Tedavi Vankomisin ile kalsiyum sülfat ve otojen kemik kemik enfeksiyonu, geliştirilmiş tavşan modeli yüklü

Özet

Bu çalışmada geliştirilmiş bir tavşan sunar kemik iliği bakterilerde aynı miktarda engelleyerek Staphylococcus aureus ile enfekte modeli. Vankomisin yüklü kalsiyum sülfat ve otojen kemik antibiyotik ve kemik onarım tedavisi için kullanılır. Protokol kemik enfeksiyonu ve yenilenme eğitim için yararlı olabilir.

Özet

Kemik enfeksiyonu klinik, ortopedik ve travmatik cerrahi olarak tedavi etmek son derece zor bakteriyel istila kaynaklanır. Kemik enfeksiyonu sürekli iltihap, osteomiyelit ve nihai kemik sendikasız sonuçlanabilir. Uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir hayvan modelini kurulması kemik enfeksiyonu araştırma ve antibiyotik tedavisi önemlidir. İçinde vivo bir model olarak tavşan modeli kemik enfeksiyonu araştırmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, önceki çalışmalarda tavşan bakteri miktarı değişken olduğu gibi enfeksiyon durumu tutarsız, gösterdi enfeksiyon modelleri kemik. Bu çalışmada kemik enfeksiyonu bir tavşan, kemik iliği bakterilerde engelleyerek inducing için geliştirilmiş bir cerrahi yöntem sunuyor. O zaman, çok düzeyli değerlendirme modelleme yöntemi doğrulamak için yürütülen olabilir.

Genel olarak, nekrotik doku Debridmanı ve implantasyon Vankomisin yüklü kalsiyum sülfat (VCS) antibiyotik tedavisi baskın. Kalsiyum sülfat VCS içinde sürünerek osteocyte ve yeni Kemik büyümesi faydaları rağmen büyük kemik defektleri Debridmanı sonra oluşur. Otojen kemik (AB) kemik defektleri nekrotik kemik Debridmanı sonra büyük kemik defektleri tedavisi için üstesinden gelmek için çekici bir stratejidir.

Bu çalışmada, bir otojen kemik kemik üründe implante olarak kuyruk kemik kullanılır. Kemik onarım mikro-Bilgisayarlı-Tomografi (mikro-CT) ve histolojik analiz sonra hayvan kurban kullanılarak ölçüldü. Sonuç olarak, VCS grubunda, kemik sendikasız sürekli olarak elde edildi. Buna ek olarak, VCS-AB grubu Kemik defekti alanlarında önemli ölçüde azalma. Mevcut modelleme yöntemi kemik enfeksiyonu manken hazırlamak için tekrarlanabilir, uygulanabilir, istikrarlı bir yöntemi açıklanmıştır. VCS-AB tedavi daha düşük kemik sendikasız fiyatlarına sonra antibiyotik tedavisi sonuçlandı. Gelişmiş kemik enfeksiyonu modeli ve kombinasyon tedavisi VCS ve otojen kemik kemik enfeksiyonu ve kemik rejenerasyon Travmatoloji ortopedik uygulamalar için ilgili temel mekanizmaları okumak yardımcı olabilir.

Giriş

Kemik enfeksiyonu genellikle bakteri ya da diğer mikroorganizma işgalden sonra travma, kemik kırığı veya diğer kemik hastalıkları¹kaynaklanır. Kemik enfeksiyonu yüksek düzeyde inflamasyon ve kemik doku imha neden olabilir. Klinikte, kemik enfeksiyonu^2,3baskın etken Staphylococcus aureus (S. aureus) olduğunu. Kemik enfeksiyonu zayıflatıcı, acı verici ve genellikle⁴tedavi son derece zordur kronik bir ders alır. Şu anda, nekrotik doku debridman ve Vankomisin yüklü kalsiyum (VCS) boncuk yerleştirerek doğruladı yerel enfeksiyon^5,6kontrol etmek için etkili bir strateji olarak. Ancak, hastaların % %10 15 Anti-enfeksiyon tedavi⁷' den sonra uzun süreli kemik onarım işlemi, gecikmeli Birliği veya sendikasız karşılaşmış. Büyük bir Kemik defekti Ortopedik Cerrahlar için en zor bir konu kesimdir. Otolog kemik grefti en uygun kemik yerine kemik sendikasız tedavi^8,9olarak kabul edilir.

Bugüne kadar kemik üzerindeki çalışmaların en enfeksiyon ve Otolog kemik implantasyon çeşitli hayvan modelleri, sıçan, tavşan, köpek, domuz ve koyun^10,11gibi yapılmıştır. Tavşan modelleri en sık olarak kemik enfeksiyonu çalışmaları için kullanılan ilk Norden ve Kennedy tarafından 1970^12,13' te yapılacak. Önceki çalışma, tavşan modelleri tabi Norden'ın yöntem kullandık ve bulduğumuz kan kemik iliğini sızıntı bakteri çözüm taşmaya yol olarak kemik iliği enjekte S. aureus miktarı doğru bir şekilde sayısal değil ki.

Bu makalede kemik enfeksiyonu tavşan inducing için geliştirilmiş bir cerrahi yöntem sunuyor. Yordamın bitiminde, kan Biyokimya testi, bakteriyolojik muayene ve histopatolojik muayene kemik enfeksiyonu modeli doğrulamak için yapıldı. Daha sonra VCS enfeksiyon etkisizleştirmek için implante ve otojen kemik kemik rejenerasyon teşvik için implante.

Protokol

Mevcut çalışmada kullanılan tavşanlar Rehberi uygun olarak bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için tedavi edildi. Deneysel prosedürler kuralları, Biyoetik Komitesi, Zhejiang Akademi, geleneksel Çin tıbbı tarafından takip edildi.

1. bakteriyel süspansiyon hazırlanması

1. 0.5 mg tozu (ATCC 6538) ile 0.3 mL Luria-Bertani kültür ortamının dağılması S. aureus geçiyoruz. Süspansiyon tamamen karıştırın.
2. Bakteri süspansiyon tryptic soya Ağar kaplamalar üzerine çizgi ve bakteri kolonileri için 16 h 37 ° C'de kuluçkaya.
3. Birim (CFU) ve tryptic soya suyu tüpler için 24 h gerçekleştirmek için yaklaşık 24 h 37 ° C'de bir alt Kültür Kültür oluşturan bir bakteriyel koloni seçin ve faz bakteri 16-18 h, optik yoğunluk (OD) değeri 0,6 600 olduğunda sonra orta-Logaritmik büyüme elde nm ¹⁴.
4. 1 mL bakteri süspansiyon, bir santrifüj tüpüne aktarın. 825 x g ve 4 ° C, 5 min için santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Resuspend ve bakteri fosfat tamponlu tuz (PBS); 100 µL ile yıkayın Bu işlemi 3 kez tekrarlayın. Son olarak, 3 mL PBS ile bakteri resuspend.
5. McFarland'ın turbidimetry¹⁵kullanarak bakteri konsantrasyonu tahmin ediyoruz.
   1. Bulanıklık bir 0.5 McFarland standart eşdeğer olana 100-500 µL bakteri süspansiyon kolorimetrik bir tüp aktarın.
   2. Bakteri içeriği yaklaşık 10 ulaştığında bulanıklık görsel karşılaştırma için 0.5 McFarland tarafından değerlendirmek⁸ CFU/mL.
      Not: Bakteri süspansiyon bölümün aşağıdaki iletişim kuralları için yeterli olduğundan emin olun. Her tavşan için daha az 1 mL bakteri süspansiyon birimdir.
6. Bakteriyel süspansiyon, 0.2 mL bir agar plakasına aktarmak ve eşit olarak uygulayın. Plaka 16 h. sayısı için 37 ° C'de CFU bakteri süspansiyon doğrulamak için bakteri kolonileri kuluçkaya.

2. kemik enfeksiyonu modelleri hazırlanması

1. Erkek Yeni Zelanda hava kontrollü koşullar (20 ± 1 ° C) ve 12 h/12 h koyu aydınlatma döngüleri altında bireysel kafeslerde 3 ay yaşlı beyaz tavşan tutmak. Ve musluk suyu günlük rutin diyet sunuyoruz.
2. Cerrahi anda tavşan fazla 3 kg ağırlığında olun.
3. Tavşan Fentobarbital sodyum (vücut ağırlığı 100 gram başına 3 mg) ile mayi enjeksiyonla uyuşturan. Tavşan tam bir pençe çimdik için yanıt vermek için bir hata anestezi emin olun. Tavşan ameliyat masasında işlemi işlem sırasında düzeltmek.
   Not: Emin olun modelleme prosedürü süresi az 1 h..
4. Saç büyüme yönünde karşı bir Elektrikli tıraş makinesi kullanarak proksimal tibia Bölgenin tıraş. Cilt povidone-iyot çözüm uygulayarak dezenfekte.
5. Tibia ve S. aureus (tibia üst sonu 1,5 cm uzaklıkta) ile enjeksiyon kalemi ve cetvel için Delme delik pozisyon üst sonuna işaret. Delme delik konumlarını yatay tibial Plato ortasında olduğundan emin olun (şekil 1A).
6. No 11 neşter kullanarak tibia deriyi kesme ve 1 cm kesi kapaklarini (şekil 1B, C) olun. Bir 2 mm çapında bir elektrikli kemik matkap birimi (şekil 1D) kullanarak Tibia delik.
7. 2 mm çapında ve 2 mm yükseklik (şekil 1E) kemik balmumundan bir silindir ile tibial plato 2 mm çapında delik tuşuna basın. Yatay düzlemde tibial Plato (şekil 1F) boyunca yedek kemik balmumu kaldırmak. 2 mm delik (şekil 1G) kemik balmumundan tam olduğundan emin olun.
   Not: Delik ile ya da kan taşma olmadan kontrol ederek delikleri kemik balmumundan tam olduğundan emin olun.
8. Kapaklarini dikmek ve hayvan (şekil 1H) dikiş yememi önlemek için dikey yatak dikiş içinde absorbe cerrahi sütür ile cilt.
9. 1 x 10⁸ CFU/mL S. aureus Çözümleri (vücut ağırlığı 100 gram başına 30 µL) bir 1 mL asepsis enjektör ile (şekil 1ben) enjekte. İğneler kemik balmumu nüfuz ve S. aureus çözüm yavaş yavaş kemik iliği enjekte emin olun.
10. Sıcak ve temiz koşullarda modelleme sonra ısı kaybını önlemek için hayvan tutmak. Solunum ve kalp hızı izlemek. Uyanma sonra yiyecek ve su için ücretsiz erişim ile bireysel kafeslerde tavşan ev.

3. kemik enfeksiyonu modeli değerlendirilmesi

1. 7, 14, 21 ve 28 enfeksiyon sonra gün tavşan tavşan fixer fixer dışında kulak ve kafa ile içine koyun.
2. 2 mL kan kulak çevresi damarlardan bir dipotassium ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA-K2) antikoagülan kan kap içine çizin. 1 mL kan damar kan kap içine çizin. Serum 651 x g oda sıcaklığında bir hız ile 10 dk santrifüj kapasitesi.
   1. Beyaz küre sayısı (WBC) tam bir kan biyokimyasal Çözümleyicisi'ni kullanarak kan içinde belirlemek ve C - reaktif protein (CRP) tarafından bir enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) yöntem¹⁶.
3. 7, 14, 21 ve 28 enfeksiyon sonra gün Fentobarbital sodyum, 100 g vücut ağırlığı başına 3 mg doz ile bir modeli tavşan uyuşturan. No 11 neşter kullanarak tibia deriyi kesme ve 2 cm kesi kapaklarini (Şekil 2A) olun.
4. Temiz kemik balmumu. Nekrotik kemik bir elektrikli kemik matkap birimi (Şekil 2B) kullanarak iki bitişik 4.8 mm çapında delik delme tarafından yarayı. Nekrotik kemik iliği ve granülasyon dokusu bir kemik kaşık (Şekil 2C) kullanarak yarayı.
   Not: Kemik iliğinde kalan kemik dokusu önlemek için debridman sırasında kemik dokusu temiz.
5. Scrape ve iki delik (Şekil 2D) arasındaki kemik doku temiz.
6. 1 mL kemik iliği koyun kan agar levha üzerine yayıldı. Tabak gecede 37 ° C'de kuluçkaya 30-300 kolonileri tabak seçin ve koloniler sayısını hesaplayın.
7. Enfeksiyon sonra 28 günün sonunda, diz ve ayak bileği eklem kenarlarında tibia numuneler ayıklayın. %4 paraformaldehyde 24 h Decalcify için tibia numuneler tibia numuneler 8 hafta boyunca % 10 EDTA içinde düzeltmek.
8. Tibia numuneler etanol dilutions kademeli bir dizi kurutmak ve parafin balmumu embed. 4 üst üste 5 µm bölüm koronal uçak kesti. Bölümleri bir Hematoksilen ve Eozin (H & E) Boyama seti ile leke.
9. Mikroskop lekeli bölümleri görüntülemek ve standart yazılım ile iletilen ışık görüntüleri kaydetmek için kullanabilirsiniz.

4. VCS boncuk hazırlanması

1. 1 g Vankomisin hidroklorür tozu medikal sınıf kalsiyum sülfat 9.5 g ekleyin ve sonra karma gücüne 3 mL normal tuz ekleyin. Onları iyice 30-45 için bir spatula ile karıştırın s.
2. Karışık ürün esnek silikon jel kalıp (silindir 4.8 mm çap ve 4.8 mm yükseklik) yerleştirin ve kalıp esneme tarafından VCS boncuk 15 dk. kaldırmak için oda sıcaklığında kuru.

5. antibiyotik tedavisi ve otojen kemik implantasyonu

1. Fentobarbital sodyum, 100 g vücut ağırlığı başına 3 mg doz tavşanlarla modeli enfeksiyon sonra 28^inci gününde uyuşturan. Bir Elektrikli tıraş makinesi kullanarak proksimal tibia Bölgenin tıraş. Cilt povidone-iyot çözüm uygulayarak dezenfekte.
   Not: Modelleme prosedürü az 1 h olduğundan emin olun.
2. Bir Elektrikli tıraş makinesi kullanarak kuyruk bölgesi tıraş ve kuyruk povidone-iyot çözüm uygulayarak dezenfekte.
3. Cerrahi makas kullanarak kuyruk kesilmiş. No 11 neşter kullanarak kuyruk deriyi kesme ve kuyruk kemik ortaya koyuyor. Kuyruk bölgesi ile absorbe cerrahi sütür dikiş yememi hayvan önlemek için dikey yatak dikiş odasına tene dikmek.
4. Herhangi bir kas, yumuşak doku ve kapaklarini kaldırın. Her ortak, kuyruk kemik ayırmak ve kemik parçası bir 100 mm plastik tabak steril serum fizyolojik içeren transfer.
5. VCS boncuk (silindir 4.8 mm çap ve 4.8 mm yükseklik, boncuk parça başına 1.25 mg Vankomisin) 4 adet eğri cımbız (Şekil 2E) kullanarak iliği boşluğuna implant.
6. Kemik defekti doldurmak otojen kemik 8 adet ile (silindir 2 mm çapında ve 4 mm yüksekliği her parça başına) kullanarak eğri cımbız (Şekil 2E).
7. Kapaklarini dikmek ve bir yatak dikiş şekilde (Şekil 2F) absorbe cerrahi sütür ile cilt.
   Not: Sıcaklık 25 ° C'de ameliyat sırasında tutmak.
8. Hayvan ameliyattan sonra ısı kaybını önlemek için sıcak ve temiz koşulları unutmayın. Solunum ve kalp hızı izlemek. Uyanma sonra yiyecek ve su için ücretsiz erişim ile bireysel kafeslerde tavşan ev.

6. değerlendirme antibiyotik faaliyet

1. Tavşan tavşan fixer koymak ve 2, 4, 6 ve 8 haftalık tedaviden sonra baş ve iş bitirici dışında kulak yer.
2. Kan EDTA-K2 antikoagülan kan damarı ile kulak çevresi damarlar çizmek. 1 mL kan damar kan kap içine çizin. Serum 651 x g oda sıcaklığında bir hız ile 10 dk santrifüj kapasitesi.
3. Beyaz küre sayısı (WBC) tam kan kan biyokimyasal analiz ve C - reaktif protein (CRP) tarafından bir ELISA yöntemi¹⁶kullanarak belirleyin.

7. kemik rejenerasyon ilişkin Değerlendirmeler

1. Tavşan ile bir yere enjekte edilerek ötenazi dozlarda tedavi sonrasında 8 veya 12 hafta sonunda Fentobarbital sodyum.
2. Tibia numuneler, diz ve ayak bileği eklem kenarlarında ayıklayın. Kas ve Fasial katmanları yarayı.
3. Tibia yapısını mikro Bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT) kullanarak analiz. Bir oval alan 4.8 mm çap ve 9,6 mm uzun vade farkı (ROI) bölge olarak seçin. Bitmap verileri kullanarak 3D modeli görüntüleri yeniden.
4. Kemik birim/doku hacmi (BV/TV), Trabeküler kalınlığı (Tb.Th), oranını puanları seçin trabecula numarası (Tb.N) ve Trabeküler ayırma (kemik rejenerasyon değerlendirmek için Tb.Sp)from the3D modelleri.

Sonuçlar

Kemik enfeksiyonu modeli değerlendirilmesi
S. aureusile enfeksiyon sonra tavşan patolojik bulguları klinikte kronik osteomiyelit temsilcisi belirtisi benzerdi. Çalışma, 30 tavşan enfekte ve bir model grubu tabi ve 10 tavşan denetim hayvanlar tabi tutuldu. Tüm modeli tavşan sinüsler ile beyaz ve sarı irin akışı sinüsler (şekil 3A) üzerinde tibia yerel site bulaşmış. H & E boyama sonuçları bak...

Tartışmalar

Önceki çalışmalarda, hem de akut ve kronik kemik enfeksiyonu çalışmaya çeşitli hayvan modelleri inşa edildi; Ancak, ideal modeli için arama devam hala^17,18. Buna ek olarak, ideal kemik enfeksiyonu modeli modelleme dönemleri sırasında klinik ortamda kemik enfeksiyonu patolojik özelliklerini taklit, kalır düşük maliyetli ve kolay yapmak bekleniyor. Adatavşanı are elde edilebilir, uygun ve ucuz olarak şimdiye kadar tavşan kemik enfeksiyonu inf...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180