Bir sıçan modelinde en iyi duruma getirilmiş yapısı ile Electrospun vasküler greft implantasyonu

Özet

Burada, PCL vasküler Greftler kalın elyaf ve iri gözenekli ile imal ve abdominal aort değiştirme bir sıçan modelinde vivo içinde performansını değerlendirmek için bir iletişim kuralı tanımlamak için modifiye electrospinning yöntemi mevcut.

Özet

Burada, macroporous PCL vasküler greft imal ve abdominal aort değiştirme bir fare modeli kullanarak bir değerlendirme protokolü tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Electrospun vasküler Greftler kez hücre infiltrasyonu Greftler içine sınırlamak ve yenilenme ve neo-damarların remodeling engel nispeten küçük gözenekleri, sahip. Bu çalışmada, PCL vasküler Greftler kalın elyaf (5-6 µm) ve daha büyük gözenekler (~ 30 µm) ile modifiye işleme tekniği kullanarak fabrikasyon. Uzun vadeli performansı greft implantasyonu bir sıçan abdominal aort modeli tarafından incelendi. Ultrason analiz Greftler patent anevrizması veya stent implantasyonu bile 12 ay sonra meydana gelen olmadan kaldı gösterdi. Macroporous yapısı hücre ingrowth geliştirilmiş ve böylece 3 ayda yeniden doku terfi. Daha da önemlisi, olumsuz, 12 ay sonra greft duvar içinde kireçlenme gibi şeklinin değiştiğine dair işaret yok oldu. Bu nedenle, electrospun PCL vasküler Greftler değiştirilmiş macroporous işleme ile bir arter yerine uzun vadeli implantasyon için olmak potansiyel tutun.

Giriş

Vasküler Greftler sentetik polimerler yapılan yaygın olarak klinik kardiyovasküler hastalıklar (CVDs) tedavisi için kullanılmaktadır. Ne yazık ki, söz konusu olduğunda küçük çaplı vasküler Greftler (D < 6 mm) mevcuttur herhangi başarılı bir ürün nedeniyle sık sık kan pıhtılaşması, intimal hiperplazi ve diğer yol açar azaltılmış kan akım hızı tarafından tetiklenen düşük açıklık komplikasyonlar¹.

Doku mühendisliği uzun vadeli açıklık ve bir iskele güdümlü vasküler yenilenme ve yeniden yapılanma dayalı homeostazı gerçekleştirmek için alternatif bir strateji sağlar. Ayrıntılı olarak, vasküler greft, üç boyutlu bir şablon olarak mekanik destek ve dahil hücre adezyon, göç, yayılması, damar dokusu ve etkisi hücresel fonksiyonları yeniden oluşturma sırasında yapısal rehberlik sağlayabilir ve hücre dışı matriks²salgılanmasını. Şu ana kadar çeşitli sentetik polimerler damar doku mühendisliği uygulamalarında değerlendirilir. Bu polimerler arasında poly(ε-caprolactone) (PCL) yoğun bir şekilde iyi hücre uyumluluk ve birkaç ay sonra iki yıl³' e kadar yavaş bozulması nedeniyle soruşturma. Mükemmel yapısal bütünlüğü ve açıklık ve neovaskülarizasyon içinde de kadar sürekli artan hücre işgal PCL vasküler greft electrospinning tarafından işlenen bir sıçan aort modeli^4,5,6' da sergilenen greft duvar 6 aya kadar için. Ancak, olumsuz doku, hücre ve kılcal damarlar ve kalsifikasyon, regresyon dahil olmak üzere remodeling Ayrıca gözlendi daha uzun timepoints yukarı 18 ay.

Cellularization vasküler greft doku rejenerasyonu belirlenmesi ve⁷remolding önemli bir faktördür. Electrospinning, çok yönlü bir teknik olarak yaygın nano-lifli yapısı⁸ile vasküler greft hazırlanması için istihdam edilmiştir. Ne yazık ki, nispeten küçük gözenek yapısı genellikle yetersiz hücre infiltrasyonu sonraki doku rejenerasyonu sınırlar electrospun vasküler greft içinde yol açar. Bu sorunu gidermek için çeşitli teknikler gözenek boyutu ve^9,10, toplayıcı cihazları, lazer radyasyon^{11 tarafından tedavi sonrası modifikasyonu leaching tuz/polimer dahil olmak üzere toplam gözeneklilik artırmak için kurulması denenen} , vs. Aslında, electrospun Greftler (lif çapı, gözenek boyutu ve porozite dahil) yapısını işleme koşulları^12,13ile yakından ilgilidir. Electrospinning sırasında lif çapı kolayca Polimer çözüm, akış hızı, voltaj, vbkonsantrasyonu gibi parametreleri değiştirerek kontrol edilebilir. ^{14 , 15}, ve bu nedenle, gözenek boyutu ve porozite buna göre geliştirilmiştir.

Biz son zamanlarda değiştirilmiş bir PCL electrospun greft macroporous yapısı (5-7 µm çapını ve 30-40 µm gözeneklerin lifleri) ile bildirdi. Karın sıçan Aortası değiştirerek in vivo implantasyon 3 ay ameliyat sonrası¹⁶, açıklık, hem de iyi endothelialization ve düz kas yenilenme oranı yüksek gösterdi. Daha da önemlisi, hiçbir olumsuz doku kalsifikasyon ve hücre regresyon dahil olmak üzere remodeling implantasyon bile bir yıl sonra gözlenen.

Protokol

Deneysel hayvan kullanımı hayvan deneyleri Etik Komitesi Nankai Üniversitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanmak için Kılavuzu uygun olarak yürütülmektedir.

1. Electrospun PCL Greftler imalatı

Not: Burada, vasküler Greftler imal etmek bir electrospinning tekniği kullanılmıştır.

1. PCL çözümleri 25 wt % ve 10 wt %, sırasıyla, metanol ve kloroform, karışımı PCL çözülerek hazırlamak (1:5 hacim oranı), oda sıcaklığında (RT) 12 h için.
2. PCL çözüm 10 mL Cam şırınga yükleyin.
3. Şırınga ile 21-G iğne yerleştirin.
4. Paslanmaz çelik mandrel (2 mm çapında, uzunluğu 25 cm) koleksiyon araç üzerinde yerleştirin.
5. Lif kalın Greftler için kullanın PCL çözüm 25 wt %, çalışma mesafesi toplayıcı için iğne ucu 17 cm, 8 mL/h debi ve gerilim 11 kV electrospinning parametre olarak. İnce lifli greft için 10 wt %, iğne ucu 20 cm toplayıcı için çalışma mesafesi, 2 mL/h debi ve gerilim 18 PCL çözüm kullanın kV electrospinning parametre olarak.
6. Elde edilen Greftler gecede kalan solvent kaldırmak için vakum yerleştirilir emin olun. Önce yordamı tüm aletleri sterilize ve aseptik teknik boyunca korumak.
7. İmplantasyon öncesinde Greftler dezenfekte onları 10 ml % 75 etanol için 30 dk çeker ve sonra onları ifşa UV ışığı gecede.
8. Lif ve gözenek boyutu ölçüleri: ImageJ yazılım elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri taramak tabanlı kullanarak ortalama lif çapı hesaplamak.
9. Mekanik iskele test:
   1. Bir tıraş bıçağı kullanarak uzunluğu 3 mm bölümlere borulu iskele kesti. Bir mikrometre kullanarak iskele kalınlığını ölçmek.
   2. 100 N. yük kapasiteli bir gerilme test makinede borulu iskele yerleştirin
   3. 1 mm arası kelepçe mesafe ve 10 mm/dk hızında boyuna çekme ile iskele rüptürü kadar kelepçe. Çekme dayanımı ve kopma nihai uzama ölçmek. Young katsayısı ilk doğrusal bölgesinden hesaplamak (en fazla % 5 zorlanma) stres gerginlik eğrisi.

2. fare Abdominal aort implantasyon modeli

Not: Tüm malzeme ve kullanılan aletler steril. Ameliyat sırasında operatör bir gazlı bez maske ve enfeksiyonları önlemek için steril eldiven giyer emin olun. Oda sıcaklığında hayvan vücut ısısını korumak için 27-30 ° C'de tutulur emin olun. Analjezi ile ilgili yerel IACUC yönergeleri izleyin.

1. Vasküler greft alıcıları 240-270 g ağırlığında erkek Sprague Dawley rat kullanın. Fareyi ameliyattan önce 24 saat oruç emin olun. 24 h açlık sıçanlara amacı boş dışkı bağırsak yeterince, böylece operatörün ufku genişletmek.
2. Sıçan arka boyun kavramak ve kafasını aşağıya doğru tutmak, alt karın karın boşluğuna springe iğne yerleştirin. Kloral hidrat (330 mg/kg) ile anestezi için fare mayi iğne tarafından ikna etmek.
3. Yeterli anesthetization sıçan kasları ve düzenli nefes rahat sağlayarak onaylayın. Çalışma mikroskop altında fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
4. Petrolatum oftalmik veteriner merhem Gözlerde kuruluk anestezi iken altında önlemek için geçerlidir. AntiCoagulation (100 UI/kg) ameliyattan önce kuyruk ven enjeksiyonla heparinized fizyolojik serum çözüm (50 UI/mL) ile yönetebilirsiniz.
5. Bir tıraş bıçağı kullanarak ön karın duvarındaki kürk kapalı tıraş ve deri iyot çözüm ve Tıbbi alkol çözümü kullanarak temiz.
6. Laparotomi ensizyon cerrahi makas ile gerçekleştirmek ve belgili tanımlık kesme yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda olduğundan emin olun ve karın boşluğu karşı karşıya.
7. Geri çekmek ve bağırsak ile tuzlu çözüm tercihen ıslatılmış gazlı bez ile sarın.
8. Abdominal aort dikkatle incelemek.
9. Tanımlamak ve tüm küçük dalları 9-0 monofilament naylon dikiş kullanarak ligate.
10. İzole bölüm kelepçe (ilâ 1 cm uzunluğunda) iki damar kelepçeler kullanılarak aort. Aorta için 20-30 dk klempe kalabilir.
11. İki kelepçeler anastomoz siteleri oluşturmak için mikro-makas kullanarak arasında karın aortu transect.
12. Artık kan kaldırmak için heparinized serum fizyolojik (50 UI/mL) çözüm kullanarak aort iki ucunun floş.
13. Mikro-makas kullanarak adventitia soyma.
14. Greft ile 2 mm iç çap ve 1 cm uzunluğunda sıçan abdominal aort için 9-0 monofilament naylon dikiş kullanarak bir sekiz şekli dikiş desen ile anastomose.
15. İlk olarak, dört anastomoses, 9, 3, 12 ve 06: 00 proksimal yan konumlarda sırasına göre oluşturmak, sonra iki dikiş arasında 4 dikiş kesilmiş kenarları anastomose. Proksimal dikiş bittikten sonra aynı yöntemle distal yan dikiş.
    Not: Her dikiş yerli yan biraz greft gömülü olduğu için gereklidir.
16. Kan nakli akışını sağlamak için distal klempi kaldırın, sonra proksimal klemp kaldırın.
17. Dikiş biter steril bir pamuk veya bir küçük gazlı bez sünger kullanarak kanamayı durdurmak için tuşuna basın. Yaklaşık 3 dakika için hemostazın kadar basın.
18. Bağırsak karın boşluğuna dönün.
19. Karın boşluğu sıcak fizyolojik serum çözüm gentamisin ile (320 U/mL) kullanarak floş.
20. 3-0 naylon dikiş kas ve deri katmanının içinde sırasıyla kullanarak karın duvarına kadar dikmek.
21. Fareyi bir temiz ve kuru kafesin içine yerleştirin ve bir ısıtma yastığı hayvan vücut ısısını korumak için kafes altında koymak; daha sonra fareyi anesteziden kurtarmak bekleyin. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar hayvan için katılmak.
22. Bilinci yerine sonra yiyecek ve su ile tek bir kafes içinde fare koydu. İyot ameliyattan sonra enfeksiyonu önlemek için yaranın üzerine uygulayın. Tamamen iyileşene kadar fareyi diğer hayvanlar şirkete geri.
23. Fareler önceden belirlenmiş zaman noktalarda kurumsal esaslarına göre ötenazi.

Sonuçlar

PCL Greftler 3 ay ve 12 ay post-operatively explanted ve hematoksilen eozin (H & E) için standart histolojik teknikler Masson trichrome, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa ve α-SMA için boyama ayirt analiz, MYH, vWF ve elastin. Histolojik görüntüleri dik bir mikroskop kullanarak alındı ve fluorescence mikroskop kullanarak ayirt görüntüleri alındı.

Tüm verileri ± SD demek gibi ifade edildi Eşleştirilmiş iki k...

Tartışmalar

Hücre infiltrasyonu rejenerasyon için kritik ve remodeling vasküler greft vivo içinde¹⁶. Sınırlı hücre infiltrasyonu kez hücreleri geçiş greft duvara engel greft nispeten küçük gözeneklerin ilgilidir. Bu zorluk adrese, electrospun PCL vasküler greft büyük gözenek yapısı ile hazırlamak için değiştirilmiş bir yöntem geliştirdi. Ayrıntılı olarak, kolayca işleme parametreleri tarafından kontrol edilebilir fiber kalınlığı artış ile gözenek boyutu artmı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000)	Sigma	704067
Methanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alcohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sucrose	Tianjin Fengchuan Company	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley rats	Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normal saline	Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloral hydrate	Tianjin Ruijinte chemical company	2223
Heparin sodium Injection	Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamycin Sulfate Injection	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody	Abcam	ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody	Abcam	ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody	Abcam	ab23748
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody	Abcam	ab6994
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normal goat serum	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxylin and eosin (H&E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Masson's trichrome	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	G3002b
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	H901