Automatisierte Ganganalyse bei Mäusen mit chronischen Verengung Verletzungen

Zusammenfassung

Die genaue Beurteilung der Schmerz Antwort in einem neuropathischen Tiermodell ist entscheidend für die Pathophysiologie der Schmerzen Krankheiten erforschen und entwickeln neue Analgetika. Wir präsentieren Ihnen eine sensible und objektive Methode, um die sensorische Funktion des Nagers zu bestimmen, die hinteren durch eine automatisierte Gang-Analyse-System Pfote.

Zusammenfassung

Der von Frey-Test ist eine klassische Methode, die am meisten benutzt gewesen, die sensorische Funktion von neuropathischen Schmerzen Tiere zu untersuchen. Es hat jedoch einige Nachteile, wie subjektive Daten und das Erfordernis der qualifizierten, erfahrenen Experimentator. Bisher haben sich eine Vielzahl von Modifikationen von Frey-Methode verbessert, aber es hat noch ein paar Einschränkungen. Jüngste Berichten zufolge Ganganalyse genaue und objektive Daten von den neuropathischen Tieren produziert. Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie die automatisierten Ganganalyse bestimmen den Grad des neuropathischen Schmerzes bei Mäusen durchführen. Nach einigen Tagen der Akklimatisation durften die Mäuse frei bewegen auf dem Glasboden, Fußabdrücke zu beleuchten. Dann, Quantifizierung der Fußabdrücke und Gang durch video-Clips mit automatischen Analyse verschiedener zu Fuß Parameter, wie z. B. Bereich hinweg Paw print, Schaukel, Winkel der Pfote usw. durchgeführt wurden

Diese Studie dient zur Beschreibung der Methodik der automatisierten Ganganalyse und kurz mit Daten aus dem klassischen sensorischen Test unter Verwendung von Frey Filament vergleichen.

Einleitung

Pathologische Veränderungen des Nervensystems induziert durch Stoffwechselstörungen, Entzündung, Infektion, Trauma, Ischämie oder Autoimmunkrankheit führen gelegentlich zu neuropathischen Schmerzen, definiert als ein Schmerz entstehen als direkte Folge einer Verletzung oder Krankheit Auswirkungen auf das somatosensorische System¹. Neuropathischer Schmerz ist in der Regel unerträglich und leider herkömmliche Schmerzmittel in der Regel produzieren nicht ausreichend Pain Relief². Ein wesentliches Merkmal des neuropathischen Schmerzes enthält spontane und Stimulation hervorgerufen (d.h., Allodynie und Hyperalgesie) Schmerzen. Allodynie ist ein nozizeptiven Antwort, die normalerweise nicht schmerzhafte Reize, wie leichte Berührung oder warme Stimulation erfolgt. Hyperalgesie zeigt eine verstärkte Schmerzen Reaktion auf mechanische oder thermische Schmerzreize³. Obwohl diese beiden Symptome sowohl kritisch den Patienten Lebensqualität beeinträchtigen, ist mechanische Allodynie, hervorgerufen durch sanfte taktile Stimulation der meisten erschwerenden Symptom denn weichen Kontakt schwierig, im Alltag zu vermeiden.

Die zugrunde liegende Mechanismus und neue Analgetika zur Behandlung von neuropathischen Schmerzen, untersuchen die präzise Messung der Schmerzen Antwort ist wichtig. Zahlreiche Tiermodelle der neuropathischen Schmerzen entwickelten nozizeptiven Reaktionen auf die hinteren Pfote Bereich wegen seiner hohen Zugänglichkeit^4,5,6,7. So wurden die meisten Schmerzen Antwort Bewertungen auf der plantar oder dorsal Oberfläche der Hinterpfote durchgeführt, durch die Anwendung mechanischer Reize mit speziellen Instrumenten, wie z. B. von Frey Filamente. Eines der am häufigsten verwendete Methode ist die Up und down-Methode von Dixon beschrieben geändert⁸ und den späteren Versionen^9,10. Allerdings sehr qualifizierte und erfahrene Experimentatoren sind verpflichtet, die von Frey-Test durchführen und die Ergebnisse möglicherweise subjektiv.

Das automatisierte Gang-Analyse-System kann neurologische und neuromuskuläre Erkrankungen untersuchen, durch die Messung verschiedener Parameter des Gehens in frei beweglichen Nagetiere. In einer Vielzahl von Tiermodellen Nerv Verletzung können der Grad der Nozizeption und die antinozizeptive Wirkung von mehreren Behandlungen ausgewertet werden ohne Zugabe von einem Schmerz Stimulation^{11,12,13, 14}. das Analysesystem kann statische und dynamische Gangartparameter, wie z. B. erkennen: paw print Bereich (Bereich die komplette Paw Print, die Kontakt mit dem Boden), Pfote Intensität (die durchschnittliche Intensität der sich berührenden Pfote Gegend), Länge (die Schrittlänge Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Platzierungen von der gleichen Pfote), Haltung phase (die Dauer der Bodenkontakt für einen einzigen Hinterpfote), Schrittfolge (die Reihenfolge, in der die vier Pfoten, sind auf den Boden gelegt), schwingen (die Dauer der Schwungphase) und Geschwindigkeit (berechnet zu schwingen von stride Länge und Dauer zu schwingen und ausgedrückt als Pixel pro Sekunde). Dieser Beitrag veranschaulicht die Verwendung eines Analyse-System und bietet einen kurzen Vergleich der Daten mit den von Frey-Test mit chronischen Verengung Verletzungen (CCI) neuropathischen Mäuse.

Protokoll

alle Experimente wurden im Einklang mit der ethischen Richtlinien der internationalen Vereinigung zum Studium des Schmerzes und wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Chungnam National University (genehmigt Daejeon, Südkorea).

1. Induktion des CCI auf Ischiasnerv

1. Haus männlichen ICR Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g unter einem 12 h hell/dunkel-Zyklus bei kontrollierter Raumtemperatur (gehalten bei 20-25 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40-60 %), mit freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Erlauben eine Akklimatisierung für Mäuse in der Tierbetreuung Raum von mindestens 1 Woche vor der Operation.
   1. Im Gehäuse, das Aussehen und Verhalten der Mäuse zu beobachten und verwenden Sie keine Mäuse zeigen abnorme lokomotorische Aktivität.
      Hinweis: Messen Sie einen Tag vor der Operation CCI die mechanische Empfindlichkeit der Hinterpfote durch die Anwendung von Frey Filamente und führen Sie die automatische Ganganalyse um normale Grundlinie Werte zu erhalten. Anschließend weisen Mäuse nach dem Zufallsprinzip Kontroll- und Versuchsgruppen.
2. Am Tag der Operation zu betäuben Mäuse durch Injektion von 2,2,2-Tribromoethanol (250 mg/kg, intraperitoneal (IP)).
   Hinweis: Tragen Sie persönlichen Schutzausrüstung wie OP-Kittel, Handschuhe und Maske.
   1. Wiegen 2,5 g 2,2,2-Tribromoethanol und das endgültige Volumen von 5 mL 2-Methyl-2-Buthanol hinzufügen. Halten Sie die Lösung vom Licht (z.B., verwenden Sie einen dunklen Behälter oder in Folie wickeln).
   2. Allow Reagenzien vollständig durch Erhitzen bei 40 ° C und 10-30 min. unter Rühren auflösen
   3. Destilliertes Wasser auf das Endvolumen von 200 mL hinzufügen und rühren bis alles gut vermischt.
   4. Lagern Aliquote bei 4 ° C und im Dunkeln. Nach zwei Wochen sollte die Narkose mit neuen Aliquote ersetzt werden.
   5. Injizieren ein Volumen von 20 µL pro 1 g Körpergewicht. Zum Beispiel, wenn das Körpergewicht der Maus 25 g, geben Sie 500 µL Lösung. Typische dieser Anästhesie dauert 1 h
      Hinweis: Diese Lösung wird toxisch bei Lichteinfall und/oder Wärme, also seien Sie vorsichtig, Einwirkung von Licht und Hitze zu vermeiden. Eine IP-Injektion Route wird dringend empfohlen.
3. Fällt die Maus in tiefen Narkose, legen Sie es auf dem OP-Tisch mit der dorsalen Seite nach oben (d.h., Bauchlage) und Sterilisieren der Außenbereich der Mitte des Oberschenkels von der rechten Seite mit einem 70 % Alkoholtupfer.
   Hinweis: Bestätigen Sie Tiefe Narkose durch das Ausbleiben einer Reaktion zu kneifen oder Druck Anregung auf die Hinterpfoten oder Endstück überprüfen.
4. Der IHK auf der rechten Ischias-Nerv der Maus zu induzieren.
   1. Einen Einschnitt auf der Haut in der Mitte des Oberschenkels Gegend von 1,0-1,5 cm Länge mit einer Skalpellklinge machen.
   2. Unverblümt sezieren der Oberschenkelmuskulatur mit Micro-Mosquito Gefäßklemme um den Ischiasnerv freizulegen.
   3. Verbinden den exponierten Ischiasnerv 3 Mal mit 1,0-1,5 mm Abständen mit einer 4: 0 Chromsäure Darmsaite Naht.
      Hinweis: Stellen Sie lose grundsätzlich durch Binden von den Ischiasnerv bis mild schütteln auf der ipsilateralen Hinterpfote erscheint. Die Sham-Gruppe von Mäusen erhalten die gleichen chirurgischen Öffnung unter ähnlichen Bedingungen außer ohne Nerv Ligation.
5. Schließen die chirurgische Eröffnung mit 3-4 einfache unterbrochenen Nähten mit 5: 0 Seide und mit Povidon-Jod zur Desinfektion des äußeren Bereichs der Operation sterilisieren.
6. Nach der Operation, platzieren Sie den Mauszeiger in einem sauberen Käfig auf ein Heizkissen. Wenn Tiere aus der Narkose wiederhergestellt werden, zurück in ihre Heimat Käfig.
   Hinweis: In dieser Studie wurden Antibiotika nicht verwendet. Die CCI + GBP Gruppe erhielt IP Gabapentin (GBP) in einer Dosis von 50 mg/kg einmal täglich als Positivkontrolle.

2. Messung der mechanischen Allodynie (Testen von Frey)

Hinweis: bewerten die Häufigkeit der Rückzug Reaktion auf mechanische Reize mit 1 g von Frey Filament zu plantar Oberfläche der ipsilateralen Hinterpfote.

1. Auf jedem Testtag der behavioral Testraum Mäuse bringen und gewöhnen die Mäuse in ihrem eigenen Hause Käfig für mindestens 30 Minuten vor dem Test
   Hinweis: Tragen Sie persönlichen Schutzausrüstung wie OP-Kittel, Handschuhe und Maske.
2. Setzen Sie die Maus in eine transparente Acryl-Box auf dem Boden Metallgewebe und akklimatisieren, die Maus für 30 min.
3. Sanft auftragen 1 g von Frey Filament an die plantar Oberfläche der Hinterpfote bis beugt sich der Glühfaden.
4. Anwenden Filament Stimulation der ipsilateralen Hind Pfote 10 Mal mit Intervallen von mindestens 10 s und dokumentieren Sie das Ergebnis.
   Hinweis: In dieser Studie wird die Anzahl der Pfote Rückzug Antworten von 10 Studien als Prozentsatz der Pfote Rückzug Frequenz (PWF, %) angezeigt. Die von Frey durchgeführt wurde alle zwei Tage nach der Operation CCI.

3. Durchführung von automatisierten Ganganalyse

Hinweis: die Gang-Analyse-System visualisiert jeder Pfote Druck, während das Tier Fuß ist und automatisch verschiedene Gangartparameter analysiert, so wie Print, paw paw Intensität, Schrittlänge, Haltung Phase, Schrittfolge, Schaukel, Schwunggeschwindigkeit etc. In dieser Studie zeigten wir Pfote Druckbereich und einzelne Haltung nach der Konvertierung der Daten in die prozentuale Veränderung zwischen kontralateralen links gegenüber ipsilateral rechten Hinterpfote. So zeigt ein Ergebnis von 50 %, dass die Größe der Pfotenabdruck und die Dauer der Pfote Bereich Kontakt mit Boden, zwischen dem linken und rechten Seiten identisch sind. Darüber hinaus niedriger Datenwerte auf nahezu 0 % zeigen, dass die Größe und Dauer des Kontaktes in der ipsilateralen Hinterpfote im Vergleich zur kontralateralen Seite verringert werden (siehe Tafel B in Abbildung 2 und Abbildung 3).

1. Für die Akklimatisierung, halten die Mäuse innerhalb der Gang-Analysegerät für 10 min. einmal pro Tag ab 5 Tage vor dem Eingriff CCI.
   Hinweis: Sollte Gang-Analysen-Test einschließlich der Akklimatisierung in der Dunkelheit durchgeführt.
2. Bringen die Mäuse in den Testraum zur Ganganalyse und akklimatisieren, in ihre Heimat Käfig für mindestens 30 Minuten vor dem Test
   1. Legen Sie in der Registerkarte "Setup" im Programm-Menü die " Laufbandlänge " 30 cm, und die " maximale Dauer laufen " bis 5 s und der " maximal laufen Variation " auf 50 %.
   2. Wählen Sie eine registrierte Kamera aus der ' Setup ' Registerkarte "von der ' Programm ' Menü.
   3. Wählen Sie " öffnen Erwerb " aus der ' erwerben ' Registerkarte "die ' Programm ' Menü.
   4. Im Anschluss an die Statusmeldung klicken Sie auf die ' snap Hintergrund '-Taste, um die leer (d.h., Blank) Gehweg Hintergrund fotografieren.
3. Klicken Sie auf die ' beginnen Erwerb ' Taste und legen Sie eine Maus auf dem Gehweg; die Aufnahme beginnt automatisch entsprechend der Bewegung der Maus.
   Hinweis: Wenn die Maus deutlich über den Gehweg geht, das Programm automatisch klassifiziert diese Bewegung als " konform laufen " mit einem grünen Symbol. Wenn die Software nicht zu den Fußdruck zu erkennen, der Experimentator wird ein rotes Symbol angezeigt und die Aufnahme wiederholen muss. Mindestens fünf erfolgreiche konforme Ausführungen sind für die Analyse erforderlich.
4. Wählen Sie nach dem Test ' klassifizieren läuft ' aus der Registerkarte "Acquire" das ' Programm ' Menü.
5. Wählen Sie die Läufe für Analyse und klicken Sie auf die ' automatisch klassifizieren ' Schaltfläche ".
   Hinweis: Nach Klassifizierung, alle statistischen Parameter werden automatisch gespeichert und der Experimentator finden die Ergebnisse " Ansicht ausführen Statistik " im Menü analysieren.

Ergebnisse

Wir haben die von Frey-Test durchgeführt und Ganganalyse bei CCI Mäusen bis zu 10 Tage nach der Operation CCI automatisiert. Für statistische Analysen Messwiederholungen des zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt die Gesamtwirkung und Dunnetts Post-hoc- Analyse wurde durchgeführt, um festzustellen, den p-Wert unter den experimentellen Gruppen.

Die in Abbildung 1 dargestellten Ergebni...

Diskussion

Derzeit ist Messung der mechanischen Allodynie mithilfe von Frey Filamente die am weitesten verbreitete Methode in Tiermodellen Schmerzen, um taktile Überempfindlichkeit zu demonstrieren. Tiermodelle für neuropathische Schmerzen weiter zu entwickeln, wurde die Methodik der Bewertung für die sensorische Funktion auch verbesserte^8,9,10,15. In diesen Berichten wurde vermutet, dass diese Änderu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	JW Pharmaceutical	N/A	Vehicle for drugs
1ml syringe	BD Plastipak	300013	Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity)	Sigma	T48402	Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity)	Sigma	152463	Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness)	AILEE	C442	Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin	Sigma	Y0001280	Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps	F.S.T	11051-10	Surgical instrument
Heating Pad	DAESHIN ELECTRONICS	M-303AT	Regulation of body temperature
ICR Mouse	Samtaco	N/A	Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness)	ETHICON	W598H	Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito	F.S.T	13010-12	Surgical instrument
Micro-scissors	F.S.T	14090-09	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Povidone Iodine	Firson	N/A	Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments	North Coast	NC12775-99	Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation