il sistema di analisi di andatura Visualizza ogni stampa zampa mentre l'animale sta camminando e analizza automaticamente i vari parametri di andatura, tali come stampa, della zampa zampa intensità, lunghezza della falcata, posizione fase, sequenza di passi, swing, swing velocità, ecc In questo studio, abbiamo dimostrato che cambiare area di stampa della zampa e singola posizione dopo aver convertito i dati in percentuale tra controlaterale sinistra contro zampa destra posteriore ipsilateral. Così, un risultato del 50% indica che la dimensione della stampa zampa e la durata della zampa zona a contatto con la terra, tra i lati destro e sinistro sono gli stessi. Inoltre, valori di dati inferiori si avvicina 0% indicano che la dimensione e la durata del contatto sono diminuiti nella zampa posteriore ipsilaterale rispetto al lato controlaterale (vedi pannello B della Figura 2 e Figura 3).

1. Per acclimatazione, tenere i topi all'interno del dispositivo di analisi di andatura per 10 minuti una volta al giorno iniziando 5 giorni prima dell'intervento CCI.
   Nota: Prova di analisi di andatura tra cui acclimatazione deve essere eseguita al buio.
2. Portare i topi per la camera di prova per l'analisi di andatura e ambientarsi nella loro gabbia a casa per almeno 30 minuti prima del test.
   1. Nella scheda di impostazione del menu del programma, impostare il " lunghezza passerella " a 30 cm e insieme la " corsa durata massima " a 5 s e il " corsa variazione massima " al 50%.
   2. Selezionare una telecamera registrata dal ' installazione ' scheda del ' programma ' menu.
   3. Selezionare " aprire acquisizione " dalla ' acquisire ' scheda del ' programma ' menu.
   4. Dopo il messaggio di stato, fare clic il ' sfondo a scatto ' pulsante per scattare una foto di sfondo della passerella vuota (cioè, spazio in bianco).
3. Scegliere la ' Avvia acquisizione ' pulsante e posizionare un mouse sulla passerella; la registrazione si avvia automaticamente in base al movimento del mouse.
   Nota: Quando il mouse entra chiaramente attraversare il passaggio pedonale, il programma classifica automaticamente questa mossa come " Compliant eseguire " con un'icona verde. Se il software non è riuscito a rilevare la stampa del piede, lo sperimentatore verrà visualizzata un'icona rossa e dovrà ripetere la registrazione. Almeno cinque piste compatibile con successo sono necessari per l'analisi.
4. Dopo il test, selezionare ' classificare corre ' dalla scheda di acquisizione della ' programma ' menu.
5. Selezionare le esecuzioni per analisi e clicca la ' auto classificare ' pulsante.
   Nota: Dopo la classificazione, tutti i parametri di statistica vengono salvati automaticamente e lo sperimentatore può trovare i risultati cliccando " Vista eseguire statistiche " dal menu Analizza.

Risultati

Abbiamo eseguito il test di von Frey e analisi di andatura in topi CCI automatizzata fino a 10 giorni dopo l'intervento chirurgico CCI. Per l'analisi statistica, le misure ripetute di analisi della varianza (ANOVA) bidirezionale determina gli effetti complessivi e analisi post-hoc di Dunnett è stato effettuato per determinare il valore di p tra i gruppi sperimentali.

I risultati mostrati nella Figu...

Discussione

Attualmente, la misura di allodinia meccanica utilizzando filamenti di von Frey è il più usato metodo in modelli animali di dolore per dimostrare ipersensibilità tattile. Come modelli animali di dolore neuropatico hanno continuato ad essere sviluppato, la metodologia di valutazione per la funzione sensitiva è stata anche migliorata^8,9,10,15. In tali rapporti, è stato suggerito che queste m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	JW Pharmaceutical	N/A	Vehicle for drugs
1ml syringe	BD Plastipak	300013	Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity)	Sigma	T48402	Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity)	Sigma	152463	Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness)	AILEE	C442	Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin	Sigma	Y0001280	Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps	F.S.T	11051-10	Surgical instrument
Heating Pad	DAESHIN ELECTRONICS	M-303AT	Regulation of body temperature
ICR Mouse	Samtaco	N/A	Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness)	ETHICON	W598H	Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito	F.S.T	13010-12	Surgical instrument
Micro-scissors	F.S.T	14090-09	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Povidone Iodine	Firson	N/A	Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments	North Coast	NC12775-99	Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation