Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Zusammenfassung

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Zusammenfassung

Knochenmark-Stromazellen Zellen (BMSCs) bilden eine Zellpopulation, die routinemäßig als eine Darstellung von mesenchymalen Stammzellen verwendet in-vitro-. Sie befinden sich in dem Knochenmark Hohlraum neben hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die roten Blutkörperchen, immun Stammväter und Osteoklasten hervorrufen können. So, Extraktionen der Zell-Populationen von der Knochenmark resultiert eine sehr heterogene Mischung aus verschiedenen Zell-Populationen, die Herausforderungen im experimentellen Design und Interpretation der Daten zu verwirren können. Mehrere Isolation und Kulturtechniken wurden im Labor entwickelt, um mehr oder weniger homogenen Bevölkerungen von BMSCs und HSCs Invitrozu erhalten. Hier stellen wir zwei Methoden zur Isolierung von BMSCs und HSCs aus Maus Röhrenknochen: eine Methode, die eine gemischte Bevölkerung von BMSCs und HSCs ergibt und eine Methode, die versucht, die zwei Zellpopulationen zu trennen Abkommen beruht auf. Beide Methoden liefern Zellen geeignet für osteogene und adipogenen Differenzierung Experimente sowie Funktions-Tests.

Einleitung

Primären murinen BMSCs werden häufig als in-vitro- Modell von mesenchymalen Stammzellen seit ihrer Entdeckung in den frühen 1980er Jahren¹verwendet. Kulturen der Kunststoff-anhaftende Zellen aus dem Knochenmark Hohlraum der langen Knochen gespült pflegen in der Tat, die Fähigkeit, differenziert in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten in vielen Studien^{2,3, 4 , 5}. ist eine einzigartige Gewebe bestehend aus vielen unterschiedlichen Zellpopulationen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, BMSCs, HSCs, Endothelzellen und Immun-Zellen jedoch das Knochenmark. So können Isolation und Kulturtechniken Zell-Populationen mit unterschiedlichen Homogenität nachgeben. Mit solchen Techniken, um die mögliche Differenzierung von Zellen zu testen, kann schwierig sein. Z. B. Grenzen, wenn Zellen von Mäusen mit verschiedenen Genotypen zu vergleichen, beginnend mit einer gemischten Zellpopulation der Interpretation der Daten. Umgekehrt erhalten homogene Bevölkerung von BMSCs und HSCs technisch schwierig sein kann und möglicherweise nicht als Vertreter eines ex-Vivo -Modells.

In unserem Labor sind wir in erster Linie interessiert die Nutzung der BMSCs durch ihr Potenzial in Osteoblasten und Osteoklasten Adipozyten unterschieden werden. Hier präsentieren wir Ihnen Techniken der BMSCs und HSCs Isolation und Kultur verwendet, um Osteoblastogenesis oder angereizte in Vitrozu bewerten, sowie Kulturen von HSZ in Osteoklasten zu unterscheiden. Eine Methode verwendet eine gemischte Bevölkerung von Knochenmarkzellen (BMCs) mit BMSCs und HSCs direkt geeignet für angereizte, Osteoblastogenesis und Osteoclastogenesis (Total BMCs genannt). Diese Methode ist eine engere ex Vivo -Darstellung der Heterogenität zwischen den Zellen des Knochenmarks Mikroumgebung gefunden. Eine andere Methode trennt Anhänger von nicht-anhaftende Zellen in einem Versuch, Kultur "reiner" Populationen von BMSCs und HSCs (Anhänger BMSCs genannt). Die späteren Methode ermöglicht die Zellkultur um zu beginnen mit einer genauer Anzahl von BMSCs oder HSCs experimentiert und verringert das Potenzial von komplexen indirekten Auswirkungen der anderen Zell-Populationen, die in der Kultur bleiben. Beide Methoden haben zuvor veröffentlicht und verwendet, um verschiedene Forschung Fragen^6,7,8,9anzugehen.

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren wurden von der institutionellen Animal Care und Use Committee am Maine Medical Center Research Institute zugelassen.

1. Sammlung Röhren Vorbereitung

1. Machen Sie BMSC Kulturmedien durch die Ergänzung von Minimum wesentliche Medium α (MEM α) mit 10 % fötalen Rinderserum und 1 % von Penicillin/Streptomycin.
2. Platz 100 µL BMSC Kulturmedien in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 3 Knochen passen in der Regel in einer einzigen Röhre also entsprechend vorbereiten.
3. Kürzen Sie die Enden von 200 µL Pipettenspitzen genug, so dass sie in die Zentrifuge Rohre passen. Setzen Sie die Tipps in den Rohren und sicherzustellen Sie, dass die Deckel schließen können, bevor Sie die Rohre auf Eis legen.
   Hinweis: Alternativ können 0,75 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Schnitt enden in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch eingefügt werden.

(2) die Ernte der Knochen von Mäusen

1. Einschläfern Sie die Tiere mit CO₂ gefolgt von zervikale Dislokation und sprühen sie mit 70 % Ethanol.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Tiere aus der gleichen Geschlechts und vorzugsweise im gleichen Alter verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Tiere im Alter von 7 bis 8 Wochen. Es wird empfohlen, Bündelung von Zellen aus mindestens 3 Tiere pro Versuchsgruppen zu eine bessere Vertreter und reproduzierbare Zellpopulation führen.
2. Platzieren Sie die euthanasierten Maus auf dem Rücken auf einem sezierenden Brett. Verwenden Sie Zange, um ein Zelt der Haut auf dem Bauch zu schaffen. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit sterilen sezierenden Schere. Ziehen Sie die Haut in Richtung der Gliedmaßen und die Füße aus dem Schnitt um den Unterleib und die Beine offen zu legen.
   1. Schneiden Sie unterhalb des Knöchels zu Fuße zu entfernen. Schneiden Sie entlang der Beckenkamm an der Hüfte, den Femur-Kopf von den Hüftknochen zu trennen. Während die Maus noch auf den Rücken, machen Sie einen Einschnitt in der Mitte der Hüftknochen, trennen die beiden Beckenkamm Knochen.
3. Mit fusselfreien Wischtücher, vorsichtig aus dem Oberschenkelknochen, Schienbeine und Beckenkamm Knochen des Muskels.
   Hinweis: Schneiden so viel von den Sehnen und Muskeln vom Knochen wie möglich macht die Reinigung schneller und einfacher mit den fusselfreien Tüchern (z.B. Kimwipes). Vorsicht wenn die Knochen zu manipulieren, wie sie neigen dazu, leicht zu brechen und ihre Zerbrechlichkeit mit bestimmte Genotypen erhöht werden kann.
4. Sobald die Proben seziert haben, legen Sie sie in PBS auf Eis und verschieben in einen sterilen Kultur-Haube für die übrigen Schritte der Isolation.
   Hinweis: Arbeiten aseptisch so weit wie möglich verringert das Potenzial für Verschmutzung in den Kulturen.
5. Machen Sie kleine Einschnitte (ca. 1 bis 2 mm) an den proximalen und distalen Enden der Knochen vor der Einlagerung in die geschnittenen Spitzen innerhalb der Zentrifuge Rohre.
   Hinweis: Stellen Sie sicher um eine ausreichende Menge zu schneiden, so dass Knochenmark heraus geschleudert werden kann; Allerdings muss darauf geachtet werden, zu vermeiden schneiden zu viel wie Zell-Populationen sind in der Regel variieren basierend auf Nähe innerhalb Knochenmark.
6. Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 s bei Raumtemperatur. Sicherzustellen Sie, dass das Knochenmark gespült und oelletiert am unteren Rand der 1,5 mL Tube, während die Knochen im Inneren der Einsätze (entweder 200 µL Pipettieren Tipp oder 0,75 mL Microcentrifuge Schlauch) sind. Sobald das Knochenmark gesammelt werden, entfernen Sie die Einsätze mit den Knochen aus dem Röhrchen.
   Hinweis: Wenn das Knochenmark geleert ist, werden die Knochen weiß erscheinen. Jedoch wenn Knochenmark in bestimmten Knochen bleibt, versuchen Sie es erneut schneiden enden und Zentrifugieren.

3. die Zellsuspension

1. Mit einer 25 G Nadel, ziehen, Holzpellets die Zelle oben und unten langsam Klumpen aufzubrechen und die Proben in ein einzelnes 15 mL konische Röhrchen zu kombinieren. Fügen Sie 10 mL BMSC Nährmedien pro 500 µL der Proben.
2. Legen Sie einen 70 µm-Filter auf eine 50 mL konische Rohr und dieser Filter durchlaufen Sie die Zellsuspension, um mögliche Knochensplitter zu entfernen.

(4) Beschichtung und Kultur der gemischten Populationen von Knochenmarkzellen (Total BMCs)

Hinweis: Zellen sind bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO₂kultiviert.

1. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen und Platte sie bei 1,0 x 10⁶ Zellen/cm² in Kulturmedien. Lassen Sie 72 h der Mischkultur für Zellen befestigen.
   Hinweis: Wir empfehlen Verdünnen der Zelle Aufhängung 20 X in Kulturmedien und Verdünnung wieder in Trypan blau vor zählen die Zellen mit einem Hemocytometer. Für 7 Wochen alten männlichen C57Bl6/J Mäusen wir routinemäßig ergeben eine Handynummer von rund 50 x 10⁶ Zellen jedoch Alter, Geschlecht und Belastung Zellzahl stark beeinflussen können.
   Hinweis: Eine Mischung Population von Zellen sollte am unteren Rand der Kultur gut befestigen.
2. Entfernen Sie nach 72 h das Medium und ersetzen Sie sie durch neue Medien. Weiter verändern die Medien jeden anderen Tag und suchen Sie nach Konfluenz. Wenn die Zellen 80-100 % Konfluenz erreicht haben, sind sie bereit für eine Differenzierung.
   Hinweis: Da diese Kultur mit BMSCs und HSCs gemischt wird, kann es direkt für Osteoblastogenesis, angereizte sowie Osteoclastogenesis verwendet werden.

5. Beschichtung und Kultur der Split Bevölkerung von BMSCs (anhaftende BMSCs)

Hinweis: Zellen sind bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO₂kultiviert.

1. Teller alle Zellen in der Kulturschale 10 cm (55 cm² Kulturkreis) vom Oberschenkelknochen, Schienbeine und Beckenkamm Knochen von einem Mausklick gesammelt.
   Hinweis: Bei der Bündelung von 2-3 C57BL/6J Mäuse Platte wir in der Regel diese "Gesamt" Knochenmark-Population in einem 150 cm² Kolben.
2. Entfernen Sie nach 48 h der Mischkultur die Nährmedien (mit der nicht-Anhänger HSCs). Wenn Osteoclastogenesis Experimente durchgeführt werden, setzen Sie diese Population von nicht-anhaftende Zellen beiseite (siehe Abschnitt 7), wenn nicht, Absaugen und entsorgen Sie diese Zellen.
3. Waschen Sie die Platte/Flasche mit PBS sorgfältig hinsichtlich der angeschlossenen Zellen nicht zu stören.
4. Entfernen Sie PBS und heben Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,25 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für ca. 1-3 min. Quench die Trypsin, indem Sie die Zellsuspension Zelle Medien hinzufügen. An dieser Stelle BMSCs, die nun aufgehoben, können (als zuvor getan in Schritt 4.1) gezählt und verchromt für zukünftige Experimente.
5. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Beschichtung benötigt. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension bei 1.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Zellen sind in der Regel vernickelt basierend auf Endpunkt-Experimente. Zum Beispiel wenn Protein/RNA isoliert sein Platte wir in der Regel auf eine höhere Dichte (~1.0-2.0 X 10⁶ Zellen/Brunnen in 6-Well-Platte).
6. Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet im Volumen von Nährmedien für die Beschichtung benötigt. Die Zellen in Kultur Medien nach den Experimenten Platte und es ihnen ermöglichen, für ein paar Tage anhängen. Wenn die BMSCs Konfluenz erreicht haben, fahren Sie mit Differenzierung durchführen.

6. Differenzierung der BMSCs

1. Osteoblasten
   1. Machen, Osteoblasten Differenzierung Medien indem 800 µL 1 M β-Glycerin Phosphat in PBS und 200 µL 0,5 M Ascorbinsäure in PBS zu 99 mL BMSC Nährmedien (siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der BMSC Kultur Medien).
      1. Nachdem BMSCs Kulturen (total BMCs aus Schritt 4.3) oder anhaftende BMSCs aus Schritt 5.6 konfluierende sind, unterscheiden sie in Osteoblasten durch den Wechsel der Nährmedien zu Osteoblasten Differenzierung Medien.
   2. Ersetzen Sie die Differenzierung Medien jeden zweiten Tag. Zellen beginnen, weiße Knötchen Mineralisierung. Visualisieren sie mit bloßem Auge auf der Unterseite des Brunnens; Dieser Prozess kann innerhalb von wenigen Tagen bis 3 Wochen stattfinden.
      1. Führen Sie bei der Beurteilung Osteoblastogenesis alkalische Phosphatase Färbung und/oder Von Kossa Färbung auf den Brunnen wie in Kapitel 8 beschrieben.
         Hinweis: Ändern Sie die Medien sorgfältig durch die Platten in einem leichten Winkel zur Vermeidung von Störungen der Zelle Monolage kippen.
2. Adipozyten
   1. Machen Sie Adipocyte base Medien durch mischen zusammen 90 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) hohe Glucose, 10 mL von fetalen Rinderserum, 1 mL Penicillin/Streptomycin, 100 µL 20 mM Rosiglitazon und 100 µL 2 mM Insulin. Bei Bedarf speichern Sie dieses Medium bei 4 ° C für die Woche während des Experiments Differenzierung.
   2. Machen Adipocyte Induktion Medien durch Zugabe von 200 µL 62,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 25 µL 1 mM Dexamethason bis 25 mL Adipocyte Base Medien.
   3. Nachdem BMSCs Kulturen (total BMCs aus Schritt 4.3) oder anhaftende BMSCs aus Schritt 5.6 konfluierende sind, wechseln Sie das Medium Adipocyte Induktion Medien. Betrachten Sie diesen Tag 0 der Differenzierung.
   4. Entfernen Sie nach 48 h das Medium und aktualisieren Sie die Kultur mit Adipocyte Induktion Medien zu.
   5. Am 4. Tag wechseln Sie zur Adipocyte base Medien.
      Hinweis: Lipid Tröpfchen können beginnen so früh wie Tag2 oder Tag 4 erscheinen.
   6. Am 7. Tag beobachten Sie, dass Zellen maximale Lipid Tröpfchen angesammelt haben und einen Phänotyp ähnlich wie eine Reife Adipocyte zeigen. Nicht über diesen Punkt Kultur, da es Zelle Tod/Ablösung führen kann.

(7) die Differenzierung von HSZ in Osteoklasten

1. Osteoklasten Differenzierung Medien durch Zugabe von 50 µL 25 µg/mL der Rezeptor Aktivator von NFKB Liganden (RANKL) und 15 µL von Makrophagen Kolonie stimulierende Faktor (mCSF) 25 µg/mL bis 25 mL BMSC Nährmedien zu machen.
2. Sobald die gesamte BMCs (aus Schritt 4.3) oder nicht-anhaftende Zellen (aus Schritt 5.2) Brunnen verbunden sind, können Nährmedien Osteoklasten Differenzierung Medien geschaltet werden. Wieder füllen Sie Differenzierung Medien jeden zweiten Tag auf.
3. Beobachten Sie die Osteoklasten Kulturen täglich unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass Osteoklasten verschmelzen und mehrkernigen Zellen, in der Regel um Tag 5 bis 7 der Differenzierung bilden.

(8) Färbung

1. Osteoblasten
   Hinweis: Für die alkalische Phosphatase (AP) Färbung, wir oft benutzen ein AP Färbung kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Richtlinien.
   1. Führen Sie AP Färbung, indem Sie die folgenden Richtlinien des Herstellers Kit.
      1. Aspirieren Sie Medien und spülen Sie Zellen mit PBS. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 12 min bei Raumtemperatur.
      2. In der Zwischenzeit machen die AP-Lösung unter Verwendung der Reagenzien von der AP Färbung Kit durch Zugabe von 500 µL Natriumnitrit, 500 µL FRV-Lauge und mischen sanft; lassen Sie stehen für 2 min. hinzufügen 22,5 mL dH₂O und 500 µL Naphthol AS-BI alkalisch. Mischen Sie vorsichtig.
         Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
      3. Sobald die Zellen fixiert sind, Spülen mit PBS und AP-Lösung in jede Vertiefung (1 bis 2 mL pro Well) hinzufügen. Deckel mit Alu-Folie und lassen Sie Fleck für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden. Aspirieren Sie die Lösung, waschen mit destilliertem Wasser und lassen die Platte zum trocknen.
   2. Abrufen von Bildern der gefärbten Kolonien mit Hilfe einer Kamera um alkalische Phosphatase positive Zellen zu beobachten.
   3. Alternativ führen Von Kossa statt alkalische Phosphatase Färbung. Hierzu werden Brunnen waschen gründlich mit destilliertem Wasser als alle übrigen PBS mit Silbernitrat. auszufällen.
      1. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % PFA mit PBS-Puffer für 12 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann genug 5 % Silbernitratlösung um den Brunnen zu decken und setzen auf starkes Licht für 1 h bei Raumtemperatur.
   4. Entfernen Sie die Silbernitrat-Lösung und spülen Sie jedes gut mit destilliertem Wasser. Die Zellen 5 % Natriumthiosulfat-Lösung hinzufügen und 3 Minuten lang stehen lassen.
   5. Die Natriumthiosulfat abzusaugen und mit destilliertem Wasser zu waschen. Lassen Sie die Platte trocken und die Lagerstätte gebeizt in dunkelbraun/schwarz mit bloßem Auge zu beobachten.
2. Adipozyten
   1. Fix für Öl rot O (ORO) Färbung, die Zellen mit 10 % Neutral gepufferte Formalin für 1 h bei Raumtemperatur.
   2. In der Zwischenzeit machen Sie die ORO-Lager-Lösung durch Auflösen von 0,035 g in 10 mL Isopropanol. Dies ist ausreichend für eine 6-Well-Platte. Mischen und die Lösung mit einem Filterpapier (Pore Größe 11 µm) übergeben.
   3. Machen Sie die ORO arbeiten Lösung durch 9 mL der Stammlösung ORO mit 6 mL destilliertem Wasser verdünnen. Lassen Sie die Lösung auf einer Wippe bis einsatzbereit.
   4. 60 % Isopropanol in destilliertem Wasser vorbereiten (machen genug, um jede decken gut).
   5. Sobald die Zellen fixiert sind, entfernen Sie das Fixativ und Waschen einmal mit destilliertem Wasser. Ersetzen Sie das Wasser mit der 60 % Isopropanol-Lösung für 1 min.
      Hinweis: Fügen Sie Flüssigkeit langsam beim Kippen der Plattenrandes; Adipozyten verdrängen sehr leicht.
   6. Entfernen Sie das Isopropanol, und fügen Sie genug ORO arbeiten Lösung um alle Zellen zu decken. 15 min auf ein Lowspeed Rocker bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie ORO und waschen Sie zweimal mit destilliertem Wasser.
      Hinweis: an dieser Stelle können ORO-gefärbten Lipid Tropfen unter dem Mikroskop visualisiert werden.
   7. Zur Quantifizierung von ORO destain das ORO durch Zugabe von 1 mL 100 % Isopropanol in jede Vertiefung und Schaukeln langsam für 10 Minuten.
   8. In der Zwischenzeit bereiten eine Verdünnungsreihe erstelle ich eine Standardkurve auf Basis der folgenden 8 Standards mit ORO-arbeiten-Lösung (2.100 µg/mL) und Isopropanol als ein Verdünnungsmittel: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 und 0 µg/mL.
   9. 200 µL des Standards und die destained Muster in Triplicates auf einem Teller laden und Lesen der Extinktion bei 490 nm.
      1. Bestimmen Sie Konzentration von ORO für jede Probe anhand der Standardkurve.
         Hinweis: Wir empfehlen normalisieren die Konzentration ORO, Anzahl von Zellen. Anzahl von Zellen kann mit Kristallviolett beflecken oder DNA-Menge quantifiziert werden.
3. Osteoklasten
   Hinweis: Wenn Sie bereit sind, empfehlen wir die Färbung Osteoklasten für Tartrat-resistente Acid Phosphatase (TRAP) mit der Falle Färbung kit (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Befestigen Sie für TRAP Färbung Zellen für 30 min bei Raumtemperatur mit 2,5 % Glutaraldehyd in PBS. In der Zwischenzeit machen Sie die TRAP-Lösung von 50 µL schnell Granate Basis Lösung, 50 µL Natriumnitrit, 4,55 mL destilliertes Wasser, 50 µL Napthol AS-Biphosphate, 200 µL der Acetat-Lösung und 100 µL Tartrat Lösung vermischen.
   2. Aspirieren Sie Fixiermittel, und spülen Sie die Zellen mit PBS zweimal vor dem Hinzufügen von TRAP-Lösung für 1 h bei 37 ° C.
   3. Waschen Sie mit destilliertem Wasser vor dem zählen Osteoklasten unter dem Mikroskop (10 X Vergrößerung). Die Falle⁺ -Zellen erscheinen violett mit 3 oder mehr Kernen.

Ergebnisse

Überblick über die Zellkulturen
Die beiden Kulturtechniken ermöglichen die Beurteilung der Differenzierung auf eine Mischpopulation BMCs bestehend aus BMSCs und HSCs (Total BMCs, Abb. 1A) oder eine Bevölkerung von BMSCs von HSZ (Anhänger BMSCs, Abbildung 1 b) aufgeteilt. 48 Stunden, nachdem die Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden und (Abbildung 1 beschichtet), sie schn...

Diskussion

In diesem Artikel werden zwei Methoden der Kultur des BMSCs mit ihren Vorteilen und Einschränkungen vorgestellt. Zellen aus dem Knochenmark zu isolieren, ist ein relativ müheloses Prozess. Erlangung einer Zellpopulation, die repräsentativ für die mesenchymalen Stammzellen oder osteoclastic Vorfahren kann jedoch aufgrund der vielfältigen zellulären Umgebung des Hohlraums Knochenmark eine Herausforderung sein.

Kultivierung der Gesamtheit der Knochenmark-Inhalte bietet einen engen Darstellu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
200μL pipet tips	Rainin	17014401
1.5 mL centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 mL conical tube	VWR	89039-668
50 mL conical tube	VWR	89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	21-040-CM
Ethanol	Fisher Science	04-355-451
Dissection tools
70 μm filters	BD Falcon	352350
0.25% trypsin	Gibco	25200
Kimwipe	VWR	82003-820
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
Alkaline Phosphatase kit	Sigma-Aldrich	86R
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	S6506
Sodium Thiosulfate	Sigma-Aldrich	S7026
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	F5554-4L
Whatman filter Grade 1	Sigma-Aldrich	Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit	Sigma-Aldrich	387A
Glutaraldehyde	Electron	16220
MEMα	Gibco	12571
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9891
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
DMEM High Glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Rosiglitazone	Cayman Chemical	717410
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
RANKL	Peprotech	310-01
mCSF	Peprotech	315-02
Axio Observer inverter microscope	Zeiss