Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Резюме

В этой статье мы представляем методы изоляции и дифференцировать стромальных клеток костного мозга и стволовых гемопоэтических клеток от мыши длинных костей. Две различные протоколы представлены приносит различных клеточных популяций, пригодных для расширения и дифференцировку в остеобластов, адипоциты и остеокласты.

Аннотация

Клетки стромы костного мозга (BMSCs) являются популяции клеток, обычно используется как представление мезенхимальных стволовых клеток в пробирке. Они находятся внутри полости костного наряду с гемопоэтических стволовых клеток (СКК), которые могут породить красные кровяные клетки, иммунных прародителями и остеокласты. Таким образом экстракции популяции клеток из костного мозга результатов в весьма разнородный набор различных клеточных популяций, которые могут представлять вызовы в экспериментальный дизайн и смешаем интерпретации данных. Несколько изоляции и культуры методы были разработаны в лабораториях для того чтобы получить более или менее однородной популяции BMSCs и СКК Инвитро. Здесь мы представляем два метода для изоляции BMSCs и СКК от мыши длинных костей: один метод, который дает смешанное население BMSCs и СКК и один метод, который пытается разделить два клеточных популяций на основе соблюдения. Оба метода предоставляют клетки для Остеогенные и адипогенном дифференциация экспериментов, а также функциональные анализы.

Введение

Основная мышиных BMSCs обычно используются как модель в vitro мезенхимальных стволовых клеток с момента их открытия в начале 1980-х¹. Действительно культуры клеток пластик сторонник, покраснел от полости костного длинных костей поддерживать способность быть продифференцированным в остеобластов, остеокласты, хрящевые клетки или адипоцитов многих исследований в^{2,3, 4 , 5}. Однако, костного мозга является уникальная ткань состоит из многих различных клеточных популяций, включая, но не ограничиваясь, BMSCs, СКК, эндотелия и иммунные клетки. Таким образом изоляции и культуры методы могут принести клеточных популяций с различными однородности. Использование таких методов для проверки потенциальных дифференциации от клеток может быть сложным. Например при сравнении клетки от мышей с различными генотипами, начиная с населением смешанного клеток ограничивает интерпретации данных. И наоборот, получение однородной популяции BMSCs и СКК может быть технически сложным и не может быть как представитель модели ex vivo .

В нашей лаборатории мы в первую очередь заинтересованы в использовании BMSCs из-за их потенциал быть продифференцированным остеобластов, остеокластов и адипоцитов. Здесь мы представляем методов изоляции BMSCs и СКК и культуры, используемые для оценки osteoblastogenesis или adipogenesis в vitro, а также культур СКК дифференцироваться в остеокластов. Один метод использует смешанное население клеток костного мозга (BMC), содержащие BMSCs и СКК непосредственно подходит для adipogenesis, osteoblastogenesis и osteoclastogenesis (так называемый общий BMC). Этот метод является ex vivo представление ближе гетерогенности среди клеток костного мозга микроокружения. Другой метод отделяет приверженца от non сторонник клеток в попытке «чище» населения культуры BMSCs и СКК (называемых приверженцев BMSCs). Более поздних метод позволяет культуры клеток экспериментов, чтобы начать с более точное количество BMSCs или СКК и уменьшает потенциал комплекса косвенные эффекты других клеточных популяций, которые остаются в культуре. Оба метода были ранее опубликованы и используется для решения различных исследовательских вопросов^6,,78,9.

протокол

Все экспериментальные процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Мэн медицинский центр научно-исследовательском институте.

1. Коллекция трубок подготовка

1. Сделать BMSC Культура СМИ, дополняющего минимум основных средних α (MEM α) с 10% плода Bovine сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина.
2. Место 100 мкл BMSC культуры средств массовой информации в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. 3 кости обычно помещается в одном однотрубные так подготовить соответствующим образом.
3. Отрезать концы 200 мкл наконечники достаточно, таким образом, чтобы они вписываются в пробирок. Вставьте советы внутри трубы и убедитесь, что перед укладкой труб на льду можно закрыть крышками.
   Примечание: в качестве альтернативы, 0,75 мл microcentrifuge трубы с Срезанные концы могут быть вставлены в пробки microcentrifuge 1,5 мл.

2. урожай костей от мышей

1. Усыпить животных, с использованием CO₂ следуют шейки матки вывихов и распылить их с 70% этиловом спирте.
   Примечание: Убедитесь, что используются животные из того же пола и желательно того же возраста. Мы регулярно использовать животных в возрасте от 7 до 8 недель. Мы рекомендуем, объединение клетки от по крайней мере 3 животных в экспериментальной группы приносить лучше популяции представительным и воспроизводимые клеток.
2. Место Усыпленных мышь на его обратно на доске рассечения. Используйте щипцы для создания палатке кожи на животе. Сделайте небольшой надрез (около 1 см) с использованием рассечения стерильными ножницами. Отогните кожи конечностей и ноги от отрезока чтобы разоблачить нижней части живота и ног.
   1. Вырежьте ниже лодыжки совместных чтобы удалить подножия. Разрезать вдоль подвздошный гребень на бедра, чтобы отделить головку бедренной кости от другой. В то время как указатель мыши находится все еще на его спине, сделайте надрез в середине другой для разделения двух подвздошных костей.
3. С помощью безворсовой салфетки, осторожно удалите мышцы бедра, tibias и подвздошных костей.
   Примечание: Резка столько сухожилий и мышц от кости как можно делает очистку быстрее и проще с безворсовой салфетки (например, kimwipes). Осторожность при обработке кости, как они, как правило, легко ломаются и их неустойчивость может быть увеличено с определенным генотипов.
4. После того, как все образцы были расчленены, поместите их в PBS на льду и перейти к стерильной культуры капот для оставшихся шагов изоляции.
   Примечание: Работает асептически как можно больше будет уменьшить потенциал для загрязнения в культурах.
5. Сделать небольшие порезы (примерно 1-2 мм) на оба проксимальном и дистальном концы костей перед помещением их в секционного советы в пределах пробирок.
   Примечание: Убедитесь в том, сократить в достаточном количестве, так что костного мозга может быть центрифугировали Однако, следует избегать резки слишком много, как популяции клеток, как правило, различаются на основе близости в пространстве костного мозга.
6. Центрифуга на 10000 x g 15 s при комнатной температуре. Убедитесь, что все костного мозга покраснел и гранулированных в нижней части трубки 1,5 мл, в то время как кости находятся внутри вставки (или 200 мкл накапайте отзыв или 0,75 мл microcentrifuge трубки). После сбора всех костного мозга, выньте заглушку с костями из коллекции трубок.
   Примечание: Если очищены все костного мозга, костей появится белый. Однако если костного мозга остается в некоторых костей, попробуйте резки концы и центрифуги.

3. клетки подвеска

1. С помощью иглы 25 G, тянуть ячейки гранул вверх и вниз медленно порвать пряди и объединить все образцы в одной 15 мл Конические трубки. Добавьте 10 мл BMSC средства массовой информации культуры на 500 мкл образцов.
2. Место 70 мкм фильтром на вершине 50 мл Конические трубки и пройти суспензию клеток через этот фильтр, чтобы удалить возможные костных фрагментов.

4. обшивка и культуры смешанных популяций клеток костного мозга (всего BMC)

Примечание: При 37 ° C в инкубаторе с 5% CO₂культивируемых клеток.

1. Рассчитать количество клеток и их пластины на 1,0 x 10⁶ клеток/см² в культуре средств массовой информации. Позвольте 72 h смешанные культуры для клеток для присоединения.
   Примечание: Мы рекомендуем, разбавляя клеток подвеска 20 x в культуре средств массовой информации и разбавления снова в Трипановый синий до подсчета клеток с использованием Горяева. Для 7-week-old мышей-самцов C57Bl6/J мы регулярно дают клеток, количество около 50 x 10⁶ клеток, но возраст, пол и штамм может повлиять на количество клеток значительно.
   Примечание: Смеси популяция клеток должны приложить в нижней части культуры также.
2. После 72 ч удалите средства массовой информации и замените свежим СМИ. Продолжить изменение средств массовой информации каждый день и проверить confluency. Когда клетки достигают 80-100% confluency, они готовы к дифференциации.
   Примечание: Потому что эта культура смешивается с BMSCs и СКК, он может непосредственно использоваться для osteoblastogenesis, adipogenesis, а также osteoclastogenesis.

5. покрытие и культуры населения Сплит BMSCs (Адгезивная BMSCs)

Примечание: При 37 ° C в инкубаторе с 5% CO₂культивируемых клеток.

1. Пластина все клетки, собранных от бедра, tibias и подвздошной кости одной мыши в 10 см культуры блюдо (55 см² зона культуры).
   Примечание: При объединении мышей C57BL/6J 2-3, мы обычно пластины населения этот «всего» костный мозг в колбе² 150 см.
2. После 48 ч смешанные культуры удалите носитель культуры (содержащие non сторонник СКК). Если osteoclastogenesis эксперименты должны быть обработаны, установите это население не сторонник клетки в сторону (см. раздел 7), если не аспирата и отбросить эти клетки.
3. Вымойте тарелка/колба с PBS тщательно, чтобы не беспокоить прилагаемый клетки.
4. Удаление PBS и поднимите клетки путем добавления трипсин 0.25% и инкубации при 37 ° C 1-3 мин Quench трипсина, добавив ячейки СМИ суспензию клеток. На данный момент BMSCs, которые теперь отменены, могут быть подсчитаны (как ранее делается шаг 4.1) и покрытием для дальнейших экспериментов.
5. Рассчитайте количество клеток, необходимых для покрытия. Центрифуга необходимый объем суспензии клеток на 1000 x g 5 мин при комнатной температуре.
   Примечание: Клетки обычно покрыты на основе конечной точки экспериментов. Например если необходимо изолировать белка/РНК мы обычно пластины на более высокой плотности (~1.0-2.0 x 10⁶ клеток/хорошо 6-ну пластины).
6. Удалите средства массовой информации и Ресуспензируйте Пелле клеток в объеме культуры средств массовой информации, необходимой для покрытия. Пластина клетки в культуре средств массовой информации по данным экспериментов и дать им возможность прикрепить на несколько дней. Когда BMSCs confluency, перейдите к выполнить дифференциации.

6. дифференциация BMSCs

1. Остеобласты
   1. Сделать остеобластов дифференциация СМИ, добавляя 800 мкл 1 M β-глицерин фосфата в PBS и 200 мкл 0,5 М аскорбиновой кислоты в PBS до 99 мл BMSC культуры средств массовой информации (см. шаг 1.1 состав носителей BMSC культуры).
      1. После того, как BMSCs культур (всего BMC от шаг 4.3) или сторонник BMSCs из шага 5.6 вырожденная, различать их в остеобластов путем переключения СМИ культуры остеобластов дифференциация средствам массовой информации.
   2. Замените дифференциация средств массовой информации каждый день. Клетки начинают производить белые конкреций минерализации. Визуализировать их с нагим глазом в нижней части скважины; Этот процесс может происходить в течение нескольких дней до 3 недель.
      1. Для того чтобы оценить osteoblastogenesis, выполняют окрашивание щелочной фосфатазы и/или фон Kossa окрашивания на колодцы, как описано в разделе 8.
         Примечание: Измените СМИ тщательно, наклоняя пластины под небольшим углом во избежание срыва монослоя клеток.
2. Адипоцитов
   1. Сделайте Адипоцит базы СМИ, смешивая вместе 90 мл Дульбекко изменения среднего орла (DMEM) высокая глюкозы, 10 мл плода Bovine сыворотки, 1 мл пенициллина/стрептомицина, 100 мкл 20 мм Росиглитазон и 100 мкл 2 мм инсулина. При необходимости Храните этот СМИ на 4 ° C на неделю в ходе эксперимента дифференциации.
   2. Сделать Адипоцит индукции СМИ, добавив 200 мкл 62,5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 25 мкл 1 мм дексаметазон 25 мл Адипоцит базы СМИ.
   3. После того как BMSCs культур (всего BMC от шаг 4.3) или сторонник BMSCs из шага 5.6 вырожденная, измените СМИ Адипоцит индукции СМИ. Рассмотрим этот день 0 дифференциации.
   4. После 48 ч удалите средства массовой информации и обновления культуры с Адипоцит индукции СМИ.
   5. На 4 день перейдите к Адипоцит базовых средств массовой информации.
      Примечание: Липидного капель могут начать появляться уже в день 2 или 4 день.
   6. На 7 день отмечают, что клетки накопили максимальная липидного капель и отображать фенотип, аналогичный Зрелые Адипоцит. Не культура прошлом этот момент, как это может привести к смерти клетки/отряд.

7. дифференциация СКК в остеокласты

1. Сделайте остеокластов дифференциация СМИ, добавляя 50 мкл 25 мкг/мл рецептор активатор NFKB лиганда (RANKL) и 15 мкл 25 мкг/мл макрофагальный колонии стимулирующий фактор (mCSF) до 25 мл BMSC средства массовой информации культуры.
2. После всего BMC (из шага 4.3) или non сторонник клетки (из шага 5.2) прикреплены к колодцу, культуры средств массовой информации можно менять остеокластов дифференциация СМИ. Пополняете дифференциации средств массовой информации каждый день.
3. Наблюдать за остеокластов культур каждый день под микроскопом, при 10-кратном. Отмечают, что остеокласты сливаются и образуют многоядерные клетки, обычно около 5-7 день дифференциации.

8. Окрашивание

1. Остеобласты
   Примечание: Для окрашивания щелочной фосфатазы (AP), мы часто используют AP пятнать комплекта (см. Таблицу материалы) в соответствии с руководящими принципами.
   1. Выполните, AP, окрашивание, следуя изготовителем комплекта руководящих принципов.
      1. Аспирационная СМИ и промойте клетки с PBS. Исправить клетки с 4% параформальдегида (PFA) в PBS для 12 мин при комнатной температуре.
      2. В то же время, сделать решения AP с помощью реагентов от AP, окрашивание комплект, добавив 500 мкл нитрит натрия 500 мкл ФРВ-щелочным раствором и перемешивания аккуратно; пусть стоять за 2 мин Добавить 22,5 мл dH₂O и 500 мкл Нафтол AS-Би щелочной. Осторожно перемешать.
         Предупреждение: PFA токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
      3. Когда ячейки зафиксированы, промыть с PBS и добавить решение AP для каждой скважины (1-2 мл на хорошо). Накрыть алюминиевой фольгой и пусть пятно на 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света. Аспирационная решение, промыть дистиллированной водой и позволить пластину для просушки.
   2. Получение изображений окрашенных колоний, с помощью камеры для того чтобы наблюдать позитивные клеток щелочной фосфатазы.
   3. Можно также выполните фон Kossa вместо пятнать щелочной фосфатазы. Для этого мыть скважины тщательно промыть дистиллированной водой, как любые оставшиеся PBS будет выпадать в осадок с нитратом серебра.
      1. Исправить клетки с 4% ПФА в PBS для 12 мин при комнатной температуре. Затем добавьте достаточно 5% раствора нитрата серебра, охватывают также и подвергать сильным светом за 1 ч при комнатной температуре.
   4. Раствор нитрата серебра снимите и промойте каждой скважины с дистиллированной водой. Добавить 5% раствора тиосульфата натрия в клетках и дать постоять 3 мин.
   5. Аспирационная тиосульфата натрия и промыть дистиллированной водой. Пусть пластину сухой и наблюдать месторождения полезных ископаемых, окрашенные в темно-коричневый/черный с невооруженным глазом.
2. Адипоцитов
   1. Для окрашивания O красный нефти (Оро), исправить ячейки с помощью 10% нейтральных буферизуются формалина за 1 ч при комнатной температуре.
   2. В то же время сделать решение фондовой Оро, растворяя 0,035 г в 10 мл изопропанола. Это достаточно для 6-ну пластины. Смешать и передать решение, с использованием одного фильтра бумаги (поры размер 11 мкм).
   3. Сделать Оро работать решение путем разбавления 9 мл Оро Стоковый раствор с 6 мл дистиллированной воды. Оставьте раствор на рокер пока готовы для использования.
   4. Подготовка 60% изопропиловый спирт в дистиллированной воде (сделать достаточно, чтобы охватить каждый хорошо).
   5. Когда ячейки зафиксированы, удалите фиксирующие и мыть раз дистиллированной водой. Замените воду с 60% раствор изопропанола за 1 мин.
      Примечание: Добавьте жидкость медленно во время опрокидывания пластину; адипоцитов выбить очень легко.
   6. Удалите изопропанол и добавить достаточно Оро работать решение для покрытия всех клеток. Инкубируйте 15 мин на низкой скорости рокер при комнатной температуре. Удаление Оро и мыть дважды с дистиллированной водой.
      Примечание: на данный момент, Оро окрашенных липидного капель могут быть визуализированы под микроскопом.
   7. Для количественного определения Оро, Отмойте Оро путем добавления 1 мл 100% изопропиловый спирт для каждой скважины и тряся медленно, в течение 10 мин.
   8. В то же время подготовить серию разрежения для создания на основе следующих 8 стандартов с помощью Оро работать решение калибровочной кривой (2100 мкг/мл) и изопропиловый спирт в качестве разбавителя: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 и 0 мкг/мл.
   9. Загрузка 200 мкл стандартов и destained образцы в triplicates на тарелку и читать поглощения на 490 Нм.
      1. Определите концентрацию Оро для каждого образца, на основе стандартной кривой.
         Примечание: Мы рекомендуем, нормализации концентрации Оро номер ячейки. Номер ячейки может быть квантифицировано Фиолетовый Кристалл пятнать или количество ДНК.
3. Остеокласты
   Примечание: Когда вы будете готовы, мы предлагаем окрашивание остеокласты для тартрата-устойчивостью кислоты фосфатазы (ловушка) с помощью окрашивания ЛОВУШКУ комплекта (см. Таблицу материалы).
   1. Для окрашивания ЛОВУШКУ исправьте клетки для 30 мин при комнатной температуре с 2,5% глютаральдегид в PBS. В то же время сделать ЛОВУШКУ решение путем смешивания вместе 50 мкл раствора быстро гранаты базы, 50 мкл нитрит натрия, 4.55 мл дистиллированной воды, 50 мкл Napthol AS-бисфосфата, 200 мкл раствора ацетата и 100 мкл тартрата раствор.
   2. Аспирационная с фиксатором и промойте клетки с PBS дважды перед добавлением ЛОВУШКУ решение за 1 ч при 37 ° C.
   3. Промыть дистиллированной водой до подсчета остеокласты под микроскопом (увеличение 10 X). Ловушка⁺ клетки появляются фиолетовые с 3 или более ядрами.

Результаты

Обзор культур клеток
Две культуры методы позволяют оценки дифференциации по смешанным населением BMC, состоящая из BMSCs и СКК (всего BMC, рис. 1A) или совокупность BMSCs отделилась от СКК (сторонник BMSCs, рис. 1B). 48 ч после того, как клетки...

Обсуждение

В этой статье представлены два метода культуры BMSCs с их преимущества и ограничения. Изоляции клеток из костного мозга является относительно легким процессом. Однако получение популяции клеток, представитель мезенхимальных стволовых клеток или osteoclastic прародителями может быть сложным ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200μL pipet tips	Rainin	17014401
1.5 mL centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 mL conical tube	VWR	89039-668
50 mL conical tube	VWR	89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	21-040-CM
Ethanol	Fisher Science	04-355-451
Dissection tools
70 μm filters	BD Falcon	352350
0.25% trypsin	Gibco	25200
Kimwipe	VWR	82003-820
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
Alkaline Phosphatase kit	Sigma-Aldrich	86R
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	S6506
Sodium Thiosulfate	Sigma-Aldrich	S7026
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	F5554-4L
Whatman filter Grade 1	Sigma-Aldrich	Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit	Sigma-Aldrich	387A
Glutaraldehyde	Electron	16220
MEMα	Gibco	12571
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9891
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
DMEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Rosiglitazone	Cayman Chemical	717410
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
RANKL	Peprotech	310-01
mCSF	Peprotech	315-02
Axio Observer inverter microscope	Zeiss