Traitement par vancomycine chargées de sulfate de Calcium et autogreffe osseuse dans un modèle de lapin amélioré d’Infection osseuse

Résumé

Cette étude présente un lapin amélioré modèle infecté par Staphylococcus aureus en bloquant la même quantité de bactéries présentes dans la moelle osseuse. Sulfate de calcium de vancomycine chargé et OS autogène sont utilisés pour traitement de réparation antibiotique et OS. Le protocole pourrait être utile pour l’étude de l’infection osseuse et la régénération.

Résumé

Infection osseuse résulte de l’invasion bactérienne, qui est extrêmement difficile à traiter en chirurgie clinique orthopédique et traumatique. L’infection osseuse peut entraîner inflammation soutenue, ostéomyélite et OS éventuelle non-syndiqués. Mise en place d’un modèle animal réalisable, reproductible est important à l’OS recherche infection et traitement antibiotique. Comme un modèle in vivo, le modèle du lapin est employé couramment dans la recherche d’une infection osseuse. Toutefois, des études antérieures sur lapin OS modèles infection a montré que le statut de l’infection était incompatible, car la quantité de bactéries a été variable. Cette étude présente une méthode chirurgicale améliorée permettant d’induire l’infection osseuse sur un lapin, en bloquant les bactéries présentes dans la moelle osseuse. Puis, les évaluations multi-niveaux peuvent effectuées pour contrôler la méthode de modélisation.

En général, les tissus nécrosés parage et implantation vancomycine chargées de sulfate de calcium (VCS) prédominent dans un traitement antibiotique. Bien que le sulfate de calcium dans VCS bénéficie ostéocytaires rampant et nouvelle croissance des os, des défauts osseux massifs se produisent après parage. OS autogène (AB) est une stratégie intéressante pour surmonter les défauts osseux pour le traitement des défauts osseux massifs après parage OS nécrosé.

Dans cette étude, nous avons utilisé l’os de la queue comme un os autogène implanté dans le défect osseux. La réparation osseuse a été mesurée à l’aide de micro--tomographie (micro-CT) et l’analyse histologique après les sacrifices d’animaux. Ainsi, dans le groupe VCS, OS hors-union a été obtenu régulièrement. En revanche, les zones de défectuosité osseuse dans le groupe VCS-AB ont diminué significativement. La présente méthode de modélisation décrit une méthode reproductible, faisable, stable pour préparer un modèle d’infection osseuse. Le traitement de VCS-AB a entraîné des taux inférieurs de déboîtement des os après un traitement antibiotique. Le modèle d’infection osseuse améliorée et le traitement de combinaison des VCS et OS autogène pourraient être utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents dans l’infection et OS la régénération osseuse des applications orthopédiques de traumatologie.

Introduction

Infection osseuse résulte habituellement de bactéries ou d’autre invasion de micro-organisme après un traumatisme, fracture de l’OS ou autres maladies osseuses¹. Infection osseuse peut induire un niveau élevé de destruction tissulaire de l’inflammation et l’os. Dans la clinique, staphylocoque doré (Staphylococcus aureus) est l’agent causatif prédominant de l’OS infection^2,3. L’infection osseuse est douloureuse, invalidante et prend souvent un cours chronique qui est extrêmement difficile à traiter⁴. À l’heure actuelle, le débridement des tissus nécrosés et implantation des perles de calcium chargés à la vancomycine (VCS) ont été confirmés comme une stratégie efficace pour contrôler l’infection locale^5,6. Cependant, 10 % à 15 % des patients ont connu un processus de réparation osseuse prolongée, retardée ou non syndiqués après traitement anti-infectieux⁷. Le grand segment d’un défect osseux est la question la plus difficile pour les chirurgiens orthopédistes. Une greffe osseuse autologue est considéré comme le remplacement optimale des os dans l’OS non syndiqués traitement^8,9.

À ce jour, la plupart des études sur les os, infection et implantation osseuse autologue ont été menées dans divers genres de modèles animaux, tels que les rats, les lapins, les chiens, les porcs et les moutons^10,11. Les modèles de lapin sont généralement utilisés pour les études d’infection osseuse, comme première interprétée par Norden et Kennedy en 1970^12,13. Dans notre étude précédente, nous avons utilisé les modèles de lapin suivant méthode de Norden, et nous avons trouvé que la quantité S. aureus injecté dans la moelle osseuse non quantifiables avec précision, comme la fuite de sang hors de la moelle osseuse a conduit à débordement de solution de bactéries.

Cet article présente une méthode chirurgicale améliorée permettant d’induire l’infection osseuse sur des lapins. À la fin de la procédure, une analyse de biochimie sanguine, un examen bactériologique et un examen histopathologique effectuées pour vérifier le modèle de l’infection osseuse. Puis, VCS a été implanté afin d’inhiber l’infection, et autogreffe osseuse a été implanté afin de promouvoir la régénération osseuse.

Protocole

Les lapins utilisés dans la présente étude ont été traitées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures expérimentales ont été suivis par les règles de la bioéthique Comité de Zhejiang Académie de médecine traditionnelle chinoise.

1. préparation de la Suspension bactérienne

1. Dissoudre 0,5 mg S. aureus lyophilisation poudre (ATCC 6538) 0,3 ml de milieu de culture de Luria-Bertani. Mélanger la suspension complètement.
2. La suspension de bactéries sur des plaques de gélose trypticase soja-ensemencer et incuber les colonies bactériennes à 37 ° C pendant 16 h.
3. Choisir une colonie bactérienne unique formant unité (UFC) et la culture en tubes de bouillon trypticase soja pendant 24 h. effectuer une sous-culture pendant environ 24 h à 37 ° C et obtenir une croissance moyenne logarithmique bactéries de phase après 16 à 18 h, lorsque la valeur de densité optique (Do) est de 0,6 à 600 nm ¹⁴.
4. Transférer 1 mL de suspension de bactéries dans un tube à centrifuger. Centrifuger pendant 5 min à 825 x g et 4 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension et laver les bactéries avec 100 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ; Répétez cette opération 3 fois. Enfin, remettre en suspension les bactéries avec 3 mL de PBS.
5. Estimation de la concentration de bactéries à l’aide turbidimétrie^{15 de McFarland}.
   1. Transférer 100 à 500 µL de suspension de bactéries dans un tube colorimétrique jusqu'à ce que la turbidité est équivalente à un standard de McFarland 0,5.
   2. Évaluer la turbidité par comparaison visuelle de la McFarland 0,5, lorsque la teneur en bactéries est environ 10⁸ UFC/mL.
      Remarque : Assurez-vous que le volume de la suspension de bactéries est suffisant pour les protocoles suivants. Pour chaque lapin, le volume de suspension de bactéries est inférieur à 1 mL.
6. Transférer 0,2 mL de la suspension bactérienne dans un plat d’agar et l’appliquer uniformément. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 16 h. comte les colonies de bactéries pour vérifier l’UFC de suspension de bactéries.

2. Elaboration de modèles d’Infection osseuse

1. Gardez Nouvelle-Zélande male lapins blancs, âgés de 3 mois, dans des cages individuelles, dans des conditions contrôlées par air (20 ± 1 ° C) et cycles du clair-obscur éclairage 12 h/12 h. Offre alimentation courante et l’eau du robinet tous les jours.
2. Garantir que, au moment de l’intervention que le lapin pèse plus de 3 kg.
3. Anesthésier lapins par injection intrapéritonéale avec pentobarbital de sodium (3 mg / 100 g de poids corporel). Assurez-vous que les lapins sont complètement anesthésiés par l’impossibilité de répondre à une pincée de patte. Difficulté des lapins sur la table d’opération au cours de la procédure de l’opération.
   Remarque : S’assurer que la modélisation durée de la procédure est moins de 1 h.
4. Raser la région proximale tibia à l’aide d’un rasoir électrique dans le sens inverse du poil. Désinfecter la peau en appliquant une solution de polyvidone iodée.
5. Marquer l’extrémité supérieure du tibia et la position des trous de forage pour l’injection avec S. aureus (la distance à l’extrémité supérieure du tibia est de 1,5 cm) avec stylet et le dirigeant. Assurez-vous que l’emplacement des trous perçage est au milieu du plateau tibial horizontalement (Figure 1A).
6. Couper la peau de tibia à l’aide d’un bistouri n° 11 et pratiquer une incision de 1 cm dans le périoste (Figure 1B, C). Percer un trou de diamètre de 2 mm dans le tibia à l’aide d’une unité de forage osseuse électrique (Figure 1D).
7. Appuyez sur les trous de diamètre 2 mm sur le plateau tibial avec un cylindre de cire osseuse de 2 mm de diamètre et 2 mm de hauteur (Figure 1E). Enlever la cire osseux détachées le long du plan horizontal du plateau tibial (Figure 1F). Vérifier que le trou de 2 mm est plein de cire de l’OS (Figure 1G).
   Remarque : Assurez-vous que les trous sont pleins de cire de l’os en vérifiant le trou avec ou sans trop plein de sang.
8. Recoudre le périoste et la peau avec une suture chirurgicale résorbable en une suture verticale matelas pour empêcher l’animal de mâcher les sutures (Figure 1H).
9. Injecter 1 x 10⁸ UFC/mL de S. aureus solutions (30 µL / 100 g de poids corporel) avec un injecteur d’asepsie de 1 mL (Figure 1j’ai). Vérifiez que les aiguilles pénètrent la cire osseuse et injectent doucement la solution de S. aureus dans la moelle osseuse.
10. Garder l’animal dans des conditions chaudes et propres pour éviter la perte de chaleur après modélisation. Surveiller la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque. Après le réveil, abritent les lapins dans des cages individuelles avec libre accès à la nourriture et l’eau.

3. évaluation du modèle d’Infection osseuse

1. Au jour 7, 14, 21 et 28 après l’infection, placer les lapins dans le fixateur de lapin avec la tête et les oreilles à l’extérieur le fixateur.
2. Dessiner 2 mL de sang dans les veines auriculaires dans un récipient sang anticoagulant dipotassium EDTA acid (EDTA-K2). Dessiner 1 mL de sang d’un vaisseau sanguin dans un récipient de sang. Centrifuger le sérum pendant 10 min avec une vitesse de 651 x g à la température ambiante.
   1. Déterminer les globules blancs (WBC) dans le sang entier à l’aide d’un analyseur biochimique du sang, et la protéine C - réactive (CRP) par une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) méthode¹⁶.
3. Au jour 7, 14, 21 et 28 après l’infection, anesthésier un lapin de modèle avec le pentobarbital sodique à la dose de 3 mg / 100 g de poids corporel. Couper la peau de tibia à l’aide d’un bistouri n° 11 et pratiquer une incision de 2 cm dans le périoste (Figure 2A).
4. Nettoyer la cire de l’os. Débrider OS nécrosé en perçant des trous de diamètre voisin de 4,8 mm deux à l’aide d’une unité de forage osseuse électrique (Figure 2B). Débrider nécrotiques de la moelle osseuse et le tissu de granulation à l’aide d’une cuillère de l’OS (Figure 2C).
   Remarque : Nettoyer le tissu osseux pendant le débridement pour éviter le tissu osseux restant dans la moelle osseuse.
5. Gratter et nettoyer le tissu osseux entre les deux trous (Figure 2D).
6. Étaler 1 mL de moelle osseuse sur plaques de gélose au sang de mouton. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C. Sélectionner les plaques de 30 à 300 colonies et calculer le nombre de colonies.
7. À la fin de 28 jours après l’infection, extrait des spécimens de tibia sur les bords des articulations du genou et la cheville. Difficulté les spécimens de tibia dans paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h. détartrer les spécimens de tibia dans EDTA 10 % pendant 8 semaines.
8. Déshydrater les spécimens de tibia dans une série graduée de solutions dans l’éthanol et ensuite incorporer à la cire de paraffine. Couper les 4 sections de µm 5 consécutifs depuis les plans coronales. Tacher les sections avec un hématoxyline et éosine (H & E) coloration kit.
9. Utiliser un microscope pour voir les sections colorées et enregistrer des images en lumière transmises avec le logiciel standard.

4. préparation des perles de VCS

1. Ajouter 1 g de poudre de chlorhydrate de vancomycine à 9,5 g de sulfate de calcium de qualité médicale et puis ajouter 3 mL de soluté physiologique à l’alimentation mixte. Mélanger soigneusement avec une spatule pour 30 à 45 s.
2. Placez le produit mélangé dans un moule souple gel de silice (cylindre de 4,8 mm de diamètre et de hauteur 4,8 mm) et sécher à température ambiante pour 15 min. retirer les perles de VCS en fléchissant le moule.

5. l’antibiothérapie et l’Implantation de l’OS autogène

1. Anesthésier lapins de modèle avec le pentobarbital sodique à la dose de 3 mg / 100 g de poids corporel sur la 28^e jour après l’infection. Raser la région proximale tibia à l’aide d’un rasoir électrique. Désinfecter la peau en appliquant la solution de povidone-iode.
   Remarque : S’assurer que la procédure de modélisation est moins de 1 h.
2. Raser la région de la queue à l’aide d’un rasoir électrique et désinfecter la queue en appliquant la solution de povidone-iode.
3. Couper la queue à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Couper la queue de peau à l’aide d’un bistouri n° 11 et révéler le coccyx. Recoudre la peau dans la région de la queue avec les sutures chirurgicales en une suture verticale matelas pour empêcher l’animal de mâcher les sutures résorbables.
4. Supprimer n’importe quel muscle, le tissu mou et le périoste. Détacher le coccyx à chaque joint et transférer le fragment d’os dans un plat en plastique 100 mm contenant du sérum physiologique stérile.
5. 4 morceaux de perles VCS (cylindre de diamètre 4,8 mm et 4,8 mm hauteur, vancomycine 1,25 mg par pièce de perle) l’implant dans la cavité de moelle osseuse à l’aide de la pincette courbée (Figure 2E).
6. Remplir le défect osseux avec 8 morceaux d’OS autogènes (cylindre de diamètre 2 mm et 4 mm de hauteur par chaque pièce) en utilisant courbé pincettes (Figure 2E).
7. Recoudre le périoste et la peau avec des sutures chirurgicales absorbables de façon matelas suture (Figure 2F).
   Remarque : Maintenir la température à 25 ° C pendant la chirurgie.
8. Garder l’animal dans des conditions chaudes et propres pour éviter la perte de chaleur après la chirurgie. Surveiller la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque. Après le réveil, abritent les lapins dans des cages individuelles avec libre accès à la nourriture et l’eau.

6. les évaluations de l’activité antibiotique

1. Mettre des lapins dans un fixateur de lapin et placez la tête et les oreilles à l’extérieur le fixateur à 2, 4, 6 et 8 semaines après le traitement.
2. Prélever du sang des veines auriculaire avec des vaisseaux sanguins anticoagulant EDTA-K2. Dessiner 1 mL de sang d’un vaisseau sanguin dans un récipient de sang. Centrifuger le sérum pendant 10 min avec une vitesse de 651 x g à la température ambiante.
3. Déterminer le nombre de globules blancs (WBC) dans le sang entier en utilisant l’analyseur de sang biochimique et protéine C - réactive (CRP) par méthode ELISA¹⁶.

7. les évaluations de la régénération osseuse

1. Euthanasier des lapins en injectant une doses de pentobarbital sodique, à la fin de 8 ou 12 semaines après le traitement.
2. Extrait de spécimens de tibia, le long des bords des articulations du genou et la cheville. Débrider les muscles et les fascias couches.
3. Analyser la structure du tibia à l’aide de micro-la tomodensitométrie (micro-CT). Choisissez une zone ovale 4,8 mm de diamètre et 9,6 mm de long dans la région d’intérêt (ROI). Reconstruire les images de modèle 3D à l’aide de données bitmap.
4. Choisissez les scores du ratio du volume de volume/tissu osseux (BV/TV), épaisseur trabéculaire (Tb.Th), nombre de trabecula (Tb.N) et de la séparation trabéculaire (Tb.Sp)from the3D modèles visant à évaluer la régénération osseuse.

Résultats

Évaluation du modèle d’Infection osseuse
Après infection par Staphylococcus aureus, des manifestations pathologiques de lapins ressemblaient au symptôme représentatif de l’ostéomyélite chronique dans la clinique. Dans notre étude, 30 lapins ont été infectés et soumis comme un groupe de modèles et 10 lapins ont été soumis comme des animaux témoins. Tous les lapins de modèle ont infecté des sinus du site local tibia, avec pus blanc et jaune ...

Discussion

Dans les études précédentes, différents types de modèles animaux ont été construits afin d’étudier les deux infections aiguës et chroniques des os ; Cependant, la recherche de modèle idéal persiste^17,18. En outre, le modèle d’infection osseuse idéale est censé simuler les caractéristiques pathologiques de l’infection osseuse dans un contexte clinique, tandis que les périodes de modélisation, de rester faible coût et facile à réaliser. J...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180