신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

요약

이 연구에서 우리 신생아 쥐에 있는 내가 유전자 납품에 대 한 신뢰할 수 있는 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다.

초록

내가 유전자 치료는 난청과 현기증에 대 한 잠재적인 치료로 큰 약속을 제공합니다. 내가 유전자 치료의 성공의 중요 한 결정 요인의 한 청력 손실을 최소화 하면서 타겟된 세포 유형의 일관 변환 효율 귀착되는 전달 방법을 찾는 것입니다. 이 연구에서 우리 신생아 쥐에 내가 유전자 납품을 위한 실행 가능한 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다. 후부 반원의 운하의 쉬운 해부학 식별 뿐만 아니라 필요한 측 뼈의 최소한의 조작, 게가 외과 접근 내가 유전자 납품을 위한 매력적인 선택권.

서문

내가 유전자 치료의 급속 하 게 발전 분야 이다. 그것은 다양 한 동물 모델에서 전투 ototoxicity, 소음 외상, 그리고 유전 청력 손실¹에 적용 되었습니다. 여러 최근 연구의 청각과 균형 기능 기능 복구 돌연변이 생쥐에서 내가 유전자 치료 배달^2,3,,45,6, 후 ⁷. 핵심 중 하나는 내가 유전자 치료의 성공을 내가 액세스 하는 데 사용 하는 외과 접근은 결정 요인. 이상적으로, 외과 접근은 실행 하기 쉬운 것, 해부학 랜드마크 일관 되 고 쉽게 식별, 것 및 타겟된 세포 유형의 결과 변환 높은 것입니다.

최근 연구에서 우리는 바이러스 성 유전자 치료는 whirler 돌연변이 마우스 (청력 손실과 vestibular 부전의 모델)의 후부 반원의 운하를 통해 주입 했다 때 감각 머리 세포의 효율적인 변환 보였다는 vestibular에 보였다 달팽이 관⁵에서 기관 뿐만 아니라. 감각 머리 세포 변환의 높은 효율 결과 이러한 돌연변이 생쥐에서 청각과 vestibular 기능 개선.

이 문서에서는, 우리가 자세히 설명 신생아 마우스 내가 액세스 하려면 후부 반원의 운하 접근.

프로토콜

모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회 귀 먹음과 다른 커뮤니케이션 무질서 (NIDCD ASP1378-15)에 국가 학회에 의해 승인 되었다.

1. 절차 설치 및 준비

1. 모든 악기는 실험의 시작 부분에서 에틸렌 산화에 의해 소독. 동물, 사이 악기 비드 살 균을 사용 하 여 청소.
2. 마이크로-인젝터에 micropipette에 바이러스 성 유전자 치료를 포함 하는 솔루션을 로드 합니다. 이 연구에 사용 되는 바이러스 성 벡터는 AAV2/8-whirlin (1 x 10 밀리 리터, 당¹³ 게놈 사본 자료의 표 참조).
   참고: 일반적으로, 1.1 µ L 총 볼륨은 micropipette에 로드 됩니다.

2입니다. 마 취

참고:이 연구에 사용 된 마우스 스트레인은 whirler 마우스. Homozygous 돌연변이 (Whrn^wi/wi)와 heterozygous littermates (Whrn^{+ wi}) 사용 되었다.

1. 장소 (쓰레기 별도) 별도 새 장에 어머니.
2. 쥐를 따뜻하게 유지 하는 반복 열 패드 (37.5 ° C에서 집합)에 쓰레기 (P0-P5 새끼)를 포함 하는 홈 케이지를 놓습니다.
3. 라텍스 장갑의 손가락 부분을 잘라내어 그것에 강아지를 놓습니다.
4. ~ 2 분 동안 얼음 양동이에 라텍스 장갑 엄지에 강아지를 놓습니다.
5. 강아지와 팩의 표면 사이 4 "x4" 거 즈로 큰 광장 상업 플라스틱 고정 팩에 마 취 강아지를 놓습니다.
6. 짓 눌린 얼음, 중장비 라텍스 장갑을 강아지 주위 얼음 장갑 장소.
7. 강아지 (를 포함 하 여 회사 발가락 핀치) 다양 한 자극에 응답의 완전 한 부족에 의해 적절 하 게 취 경우 확인 합니다. 수술 (대략 5-10 분) 동안 얼음 팩에 강아지를 둡니다.
   참고: 수술 하는 동안 더 이상 15 분 동안 얼음 팩에 새끼를 떠나는 것이 좋습니다.

3. 수술 방법 (그림 1)

1. 일단 동물 마 취는 요오드 지우기와 알코올 닦아 귀 뒤 피부를 청소.
2. Postauricular 절 개 마이크로-가 위를 사용 하 여 뒤에 ~ 2 mm를 만들고 마이크로 위 sternocleidomastoid 근육을 나눕니다.
3. 안 면 신경와는 물집 식별 합니다. 물집 및 반투명 연골이 나이에 이며 그것은 거짓말 안 면 신경에 중간. Stapedial 동맥 유용한 랜드마크이 나이에 물집을 통해 볼 수 있습니다.
4. 머리 뒤로 안 면 신경에 따라 후부 반원의 운하 (PSCC)을 찾을. 근육 섬유와 부드러운 조직 overlying 후부 반원의 운하 마이크로-가 위를 사용 하 여 제거 합니다.
   참고:에서 PSCC는이 나이에 연골.
5. PSCC 유리 제 micropipette (~ 10 μ m 직경에서)를 사용 하 여 마이크로-인젝터에 침투.
6. 내가 바이러스 성 유전자 치료 주사.
   참고: 일반적으로, 49의 20 주사의 총 유전자 치료의 nL는 배달 후부 반원의 운하 ~ 40에 s (전체 볼륨 ~ 1 µ L). 사용 하는 바이러스 titer mL 당 1 x 10¹³ 게놈 복사본을 했다.
7. 5-0 polyglactin 봉합 사를 사용 하 여 피부 절 개를 닫습니다.

4. 수술 후 관리

1. 정상 체온으로 지속적인 수동 자극/낀된 인간의 손가락으로 마 취에서 복구 하는 동안 복원 하 온난 패드에 강아지를 두십시오.
2. 일단 강아지 깨어, 가정 그것의 감 금에 다시 놓습니다.
3. 홈 케이지 침구에 노출은 면봉으로 각 강아지를 애 무.
   참고:이 목적으로 그들은 다시 그녀의 쓰레기 후 수술을 수락 하는 어머니의 가능성을 증가, 수술 전에 냄새 쥐를 것입니다. 만약에 가능 하다 면, 어머니 로부터 소변 수집 하 고 거부의 가능성을 더 감소를 면봉을 사용 하 여 강아지에 문질러 서 될 수 있습니다.
4. 그녀의⁸, 감도를 어머니의 코에 광 유를 적용 하 고 집으로 어머니를 다시.

결과

주입 후부 반원의 운하를 통해 신생아 whirler 쥐로 AAV8 whirlin 유전자 치료의 결과 utricular 세포 (그림 2)에서 식 (그린) whirlin 53.1%의 전반적인 감염 효율 (SD 38.1, n = 28)⁵ . 머리 세포 transduced stereocilia (레드) contralateral 비 주입 귀에서 머리 세포에 비해 길쭉한 했다 (3.20 ± 0.34 µ m와 5.35 ± 2.11 µ m 각각)⁵.

토론

몇 가지 수술 방법은 설치류 내 귀에 액세스 하려면 설명 있다. Cochleostomy 및 둥근 창 접근 가장 일반적으로 사용 됩니다 달팽이 관에 액세스 하려면 반면 후부 반원의 운하 endolymphatic sac 접근은 일반적으로 사용 되는 및 vestibular 장기¹에 액세스 하. 최근 연구에서 우리는 바이러스 성 유전자 치료의 고효율 vestibular 기관과 달팽이 관⁵에 머리 세포 변환의 결과 후?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating microscope	Zeiss		OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forcepts	Fine Science Tools	11251-10, 11295-51	#5 and #55 Dumont
Micro-scissors	Fine Science Tools	15002-08
Nanoliter2000 microinjector	World Precision Instruments
Heating pad	Mastex	Model 500/600
5-0 vicryl sutures	Ethicon
AAV8-whirlin	Vector Biolabs
Glass pipette	Sutter Instruments	B100-75-10	Borosilicate glass