Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Résumé

Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode fiable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne.

Résumé

Thérapie génique oreille interne offre très prometteur comme traitement potentiel pour la perte d’audition et des vertiges. Un des déterminants essentiels de la réussite de la thérapie génique oreille interne est de trouver une méthode de livraison qui se traduit par l’efficacité de transduction cohérente de types cellulaires ciblés tout en minimisant la perte d’audition. Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode viable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne. L’identification facile anatomique du canal semicirculaire postérieur, ainsi qu’une manipulation minimale de l’OS temporal requis, faire cette chirurgie approcher une option attrayante pour la livraison de gène oreille interne.

Introduction

Thérapie génique oreille interne est un champ connaissent un développement rapide de l’enquête. Il a été appliqué dans divers modèles animaux d’ototoxicité combattre trauma de bruit et de perte auditive héréditaire¹. Plusieurs études récentes ont montré une récupération fonctionnelle de l’audition et équilibre des fonctions chez des souris mutantes après oreille interne gene therapy livraison^{2,3,4,5,6, 7}. un des principaux facteurs pour déterminer le succès de la thérapie génique oreille interne est l’approche chirurgicale utilisée pour accéder à l’oreille interne. Idéalement, l’approche chirurgicale serait facile à réaliser, les repères anatomiques serait cohérente et facile à identifier, et la transduction résultante de types de cellules ciblées serait élevée.

Dans une étude récente, nous avons montré que, lorsque la thérapie génique virale a été injectée par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur de la souris mutante danseur (un modèle de perte auditive et de dysfonctionnement vestibulaire), transduction efficace des cellules sensorielles de cheveux a été observée dans le vestibulaire organes ainsi que dans la cochlée⁵. La grande efficacité de la transduction des cellules ciliées sensorielles conduit à une amélioration des fonctions auditives et vestibulaires chez ces souris mutantes.

Dans cet article, nous décrivons en détail l’approche postérieure canal semicirculaire pour accéder à l’oreille interne de souris néonatales.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Institut National sur la surdité et d’autres troubles de la Communication (NIDCD ASP1378-15) et animalier.

1. préparation et installation de procédure

1. Stériliser tous les instruments à l’oxyde d’éthylène dans le début de l’expérience. Entre les animaux, nettoyer les instruments utilisant la stérilisation de la perle.
2. Chargez la solution contenant la thérapie génique virale dans une micropipette sur le micro-injecteur. Le vecteur viral utilisé dans cette étude était AAV2/8-whirlin (1 x 10¹³ copies de génome par millilitre, voir la table des matières).
   Remarque : En général, 1.1 volume total µL est chargé dans une micropipette.

2. anesthésie

Remarque : La souche de souris utilisée dans cette étude est la souris de danseur. Les mutants homozygotes (Whrn^wi/wi) et même portée hétérozygote (Whrn^{+ / wi}) ont été utilisés.

1. Placer la mère dans une cage séparée (séparé de la litière).
2. Placez la cage contenant de la litière (P0 - chiots P5) sur une bouillote recirculation (préréglée à 37,5 ° C) pour garder les souris chaude.
3. Découper la partie de pouce d’un gant en latex et placez un chiot dedans.
4. Placez le chiot au pouce gant en latex dans un seau de glace pendant environ 2 min.
5. Placez le chiot anesthésié sur un pack de grande place commerciale gel en plastique avec de la gaze 4 "x 4" entre le chiot et de la surface de la meute.
6. Remplissez un gant en latex lourds avec de la glace pilée, puis le gant de glace autour du chiot.
7. Vérifier si le chiot est suffisamment anesthésié par une absence totale de réponse à divers stimuli (y compris une pincée de pied ferme). Laissez le chiot sur la banquise pendant la durée de l’intervention (environ 5-10 min).
   Remarque : Nous recommandons de laisser les bébés phoques sur la banquise pendant pas plus de 15 min pendant la chirurgie.

3. abord chirurgical (Figure 1)

1. Nettoyer la peau derrière l’oreille avec une lingette d’iode et un imbibé d’alcool une fois que l’animal est anesthésié.
2. Faire une incision postauricular ~ 2 mm derrière l’oreille à l’aide de micro-ciseaux et diviser le muscle sternocléidomastoïdien avec micro-ciseaux.
3. Identifier le nerf facial et la bulle tympanique. La bulle tympanique est cartilagineux et semi-transparents à cet âge et il se trouve vers le nerf facial. L’artère stapédiens transparaît à travers la bulle tympanique à cet âge, qui est un point de repère utile.
4. Suivez le nerf facial supérieurement et postérieurement pour localiser le canal postérieur de semi-circulaires (PSCC). Retirer les fibres musculaires et des tissus mous, recouvrant le canal semicirculaire postérieur à l’aide de micro-ciseaux.
   Remarque : Le PSCC est cartilagineux à cet âge.
5. Pénétrer le PSCC à l’aide d’une micropipette de verre (~ 10 μm de diamètre) sur la micro-injecteur.
6. Injecter la thérapie génique virale dans l’oreille interne.
   Remarque : En règle générale, un total de 20 injections de 49 nL de la thérapie génique sont livrés dans le canal de semi-circulaires postérieur plus de ~ 40 s (volume total ~ 1 µL). Le titre viral utilisé a été de 1 x 10¹³ génome copies / mL.
7. Refermer l’incision de la peau à l’aide d’une suture de polyglactin 5-0.

4. postopératoire soins

1. Placez le chiot sur un coussin chauffant pour rétablir une température corporelle normale au cours de l’anesthésie avec constante stimulation/roulant manuel avec des doigts humains gantés.
2. Une fois que le chiot est éveillé, il remettre dans sa cage maison.
3. Caressent chaque chiot avec un coton tige qui a été exposé à la literie maison cage.
   Remarque : Le but de ce est que les souris sentir comme ils le faisaient avant l’opération, ce qui augmente la probabilité de la mère re-accepter son post-chirurgie de la litière. Si possible, urine de la mère peut être collecté et frotté sur les chiots à l’aide d’un coton-tige pour réduire davantage le risque de rejet.
4. Appliquez l’huile minérale au nez de la mère pour désensibiliser sa⁸et réintroduire la mère dans la cage.

Résultats

Injection de AAV8-whirlin de thérapie génique chez la souris néonatales danseur à travers le canal semicirculaire postérieur a entraîné whirlin expression (vert) dans les cellules de cheveux utriculaire (Figure 2), avec l’efficacité globale de l’infection de 53,1 % (SD 38.1, n = 28)⁵ . Transduite cellules ciliées avait allongé stéréocils (rouge) par rapport aux cellules ciliées controlatérale oreilles non injectés (5...

Discussion

Plusieurs approches chirurgicales ont été décrites pour accéder aux rongeurs des oreilles internes. Cochleostomy et approches de la fenêtre ronde sont utilisés couramment pour accéder à la cochlée, tandis que le postérieur canal semicirculaire et approches du sac endolymphatique sont généralement utilisés pour accéder les organes vestibulaires¹. Dans une étude récente, nous avons montré que canal semicirculaire postérieur des injections de thérapie génique virale a donné lieu ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating microscope	Zeiss		OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts	Fine Science Tools	11251-10, 11295-51	#5 and #55 Dumont
Micro-scissors	Fine Science Tools	15002-08
Nanoliter2000 microinjector	World Precision Instruments
Heating pad	Mastex	Model 500/600
5-0 vicryl sutures	Ethicon
AAV8-whirlin	Vector Biolabs
Glass pipette	Sutter Instruments	B100-75-10	Borosilicate glass