Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Özet

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Özet

Kemik iliği stromal hücreler (BMSCs) teşkil Mezenkimal Kök hücre bir temsili rutin olarak kullanılan bir hücre nüfus tüp bebek. Hematopoetik kök kırmızı kan hücreleri, bağışıklık ataları ve Osteoklastlar çıkmasına neden olabilir hücre (HSCs), yanında kemik iliği kavite içinde bulundukları. Böylece, çekimi hücre popülasyonlarının sorunlar deneysel tasarım mevcut ve veri yorumu yıkmak çeşitli hücre popülasyonlarının çok heterojen karışımı içinde kemik iliği sonuçlarından biri. Birkaç yalıtım ve kültür yöntemleri laboratuvarlarda BMSCs ve HSCs invitroaz ya da homojen nüfus elde etmek için geliştirilmiştir. Burada, BMSCs ve HSCs izolasyonu fare uzun kemikler için iki yöntem mevcut: BMSCs ve HSCs karışık bir nüfusa verimleri bir yönteme ve iki hücre popülasyonlarının ayırmak için çalışır bir yöntem göre bağlılık üzerinde. Her iki yöntem hücreler için uygun sağlamak Osteojenik ve Adipojenik farklılaşma denemeleri de fonksiyonel deneyleri.

Giriş

Birincil fare BMSCs onların keşif erken 1980'lerde¹beri Mezenkimal Kök hücre vitro modeli olarak yaygın olarak kullanılır. Nitekim, dokusunu, Osteoklastlar, kondrosit veya adiposit birçok çalışmalar^2,3, içine ayrıştırılan kapasitesi uzun kemiklerde kemik iliği boşluğundan temizlenen plastik-yapışık hücreleri kültürleri korumak ^{4 , 5}. ancak, kemik iliği benzersiz bir doku, ancak bunlarla sınırlı olmamak, BMSCs, HSCs, endotel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere birçok farklı hücre popülasyonlarının modülüdür. Bu nedenle, yalıtım ve kültürü teknikleri farklı homojenliği ile hücre popülasyonlarının yol açabilir. Hücrelerden ayırt etme potansiyel test etmek için bu tür teknikler kullanarak zor olabilir. Örneğin, farklı genotip ile fareler hücrelerden karşılaştırırken, karma hücre nüfusuyla başlayan verilerin yorumlanması sınırlar. Tersine, BMSCs ve HSCs homojen nüfus alma ve teknik olarak zor olabilir gibi temsilcisi olmayabilir bir ex vivo modelinin.

Bizim laboratuvar biz öncelikle BMSCs kullanımı nedeniyle dokusunu, Osteoklastlar ve adiposit ayrıştırılan potansiyellerini ilgilendi. Burada, BMSCs ve HSCs yalıtım ve osteoblastogenesis veya adipogenesis vitrodeğerlendirmek için kullanılan kültür teknikleri, hem de HSCs Osteoklastlar ayırt etmek için kültürleri mevcut. Bir yöntem BMSCs ve HSCs adipogenesis, osteoblastogenesis ve osteoclastogenesis (Toplam BMCs denir) için doğrudan uygun içeren nüfus kemik iliği hücre (BMCs) kullanır. Bu yöntem bir kemik iliği microenvironment hücreleri arasında bulunan heterojenite daha yakın ex vivo gösterimidir. Başka bir yöntem bir girişim kültürü "saf" nüfus BMSCs ve HSCs (yapışık BMSCs denir) yapışık yapışık olmayan hücrelerden ayırır. Yöntemi daha sonra hücre kültürü BMSCs veya HSCs daha doğru bir sayı ile başlamak için deneyler ve kültüründe kalır diğer hücre popülasyonlarının karmaşık dolaylı etkilerinden olasılığını azaltır sağlar. Her iki yöntem daha önce yayınlanan ve farklı araştırma soruları^6,7,8,9gidermek için kullanılan.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü tarafından kabul edildi.

1. toplama hazırlık tüpler

1. BMSC kültür ortamı en az gerekli orta α (MEM α) ilave %10 Fetal sığır Serum ve penisilin/streptomisin % 1'i aç.
2. BMSC kültür ortamının 100 µL 1.5 mL microcentrifuge tüplerde yerleştirin. 3 kemik genellikle bir tek tüp hazır olun buna göre uygun olacaktır.
3. Santrifüj tüplerde tam 200 µL pipet ipuçları yeterince uçlarını kesmek. Tüpler içinde ipuçları eklemek ve kapakları tüpler buza yerleştirmeden önce kapatabilirsiniz emin olun.
   Not: Alternatif olarak, 0.75 mL microcentrifuge tüpler biter kesim ile 1.5 mL microcentrifuge tüp içine eklenir.

2. hasat farelerin kemiklerinden

1. Servikal çıkığı tarafından takip CO₂ kullanarak hayvanlar ötenazi ve onları % 70 etanol ile sprey.
   Not: aynı cinsiyetten ve tercihen aynı yaşta hayvanlardan kullanıldığından emin olun. 7-8 hafta yaşlı hayvanlar düzenli olarak kullanın. Biz daha iyi bir temsilcisi ve tekrarlanabilir hücre nüfus verim için deneysel grupları başına en az 3 hayvanlar hücrelerden havuzu oluşturma öneririz.
2. Parçalanmış bir tahta üzerinde sırtında euthanized fareyi getirin. Forseps karnına bir çadır cilt oluşturmak için kullanın. Steril diseksiyon makası kullanarak küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1 cm) olun. Geri alt karın ve bacak göstermek bacaklarda ve kesme metreden doğru cilt soyma.
   1. Ayak bileği ayak kaldırmak için ortak kesti. Femur başı kalça ayırmak için kalça, iliyak tepe kesin. Fare hala sırtında olmakla birlikte, iki İliak kemik ayırmak için kalça ortasında bir kesi yapmak.
3. Hav bırakmayan mendil kullanarak, dikkatli bir şekilde kas uyluk, yırtılmalarıteşhis ve İliak kemik çıkarın.
   Not: daha fazla tendon ve kas kemik üzerinden daha hızlı ve daha kolay hav bırakmayan mendil (örneğin, kimwipes) ile temizlik mümkün kılan kesme. Kemikler gibi onlar çabuk pes eğilimindedir ve onların kırılganlık belirli genotip ile artırılabilir işlenirken dikkatli olun.
4. Bir kez tüm örnekleri disseke, PBS buz üzerinde yer onları ve steril kültür kukuIeta yalıtım kalan adımları için hareket.
   Not: mümkün olduğunca aseptik çalışma kültürlerde bulaşma olasılığını azaltacaktır.
5. Küçük kesim (yaklaşık 1-2 mm) her iki proksimal ve distal ucunda kemikleri kesitli ipuçları santrifüj tüpler içinde bunları yerleştirmeden önce yapmak.
   Not: kemik iliği dışarı centrifuged yeterli miktarda kesmek için emin olun; Ancak, bakım önlemek için alınması gereken hücre popülasyonlarının değişir eğilimi olarak çok fazla kesme iliği alanı içinde yakınlık dayalı.
6. 10.000 x g, santrifüj 15 s, oda sıcaklığında. Tüm iliği temizlendi ve kemikleri ekler (ya da 200 µL damlalıklı ipucu veya 0.75 mL microcentrifuge tüp) içinde iken 1,5 mL tüp alt kısmında pelleted sağlamak. Bir kez tüm iliği toplanır, kemikleri ile ekler koleksiyon tüpler kaldırın.
   Not: tüm iliği aktarılmadan, kemikleri beyaz görünür. Ancak, bazı kemik iliği devam ederse, kesme biter yeniden deneyin ve santrifüj kapasitesi.

3. hücre süspansiyon

1. 25 G iğne, çekme kullanarak hücreyi yukarı ve aşağı yavaş yavaş kümeleri kadar kırmak ve tüm örneklerini tek 15 mL konik tüp içine birleştirmek için unsurlardandır. 10 mL BMSC kültür medya örnekleri 500 µL başına ekleyin.
2. 70 µm filtre 50 mL konik tüp üzerine yerleştirin ve hücre süspansiyon olası kemik parçaları kaldırmak için bu filtreden geçmek.

4. kaplama ve karışık nüfus (Toplam BMCs) kemik iliği hücrelerinin kültürü

Not: Bir kuluçka %5 CO₂37 ° C'de hücreler kültürlü.

1. Hücre sayısını hesaplamak ve onları 1.0 x kültür medya 10⁶ hücreler/cm² ' de plakası. 72 h karma kültür hücreler eklemek için izin verir.
   Not: Hücre süspansiyon 20 x kültür medya ve tekrar trypan bir hemasitometre kullanarak hücre sayım daha önce mavi sulandrarak sulandrarak önerilir. İçin 7-hafta-yaşlı erkek C57Bl6/J fareler, biz düzenli olarak⁶ hücre hücre sayısı 50 x 10 civarında verim ama yaş, cinsiyet ve zorlanma cep numarası büyük ölçüde etkileyebilir.
   Not: Mix nüfus hücre kültürü dibinde de eklemek gerekir.
2. Sonra 72 h, medyayı çıkarın ve taze medya ile değiştirin. Da medyayı değiştirerek her gün ve onay için confluency devam edin. Hücrelerin % 80-100 confluency ulaştığınızda, farklılaşma için hazırlar.
   Not: Bu kültür BMSCs ve HSCs ile karışık çünkü, bu doğrudan osteoblastogenesis, adipogenesis gibi osteoclastogenesis için kullanılabilir.

5. kaplama ve kültür BMSCs (yapisan BMSCs) Split nüfusun

Not: Bir kuluçka %5 CO₂37 ° C'de hücreler kültürlü.

1. Kalça, yırtılmalarıteşhis ve bir fare İliak kemik 10 cm kültür amacına (55 cm² kültür alanının) toplanan tüm hücreleri plaka.
   Not: 2-3 C57BL/6J fareler havuzu oluşturma zaman, genellikle bu 'Toplam' kemik iliği nüfus 150 cm² şişe içinde plaka.
2. Karma kültür 48 saat sonra (sigara yapışık HSCs içeren) kültür medyayı çıkarın. Eğer osteoclastogenesis deneyler yapılması için bu nüfus yapışık olmayan hücreleri bir kenara (bkz. Bölüm 7), belki de, aspiratı ayarla ve bu hücreleri atın.
3. Dikkatle ekli hücreleri bozmamaya olarak PBS ile plaka/şişeye yıka.
4. PBS kaldırmak ve % 0.25 tripsin ekleyerek ve hücre süspansiyon hücre medya ekleyerek 1-3 dk. sertleştirme tripsin 37 ° C'de kuluçka hücreleri kaldırın. Bu noktada, BMSCs, şimdi kalkar, (daha önce bitmiş içinde adım 4.1 olarak) sayılır ve gelecekteki deneyler için kaplama.
5. Kaplama için gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın. Hücre süspansiyon 1000 x g oda sıcaklığında 5 min için de gerekli hacmi santrifüj kapasitesi.
   Not: Hücreleri genellikle üzerinde son nokta deney dayalı kaplama. Protein/RNA izole olmak istiyorsa, biz genellikle plaka-yüksek yoğunluklu (~1.0-2.0 x 10⁶ hücreler/iyi ' 6-şey plaka).
6. Medyayı çıkarın ve hücre Pelet kültür kaplama için gerekli ortam hacmine resuspend. Kültür medya deneyler göre hücrelerde plaka ve onları bir kaç günlüğüne takmak izin verir. BMSCs confluency ulaştığınızda, farklılaşma gerçekleştirmek için devam edin.

6. BMSCs farklılaşma

1. Dokusunu
   1. Osteoblast farklılaşma medya 1 M β-gliserol 800 µL ekleyerek fosfat PBS ve 0,5 M askorbik asit PBS 200 µL 99 mL BMSC kültür ortamının yapın (bkz. Adım 1.1 BMSC kültür ortamı bileşimi için).
      1. BMSCs kültürler (Adım 4.3 Toplam BMCs) veya yapışık BMSCs adım 5.6 Konfluent olduğunda, bunları dokusunu kültür medya osteoblast farklılaşma medyaya geçiş yaparak ayırt.
   2. Farklılaşma ortamı her gün değiştirin. Hücreleri Qafqaz beyaz nodüller oluşturmaya başlamak. Onları çıplak gözle kuyunun dibindeki görselleştirmek; Bu işlem için 3 hafta birkaç gün içinde ortaya çıkabilir.
      1. Osteoblastogenesis değerlendirmek için alkalen fosfataz boyama ve/veya Von Kossa 8 bölümünde açıklandığı gibi kuyu üzerinde boyama gerçekleştirmek.
         Not: medya dikkatle hücre monolayer bozulma önlemek için hafif bir açıyla plakaları eğerek değiştirin.
2. Adiposit
   1. Adipocyte temel medya birlikte 90 mL Dulbecco modifiye kartal orta (DMEM) yüksek glikoz, 10 mL Fetal sığır Serum, 1 mL penisilin/streptomisin, 100 µL 20 mM Rosiglitazone ve 2 mm insülin 100 µL karıştırılarak olun. Gerekirse, farklılaşma deney sırasında hafta için bu medya 4 ° C'de depolayın.
   2. 62,5 mM 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) 200 µL ekleyerek adipocyte indüksiyon medya yapmak ve 1 mm deksametazon Adipocyte Bankası medya 25 ml 25 µL.
   3. BMSCs kültürler (Adım 4.3 Toplam BMCs) veya yapışık BMSCs adım 5.6 Konfluent olduğunda, medya adipocyte indüksiyon medyaya değiştirin. Bu gün 0 farklılaşma düşünün.
   4. Sonra 48 h, medyayı çıkarın ve kültür adipocyte indüksiyon medya ile yenileyin.
   5. Gün 4, adipocyte temel medyaya geçiş.
      Not: 2 gün veya gün 4 olarak erken görünen Lipid damlacıkları başlayabilirsiniz.
   6. Günlük 7, hücreleri maksimum lipid damlacıkları birikmiş ve olgun bir adipocyte benzer bir fenotip görüntülemek gözlemlemek. Hücre ölüm/dekolmanı neden olabileceğinden bu noktaya geçmiş kültür değil.

7. farklılaşma HSCs Osteoklastlar içine

1. Osteoklast farklılaşma medya 25 mL BMSC kültür medya 25 µg/mL, reseptör aktivatör ve NFKB Ligand (RANKL) ve 15 µL makrofaj koloni uyarıcı faktör (mCSF) 25 µg/mL 50 µL ekleyerek getirin.
2. Toplam BMCs (Kimden adım 4.3) veya yapışık olmayan hücrelerden (Adım 5.2) kuyuya İliştirildikten sonra kültür medya Osteoklast farklılaşma medya için değiştirilebilir. Farklılaşma medya her geçen gün doldurmak.
3. Osteoklast kültürler her gün 10 X büyütme, mikroskop altında gözlemlemek. Osteoklastlar sigorta ve genellikle çevresinde gün 5-7 farklılaşma multinucleated hücreleri oluşturur görmekteyiz.

8. boyama

1. Dokusunu
   Not: alkalin fosfataz (AP), sık sık boyama kullanmak için bir AP boyama kit ( Tablo malzemelerigörmek) yönergelere göre.
   1. AP boyama seti üreticisinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin.
      1. Medya Aspire edin ve PBS hücrelerle durulayın. %4 ile hücreleri tamir Paraformaldehyde (PFA) PBS oda sıcaklığında 12 dk için.
      2. Bu arada, 500 µL ekleyerek kiti boyama AP üzerinden reaktifler kullanarak AP çözüm olun sodyum nitrit 500 µL FRV alkali çözüm ve yavaşça; karıştırma için 2 dk. eklemek 22,5 mL dH₂O ve 500 için bekletin µL naftol AS-BI alkalin. Hafifçe karıştırın.
         Dikkat: PFA toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir.
      3. Hücreleri sabit sonra PBS ile durulayın ve her şey (iyi başına 1-2 mL) AP çözüm ekleyin. Alüminyum folyo ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika izin leke kapak. Çözüm Aspire edin, distile su ile yıkayın ve kurumaya plaka izin.
   2. Lekeli kolonileri alkalen fosfataz pozitif hücrelerinin incelemek için bir kamera ile görüntü elde etmek.
   3. Alternatif olarak Von Kossa alkalen fosfataz boyama yerine gerçekleştirin. Kalan herhangi bir PBS. gümüş nitrat ile çökelti olarak bunun için kuyu distile su ile iyice yıkayın
      1. %4 ile hücreleri tamir PFA PBS için oda sıcaklığında 12 dk içinde. O zaman, iyi kapak ve oda sıcaklığında 1 h için güçlü ışığa maruz yeterli %5 gümüş nitrat çözüm ekleyin.
   4. Gümüş nitrat çözümü kaldırmak ve her şey distile su ile durulayın. % 5 sodyum thiosulfate çözüm hücrelere ekleme ve 3 dk. bekletin.
   5. Sodyum thiosulfate Aspire edin ve distile su ile yıkayın. Kuru ve çıplak gözle koyu kahverengi/siyah lekeli mineral mevduat gözlemlemek tabağı ver.
2. Adiposit
   1. Yağ kırmızı O (ORO) boyama için % 10 kullanarak hücreleri tamir tarafsız Formalin oda sıcaklığında 1 h için arabelleğe alınmış.
   2. Bu arada, ORO hisse senedi çözüm isopropanol 10 ml 0.035 g çözülerek olun. Bu 6-şey plaka için yeterlidir. Karıştırın ve bir filtre kağıdı (gözenek boyutu 11 µm) kullanarak solüsyonu geçirin.
   3. ORO çalışma çözüm ORO hisse senedi çözüm 9 mL 6 mL distile su ile sulandrarak olun. Çözüm bir rocker üzerinde kullanım için hazır kadar bırakın.
   4. % 60 isopropanol distile su içinde hazırlamak (her örtecek kadar yapmak iyi).
   5. Hücreleri sabit kez sabitleştirici ve yıkama bir kez distile su ile çıkarın. Suyun % 60 isopropanol çözüm 1 dk. için değiştirin.
      Not: sıvı yavaş plaka devrilme ekleyin; adiposit çıkarmak çok kolay.
   6. İsopropanol kaldırın ve yeterli ORO çalışan hücrelerin tümünü kapsayacak şekilde bir çözüm ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında bir düşük hızlı rocker üzerinde kuluçkaya. ORO kaldırmak ve iki kez distile su ile yıkayın.
      Not: Bu noktada, ORO lekeli lipid damlacıkları mikroskop altında görüntülenmeyecektir.
   7. ORO ölçmek için ORO için her şey % 100 isopropanol 1 mL ekleyerek ve yavaş yavaş 10 dakikadır sallanan tarafından destain.
   8. Bu arada, ORO çalışma çözüm kullanarak aşağıdaki 8 standartlarını temel standart bir eğri oluşturmak için bir seyreltme serisi hazırlayın (2100 µg/mL) ve isopropanol bir eritici olarak: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 ve 0 µg/mL.
   9. Standartları ve triplicates bir plaka üzerinde destained örneklerinde 200 µL yük ve 490 Absorbans okumak nm.
      1. ORO konsantrasyonu standart eğri dayalı her örnek için belirlemek.
         Not: Cep numarası için konsantrasyon ORO normalize önerilir. Cep numarasını kristal violet boyama veya DNA miktar sayısal.
3. Osteoklastlar
   Not: hazır olduğunuzda, Osteoklastlar tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) tuzak boyama kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) kiti için boyama öneririz.
   1. Boyama tuzak için hücreler, oda sıcaklığında 30 dk için PBS % 2.5 oxazolidin ile düzeltmek. Bu arada, tuzak çözüm birlikte karıştırılarak 50 µL hızlı Garnet Bankası çözüm, sodyum nitrit, 4.55 mL distile su, Napthol AS-Biphosphate, asetat çözüm 200 µL ve 100 µL tartarat çözüm 50 µL 50 µL olun.
   2. Sabitleştirici Aspire edin ve iki kez 37 ° C'de 1 h için tuzak çözüm eklemeden önce PBS hücrelerle durulama
   3. Osteoklastlar (10 X büyütme) mikroskopla sayma önce distile su ile yıkayın. TUZAK⁺ hücreler 3 veya daha fazla hücre çekirdeği ile mor görünür.

Sonuçlar

Hücre kültürleri genel bakış
İki kültürü teknikleri değerlendirme farklılaşma BMCs BMSCs ve HSCs (Toplam BMCs, şekil 1A) oluşan karışık bir nüfus veya BMSCs nüfusu HSCs (yapışık BMSCs, şekil 1B) bölünmüş izin. 48 saatlik etap iliği hücrelerinden izole edilmiştir ve kaplama (şekil 1 c) sonra onlar hızla plastik kültür plaka altına ekleyin ve bir m...

Tartışmalar

Bu makalede, iki yöntem BMSCs kültürünün avantaj ve sınırlamaları ile sunulmaktadır. Kemik iliği geliyor hücreleri izole nispeten kolay bir işlemdir. Ancak, bir hücre nüfus Mezenkimal Kök hücre veya mediatörlerin ataları temsilci alma iliği kavite çeşitli hücresel ortamı nedeniyle zor olabilir.

Kemik iliği içeriğinin tamamını kültür içinde vivo microenvironment yakın bir gösterimini sağlar. Henüz hücreleri farelerin (genotip, tedaviler, yaş, vb...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200μL pipet tips	Rainin	17014401
1.5 mL centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 mL conical tube	VWR	89039-668
50 mL conical tube	VWR	89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	21-040-CM
Ethanol	Fisher Science	04-355-451
Dissection tools
70 μm filters	BD Falcon	352350
0.25% trypsin	Gibco	25200
Kimwipe	VWR	82003-820
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
Alkaline Phosphatase kit	Sigma-Aldrich	86R
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	S6506
Sodium Thiosulfate	Sigma-Aldrich	S7026
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	F5554-4L
Whatman filter Grade 1	Sigma-Aldrich	Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit	Sigma-Aldrich	387A
Glutaraldehyde	Electron	16220
MEMα	Gibco	12571
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9891
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
DMEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Rosiglitazone	Cayman Chemical	717410
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
RANKL	Peprotech	310-01
mCSF	Peprotech	315-02
Axio Observer inverter microscope	Zeiss