万古霉素滴入硫酸钙和自体骨治疗兔骨感染的改进模型

摘要

本研究通过阻断骨髓中相同数量的细菌, 提出了一种感染金黄色葡萄球菌的改良兔模型。万古霉素负载硫酸钙和自体骨用于抗生素和骨修复治疗。该方案可为骨感染和再生的研究提供参考。

摘要

骨感染是由细菌入侵引起的, 在临床、整形外科和创伤性手术中, 细菌感染是极其困难的。骨感染可能导致持续炎症、骨髓炎和最终骨不愈合。建立可行、可重复的动物模型对骨感染研究和抗生素治疗具有重要意义。作为体内模型, 兔模型在骨感染研究中得到了广泛的应用。然而, 此前对兔骨感染模型的研究表明, 由于细菌数量是可变的, 感染状态不一致。本研究通过阻断骨髓中的细菌, 提出了一种诱导兔骨感染的改进手术方法。然后, 进行多层次的评价, 验证建模方法。

一般情况下, 脱骨坏死组织和植入香康辛负载硫酸钙 (vcs) 是抗生素治疗的主要优势。尽管 vcs 中的硫酸钙有利于骨细胞的爬行和新的骨生长, 但大量的骨缺损发生后, 脱骨。自体骨 (ab) 是一种治疗坏死骨后骨缺损的一种吸引人的方法。

在这项研究中, 我们使用尾骨作为自体骨植入骨缺损。采用显微断层扫描 (微 ct) 和动物牺牲后的组织学分析测量骨修复。因此, 在 vcs 组中, 持续获得骨不愈合。相比之下, vcs-ab 组的骨缺损区明显减少。目前的建模方法描述了一种可重复、可行、稳定的骨感染模型制备方法。vcs-ab 治疗导致抗生素治疗后骨不愈合率降低。改进的骨感染模型以及 vcs 和自体骨的联合治疗有助于研究与创伤骨科应用相关的骨感染和骨再生的潜在机制。

引言

骨感染通常是由创伤、骨折或其他骨骼疾病后的细菌或其他微生物入侵^引起的。骨感染可能导致高水平的炎症和骨组织破坏。在临床上,金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 是骨感染^的主要病原体 2^,3.骨感染是痛苦的, 使人虚弱的, 往往是慢性的, 是极难治疗^的4。目前, 清创坏死组织和植入万古霉素负载钙 (vcs) 珠已被证实为控制局部感染^5,6的有效策略。然而, 10% 至15% 的患者经历了长期的骨修复过程, 延迟愈合, 或抗感染治疗后^{不愈合 7}。骨缺损的大部分是整形外科医生最困难的问题。自体骨移植被认为是骨不结合治疗^8,9的最佳骨置换方法。

到目前为止, 关于骨感染和自体骨植入的研究大多是在各种动物模型中进行的, 如老鼠、兔子、狗、猪和羊^10、11.兔子模型最常用于骨感染研究, 这是诺登和肯尼迪在 1970年^12,13首次进行的。在我们之前的研究中, 我们采用了 nnoren 方法的兔子模型, 我们发现注入骨髓的金黄色葡萄球菌的数量无法准确量化, 因为从骨髓中漏出的血液导致细菌溶液溢出。

本文提出了一种改良的家兔骨感染的手术方法。在手术结束时, 进行血液生化检查、细菌学检查和组织病理学检查, 以验证骨感染模型。然后, 植入 vcs 抑制感染, 自体骨植入, 促进骨再生。

研究方案

本研究中使用的兔子按照《实验动物护理和使用指南》进行处理。所有的实验程序都遵循了浙江中医药研究院生物伦理委员会的规则。

1. 细菌悬浮液的制备

1. 溶解0.5 毫克金黄色葡萄球菌冷冻干燥粉 (atcc 6538) 与0.3 毫升的卢里亚-伯塔尼培养基。将悬架完全混合。
2. 将细菌悬浮液流到色氨酸大豆琼脂板上, 在37°c 孵育细菌菌落16小时。
3. 选择单个菌落形成单元 (cfu) 并在色质豆瓣管中培养 24小时, 在37°c 下进行约24小时的亚培养, 在16至18小时后得到中对数生长相菌, 当时光学密度 (od) 值为0.6 纳米, 为600纳米^14岁
4. 将1毫升的细菌悬浮液转移到离心管中。在 825 x g和4°c 下离心 5分钟, 并丢弃上清液。用100μl 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对细菌进行再利用和清洗;重复此步骤3次。最后, 用3毫升的 pbs 重新悬浮细菌。
5. 使用麦克法兰的浊度法估计细菌浓度¹⁵。
   1. 将100至500μl 的细菌悬浮液转移到比色管中, 直到浊度相当于 0.5 mcfarland 标准。
   2. 当细菌含量达到约 10 8 chuml 时, 通过与0.5 麦克法兰的视觉比较来评估浊度。
      请注意:确保细菌悬浮液的体积足以满足以下方案。每只兔子的细菌悬浮量都小于1毫升。
6. 将0.2 毫升的细菌悬浮液转移到琼脂板上, 均匀地应用。在37°c 下将板体在37°c 下培养 16小时, 数一数菌落, 以验证细菌悬浮液的 cfu。

2. 骨感染模型的制备

1. 将3个月大的新西兰雄性白兔关在单独的笼子里, 在空气控制的条件下 (20±1°c) 和12小时的浅暗照明周期。每天提供日常饮食和自来水。
2. 确保在手术时兔子的体重超过3公斤。
3. 用戊巴比妥钠 (每100克体重3毫克) 腹腔注射对白兔进行麻醉。确保兔子因未能对爪子夹紧做出反应而完全麻醉。在手术过程中将兔子固定在手术台上。
   请注意:确保建模过程持续时间小于1小时。
4. 用电动剃须刀对头发生长方向进行剃须胫骨近端区域。通过应用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
5. 用笔和尺子标记胫骨的上端和注射的钻孔位置 (与胫骨上端的距离为1.5 厘米)。确保钻孔位置水平位于胫骨平台中间 (图 1a)。
6. 用11号手术刀切割胫骨皮肤, 并在骨膜上做一个1厘米的切口 (图 1b, c)。用电骨钻装置在胫骨上打一个直径2毫米的洞 (图 1d)。
7. 用直径为2毫米、高度为2毫米的骨蜡圆筒按胫骨平台上直径2毫米的孔 (图 1e)。沿胫骨平台的水平平面取出备用骨蜡 (图 1f)。检查2毫米孔是否充满了骨蜡 (图 1g)。
   请注意:通过检查有或没有血液溢出的孔, 确保孔充满骨蜡。
8. 用垂直床垫缝合线缝合骨膜和皮肤, 以防止动物咀嚼缝合线 (图 1h)。
9. 用1毫升无菌注射器 (图1i) 注入 1 x 10 8 chun 溶液 (每100克体重 30μl)。确保针头穿透骨蜡, 慢慢地将金黄色葡萄球菌溶液注入骨髓。
10. 在温暖和清洁的条件下保持动物, 以避免建模后的热损失。监测呼吸率和心率。醒来后, 把兔子关在单独的笼子里, 可以自由获得食物和水。

3. 骨感染模型的评价

1. 在感染后的第7天、第14天、第21天和第28天, 将兔子放在兔子固定器中, 头部和耳朵在固定器外面。
2. 将耳静脉中的2毫升血液放入乙二胺乙酸 (edta-k2) 抗凝血容器中。将血管中的1毫升血液放入血液容器中。在室温下离心血清 10分钟, 速度为 651 x 克.
   1. 用血液生化分析仪测定全血白细胞计数 (wbc), 用酶联免疫吸附法 (elisa) 方法¹⁶测定 c 反应蛋白 (crp)。
3. 在感染后的第7天、第14天、第21天和第28天, 麻醉一种模型兔与戊巴比妥钠的剂量为每100克体重3毫克。用11号手术刀切割胫骨皮肤, 并在骨膜上做一个2厘米的切口 (图 2a)。
4. 清洁骨蜡。用电动骨钻单元打两个直径4.8 毫米的相邻孔, 拆除坏死骨 (图 2b)。用骨胶勺脱下坏死的骨髓和肉芽组织 (图 2c)。
   请注意:在清创过程中清洁骨组织, 以避免骨髓中残留的骨组织。
5. 刮擦和清洁两个孔之间的骨组织 (图 2d)。
6. 将1毫升骨髓撒在羊血琼脂板上。在37°c 下连夜孵化板材。选择30-300 个菌落板, 并计算菌落数。
7. 在感染后的第28天结束时, 沿膝关节和踝关节边缘提取胫骨标本。将胫骨标本测定4% 的甲醛 24小时, 用10% 的 edta 对胫骨标本进行解码, 为期8周。
8. 在分级系列乙醇稀释中脱水胫骨标本, 然后嵌入石蜡中。从日冕平面上连续切割 4个5μm 部分。用血红素和 eosin (h & e) 染色试剂盒染色。
9. 使用显微镜查看染色的部分, 并使用标准软件记录透射的光线图像。

4. vcs 珠子的制备

1. 在9.5 克医用硫酸钙中加入1克盐酸万古霉素粉, 然后在混合动力中加入3毫升的生理盐水。用铲子将它们彻底混合30至45秒。
2. 将混合产品放入柔性硅胶模具 (直径 4.8 mm、高度 4.8 mm 的圆柱体) 中, 在室温下干燥 15分钟. 通过弯曲模具取出 vcs 珠子。

5. 自体骨的抗生素治疗与植入

1. 在感染后^的28天内, 以每100克体重3毫克的剂量对模型兔子进行麻醉。使用电动剃须刀剃须胫骨近端区域。应用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
   请注意:确保建模过程小于1小时。
2. 使用电动剃须刀刮尾区域, 并应用 povidone-idi 溶液对尾巴进行消毒。
3. 用手术剪刀把尾巴剪下来。用11号手术刀切割尾巴皮肤, 露出尾骨。用垂直床垫缝合线缝合尾部区域的皮肤, 防止动物咀嚼缝合线。
4. 去除任何肌肉、软组织和骨膜。在每个关节处分离尾骨, 并将骨头碎片转移到含有无菌盐水的100毫米塑料盘中。
5. 使用弯曲的推子将4块 vcs 微珠 (直径4.8 毫米、高度4.8 毫米的圆柱体、每颗珠子1.25 毫克万古霉素) 插入骨髓腔 (图 2e)。
6. 用弯曲的推子填充骨头缺陷, 用8块自生骨 (每块直径为2毫米、每块4毫米高的圆筒) (图 2e)。
7. 用可吸收的手术缝合线缝合骨膜和皮肤, 用床垫缝合方式缝合 (图 2f)。
   请注意:手术期间将温度保持在25°c。
8. 保持动物在温暖和清洁的条件下, 以避免手术后的热损失。监测呼吸率和心率。醒来后, 把兔子关在单独的笼子里, 可以自由获得食物和水。

6. 抗生素活性评估

1. 将兔子放入兔子固定器中, 并在治疗后2、4、6和8周将头部和耳朵放在固定器外面。
2. 用 edta-k2 抗凝血血管从耳膜中抽血。将血管中的1毫升血液放入血液容器中。在室温下离心血清 10分钟, 速度为 651 x 克.
3. 用血液生化分析仪测定全血白细胞计数 (wbc), 用 elisa 方法¹⁶测定 c 反应蛋白 (crp)。

7. 骨再生评估

1. 在治疗后8或12周结束时, 注射过量的戊巴比妥钠, 使兔子安乐死。
2. 提取胫骨标本, 沿着膝盖和脚踝关节的边缘。清除肌肉和筋膜层。
3. 采用显微断层扫描 (mtt) 对胫骨结构进行分析。选择一个椭圆形区域4.8 毫米直径和9.6 毫米长的感兴趣的区域 (roi)。使用位图数据重建3d 模型图像。
4. 从3d 模型中选择骨体积/组织体积 (bv/tv)、小梁厚度 (tb. th)、小梁数 (tb. n) 和小梁分离 (tb. sp) 的比例得分, 以评估骨再生。

结果

骨感染模型的评价
兔感染金黄色葡萄球菌后, 其病理表现与临床上慢性骨髓炎的典型症状相似。在我们的研究中, 30只家兔被感染, 并作为模型组进行了研究, 10只兔子被作为对照动物。所有模型兔都感染了胫骨局部部位的鼻窦, 从鼻窦流出白色和黄色脓液 (图 3a)。h & e 染色结果表明, 模型组细菌聚集物位于死骨周围, ?...

讨论

在以往的研究中, 构建了各种动物模型, 研究急性和慢性骨感染;然而, 对理想模型的寻找仍然持续到^17,18。此外, 理想的骨感染模型有望模拟临床环境下骨感染的病理特征, 而建模期间, 成本仍然较低, 易于实施。目前, 兔骨感染模型是炎症性骨病研究中最常见的模型, 因为兔子是可用的、可行的、廉价的。在我们之前的研究中, 我们比较了不同体重的兔子的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable surgical suture	Jinghuan	18S0604A
asepsis injector	Jinglong	20170501
bone wax	ETHICON	JH5CQLM
CCD camera	Olympus	DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel	XINGE	20170802
Electric bone drill unit	Bao Kang	BKZ-1
Electric shaver	Codos	3800
flexible silica gel mold	WRIGHT	1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	20170523
Luria-Bertani culture medium	Baisi Biothchnology	20170306
Medical-grade calcium sulphate	WRIGHT	1527745
microcomputed tomography (micro-CT)	Bruker	SkyScan 1172
Microscope	Olympus	CX41
New Zealand white rabbits	Zhejiang Experimental Animal Center	SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel	Yuanlikang	20170604
normal saline	Mingsheng	20170903
PBS	TBD(Jingyi)	20170703-0592
pentobarbital sodium	Merk	2070124
povidone-iodinesolution	Lierkang	20170114
S. aureus freeze drying powder	China General Microbiological Culture Collection Center	ATCC 6538
sheep blood agar	HuanKai Microbial	3103210
tryptic soy agar plates	HuanKai Microbial	3105697
tryptic soy broth tubes	HuanKai Microbial	3104260
Vancomycin	Lilly	C599180