İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Özet

Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için güvenilir bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz.

Özet

İç kulak gen tedavisi büyük söz işitme kaybı ve baş dönmesi için potansiyel bir tedavi olarak sunmaktadır. İç kulak gen terapisi başarısı önemli belirleyicileri işitme kaybı en aza indirerek tutarlı iletim verimliliği hedef hücre tiplerinin sonuçları bir teslimat yöntemi bulmak için biridir. Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için uygun bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz. Posterior semisirküler kanal kolay anatomik tanımlanması, hem de en az gerekli temporal kemik manipülasyon, iç kulak gen teslim için cazip bir seçenek yapmak bu cerrahi yaklaşım.

Giriş

İç kulak gen terapisi araştırma çalışmaları hızla gelişmekte olan bir alandır. Bu savaş ototoksisite, gürültü travma ve kalıtsal işitme kaybı¹çeşitli hayvan modellerinde uygulanmıştır. Birkaç son çalışmalar mutant farelerde iç kulak gen terapisi teslim^2,3,4,5,6sonra^, işitme ve denge işlevlerini fonksiyonel iyileşme göstermiştir ⁷. bir anahtar faktörler iç kulak gen terapisi başarı iç kulak erişmek için kullanılan cerrahi yaklaşım olduğunu belirleme. İdeal olarak, cerrahi yaklaşım gerçekleştirmek kolay olurdu, anatomik işaretlerini tutarlı ve kolay tanımlamak olurdu ve hedeflenen hücre tiplerinin elde edilen iletim yüksek olacaktır.

Bir son çalışmada, viral gen terapisi whirler mutant fare (işitme kaybı ve Vestibüler disfonksiyon bir model) posterior semisirküler kanalından enjekte edildiğinde duyusal saç hücrelerinin verimli iletim Vestibüler içinde görülmüş gösterdi organları de olduğu gibi koklea⁵. Duyusal saç hücre iletim yüksek verimlilik iyileştirme bu mutant farelerde işitsel ve Vestibüler fonksiyonların sonuçlandı.

Bu makalede, Yenidoğan fare iç kulak erişmek için posterior semisirküler kanal yaklaşım biz ayrıntılı olarak tarif.

Protokol

Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Enstitüsü sağırlık ve diğer iletişim bozuklukları (NIDCD ASP1378-15) tarafından kabul edildi.

1. yordam kurulum ve hazırlık

1. Etilen oksit denemenin başında tarafından tüm aletleri sterilize. Hayvanlar arasında boncuk sterilizasyon kullanarak aletleri temiz.
2. Bir micropipette üzerinde mikro-enjektör içine viral gen terapisi içeren çözüm yükleyin. Bu çalışmada kullanılan viral vektör AAV2/8-whirlin yapıldı (1 x 10¹³ genom kopya sayısı mililitre, malzemelerin tabloya bakın).
   Not: Genellikle, 1.1 µL Toplam hacim micropipette yüklenir.

2. anestezi

Not: Bu çalışmada kullanılan fare zorlanma whirler faredir. Homozigoz mutantlar (okul^wi/kablosuz) ve heterozigoz littermates (okul^{+/ wi}) kullanılmıştır.

1. Anne ayrı kafese (çöp ayrıdır) yerleştirin.
2. Fareler sıcak tutmak için bir dolaşım ısı yastık (set 37,5 ° c) üzerinde çöp (P0 - P5 pups) içeren ev kafes yerleştirin.
3. Lateks eldiven başparmak kısmı keser ve bir yavru içine yerleştirir.
4. Yavru bir kova dolusu buz ~ 2 min için lateks eldiven başparmak yerleştirin.
5. İmzalat yavru bir 4 "x 4" gazlı bez pup ve pack'ın yüzeyi arasında büyük kare ticari plastik donma paketiyle yerleştirin.
6. Ağır bir lateks eldiven ezilmiş buz ile doldurun ve buz eldiveni yavru fok çevresinde yer.
7. Yavru fok (bir firma ayak çimdik dahil) çeşitli uyaranlara karşı bir yanıt tam eksikliği ile yeterli anestezi Eğer görmek için kontrol edin. Yavru fok buz torbası (yaklaşık 5-10 dk) ameliyat süresince bırakın.
   Not: Belgili tanımlık pups ameliyat sırasında en fazla 15 dakika buz torbası açık bırakmak öneririz.

3. cerrahi yaklaşım (şekil 1)

1. Hayvan anestezi bir kez deri bir iyot temizleme işlemi ve bir alkol silme ile kulak arkasında temiz.
2. Postauricular kesik ~ 2 mm mikro-makas kullanarak kulağının arkasında olun ve mikro-makas ile boyun kas bölün.
3. Yüz sinir ve bulla tanımlar. Bulla kıkırdak ve yarı saydam bu yaşta ve bu yüz sinir medial yatıyor. Stapedial arter bulla ile yararlı bir dönüm noktası olduğunu bu yaşta görülebilir.
4. Yüz sinir konumlanmıştır ve özafagusu izleyin posterior semisirküler kanal (bundan) bulmak için. Kas lifleri ve yumuşak doku posterior semisirküler kanal mikro-makas kullanarak örten kaldırın.
   Not: Bundan bu yaşta kıkırdak.
5. Bir cam micropipette (~ 10 mikron çapında) mikro-enjektörü kullanarak bundan nüfuz.
6. Viral gen terapisi iç kulak enjekte.
   Not: Genellikle, Toplam 49 20 enjeksiyonlari nL gen tedavisi teslim edilir posterior semisirküler kanal 40 ~ s (Toplam hacim ~ 1 µL). Kullanılan viral titresi mL başına 1 x 10¹³ genom kopya oldu.
7. 5-0 polyglactin dikiş kullanarak cilt kesi kapatın.

4. ameliyat sonrası bakım

1. Yavru fok anestezi sürekli manuel stimülasyon/haddeleme ile eldivenli insan parmak ile kurtarma sırasında normal vücut ısısı geri yüklemek için Isınma bir yastık yerleştirin.
2. Yavru fok uyanık olduğunda, geri onun ev kafesin içine yerleştirin.
3. Her yavru için eve kafes yatak maruz bir pamuk bez ile okşadı.
   Not: Bunun amacı onu çöp ameliyat sonrası yeniden kabul anne olasılığını artırır ameliyat öncesi yaptıkları gibi kokuyorsun fareler sahip olmaktır. Mümkünse, idrar anneden toplanan ve daha fazla reddedilme olasılığını azaltmak için bir pamuklu çubukla kullanarak pups ovuşturdu.
4. Onun⁸duyarsızlaştırmak için annenin Burun madeni yağ uygulayın ve ev kafesin içine annesinin reintroduce.

Sonuçlar

Enjeksiyon AAV8 whirlin gen tedavisi yenidoğan whirler fareler posterior semisirküler kanal aracılığıyla içine %53.1 genel enfeksiyon verimliliği ile sonuçlandı (yeşil) ifadesinde utricular saç hücreleri (Resim 2), whirlin (SD 38,1, n = 28)⁵ . Transduced saç hücreleri uzamış kontralateral sigara enjekte kulaklarından saç hücrelerine göre stereocilia (kırmızı) (5.35 ± 2.11 µm 3.20 ± 0.34 µm, vs sırasıyla)

Tartışmalar

Birkaç cerrahi yaklaşım kemirgen iç kulak erişmek için tarif edilmistir. Posterior semisirküler kanal ve endolymphatic kesesi yaklaşımlar genellikle Vestibüler organları¹erişmek için kullanılır, ancak Cochleostomy ve yuvarlak pencere yaklaşımlar en sık koklea, erişmek için kullanılır. Bir son çalışmada, o posterior semisirküler kanal enjeksiyonları viral gen tedavisi saç hücre iletim Vestibüler organ veya koklea⁵yüksek verimliliği sonuçland?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating microscope	Zeiss		OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts	Fine Science Tools	11251-10, 11295-51	#5 and #55 Dumont
Micro-scissors	Fine Science Tools	15002-08
Nanoliter2000 microinjector	World Precision Instruments
Heating pad	Mastex	Model 500/600
5-0 vicryl sutures	Ethicon
AAV8-whirlin	Vector Biolabs
Glass pipette	Sutter Instruments	B100-75-10	Borosilicate glass