Implantation von Electrospun Vascular Grafts mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine geänderte Elektrospinnen Methode PCL vascular Grafts mit dicken Fasern und große Poren zu fabrizieren, und beschreiben ein Protokoll, um die in Vivo -Leistung in einem Rattenmodell der bauchschlagader Ersatz zu bewerten.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um makroporöse PCL Gefäßprothese zu fabrizieren und beschreiben eine Auswertung Protokoll mithilfe von einem Rattenmodell der bauchschlagader Ersatz. Die Electrospun vascular Grafts besitzen oft relativ kleine Poren, die Zelle eindringen in die Transplantate zu begrenzen und behindert die Regeneration und Remodellierung der Neo-Arterien. In dieser Studie wurden PCL vascular Grafts mit dickeren Fasern (5 – 6 µm) und größere Poren (~ 30 µm) mit einer modifizierten Verarbeitungstechnik hergestellt. Das Langzeitverhalten des Transplantats wurde durch die Implantation in einem Rattenmodell Bauchaorta bewertet. Ultraschall-Analyse zeigte, dass die Transplantate patent ohne Aneurysma oder Stenose auch nach 12 Monaten der Implantation auftreten blieb. Makroporösen Struktur verbessert die Zelle Einwachsen und so gefördert Gewebe regeneriert nach 3 Monaten. Noch wichtiger ist, gab es keine Anzeichen von nachteiligen Umbau, z. B. Verkalkungen innerhalb der Transplantat Wand nach 12 Monaten. Electrospun PCL vascular Grafts mit modifizierten makroporösen Verarbeitung halten Sie daher, mögliche eine Arterie Ersatz für langfristige Implantation.

Einleitung

Vaskuläre Transplantate aus synthetischen Polymeren hergestellt werden allgemein in Klinik für die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) eingesetzt. Leider, bei kleinem Durchmesser vascular Grafts (D < 6 mm) gibt es keine erfolgreiche Produkte aufgrund der niedrigen Durchgängigkeit, ausgelöst durch reduzierte Blut Strömungsgeschwindigkeit, führt oft zu Thrombose und der Intima-Hyperplasie Komplikationen-¹.

Gewebe-Engineering bietet eine alternative Strategie zur langfristigen Durchgängigkeit und Homöostase basierend auf einem Gerüst-geführte vaskuläre Regeneration und Wiederaufbau zu realisieren. Im Detail, die Gefäßprothese als dreidimensionale Vorlage könnte bieten mechanische Unterstützung und strukturelle Führung während der Regeneration der Aderhaut und Einfluss zelluläre Funktionen, einschließlich der Zelladhäsion, Migration, Verbreitung, und Sekretion der extrazellulären Matrix². Bisher wurden verschiedene synthetische Polymere für Anwendungen in der Aderhaut Technik bewertet. Unter dieser Polymere ist poly(ε-caprolactone) (PCL) Aufgrund guter Handy-Kompatibilität und langsamer Abbau von mehreren Monaten bis hin zu zwei Jahren³intensiv untersucht worden. In einer Ratte Aorta Modell^4,5,6, PCL vaskulären Transplantate durch Elektrospinnen verarbeitet ausgestellt hervorragende strukturelle Integrität und Durchgängigkeit, sowie möglichst kontinuierlich erhöhten ZELLINVASION und Neovaskularisation in der Transplantat Wand für bis zu 6 Monaten. Jedoch unerwünschte Gewebe Umbau, einschließlich Regression von Zellen und Kapillaren und Verkalkung, auch beobachtet an längeren Zeitpunkten bis zu 18 Monaten.

Cellularization von der Gefäßprothese ist ein Schlüsselfaktor Bestimmung der Geweberegeneration und⁷umformt. Elektrospinnen, wurde als eine vielseitige Technik allgemein für die Zubereitung von vaskulären Grafts mit Nano-faserige Struktur⁸eingesetzt. Leider führt die relativ kleine Porenstruktur oft zu unzureichend Zelle eindringen in die Electrospun Gefäßprothese, die die nachfolgenden Geweberegeneration begrenzt. Um dieses Problem zu beheben, haben verschiedene Techniken versucht, Erhöhung der Porengröße und insgesamt Porosität, einschließlich das Salz/Polymer Auslaugung^9,10, Änderung der Kollektor Apparat, Nachbehandlung durch Laserstrahlung¹¹ , etc.. In der Tat ist die Struktur der Electrospun Transplantate (einschließlich Faserdurchmesser, Porengröße und Porosität) in engem Zusammenhang mit der Verarbeitung Bedingungen^12,13. Während Elektrospinnen kann der Faserdurchmesser leicht durch Veränderung der Parameter, wie die Konzentration der Polymerlösung, Durchfluss, Spannung, usw.gesteuert werden. ^{14 , 15}, und daher haben die Porengröße und Porosität entsprechend erhöht worden.

Wir berichteten vor kurzem eine modifizierte PCL Electrospun Transplantat mit makroporösen Struktur (Fasern mit Durchmesser von 5 bis 7 µm und Poren von 30-40 µm). In Vivo Implantation durch den Ersatz der bauchschlagader Ratte zeigten hohe Rate der Durchgängigkeit, sowie gute Endothelialization und glatten Muskulatur Regeneration bei 3 Monate nach der Operation¹⁶. Noch wichtiger ist, konnte keine negativen Gewebe Umbau einschließlich Verkalkung und Zelle Regression auch nach einem Jahr der Implantation beobachtet werden.

Protokoll

Die Verwendung von Versuchstieren wurde genehmigt durch das Tier Experimente ethischen Ausschuss der Nankai-Universität und durchgeführt in Übereinstimmung mit der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren.

(1) die Herstellung von Electrospun PCL Grafts

Hinweis: Hier wurde eine Elektrospinnen-Technik eingesetzt, um vaskuläre Transplantate zu fabrizieren.

1. PCL-Lösungen von 25 Gew.-% bis 10 Gew.-%, durch Auflösen von PCL in einer Mischung aus Methanol und Chloroform, bzw. vorbereiten (1:5-Volumen-Verhältnis), bei Raumtemperatur (RT) für 12 h.
2. Laden Sie die PCL-Lösung in ein 10 mL Glasspritze.
3. Legen Sie die Spritze mit einer 21-G-Nadel.
4. Die Sammlung Instrument den Edelstahl-Dorn (2 mm Durchmesser, 25 cm Länge) auflegen.
5. Für dickere Fasern Transplantate zu verwenden, die PCL-Lösung von 25 Gew.-%, Arbeitsabstand von 17 cm von der Spitze der Nadel an Sammler, Durchfluss von 8 mL/h, und Spannung von 11 kV als die Elektrospinnen Parameter. Für dünnere Faser Transplantate, verwenden die PCL-Lösung von 10 Gew.-%, Arbeitsabstand von 20 cm von der Nadelspitze an Sammler, einer Durchflussmenge von 2 mL/h, und Spannung von 18 kV als die Elektrospinnen Parameter.
6. Sicherstellen Sie, dass die gewonnenen Grafts im Vakuum über Nacht, das restliche Lösungsmittel entfernen platziert sind. Alle Instrumente vor dem Eingriff zu sterilisieren und aseptischen Technik im gesamten pflegen.
7. Desinfizieren Sie vor der Implantation die Transplantate durch Eintauchen in 10 mL von 75 % Ethanol für 30 min und sie dann über Nacht mit UV-Licht aussetzen.
8. Faser und Pore größenmessungen: Berechnung der durchschnittlichen Faserdurchmesser mit ImageJ-Software basierend auf Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bilder scannen.
9. Mechanische Prüfung von Gerüsten:
   1. Geschnitten Sie die röhrenförmigen Gerüste in Abschnitte 3 mm in der Länge mit einer Rasierklinge. Messen Sie die Stärke von Gerüsten mit einem Mikrometer.
   2. Legen Sie die röhrenförmigen Gerüste auf einem Zugversuch Rechner mit einer Tragfähigkeit von 100 N.
   3. Klemmen Sie die Gerüste mit einer 1 mm zwischen Klemme Distanz und ziehen längs mit einer Rate von 10 mm/min bis zum Bruch. Messen Sie die Zugfestigkeit und Bruchdehnung ultimative. Berechnen des Elastizitätsmoduls aus der ersten linearen Region (bis zu 5 % Dehnung) der Spannungs-Dehnungs-Kurve.

(2) Bauchaorta Implantation Rattenmodell

Hinweis: Alle Materialien und Instrumente in der Chirurgie sind steril. Während der Operation stellen Sie sicher, dass der Betreiber trägt eine Gaze Maske und sterile Handschuhe um Infektionen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Raumtemperatur bei 27-30 ° C, die tierischen Körper Temperatur gehalten wird. Richtlinien Sie lokale IACUC zur Analgesie.

1. Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 240-270 g als Empfänger der Gefäßprothese. Stellen Sie sicher, dass die Ratte 24 h vor der Operation gefastet hat. Die fastenden Ratten für 24 h soll leer der Kot im Darm-Trakt ausreichend, damit der Bediener Horizont erweitern.
2. Die Ratte in den Nacken fassen und halten Sie ihren Kopf nach unten, Springe Nadel in die Bauchhöhle des Unterleibs. Induzieren Sie die Ratte für die Anästhesie mit Chloral Hydrate (330 mg/kg) durch eine intraperitoneale Injektion.
3. Bestätigen Sie angemessene Anesthetization, indem sichergestellt wird, dass die Ratte Muskeln und stetige Atmung entspannt hat. Legen Sie die Ratte unter dem Operationsmikroskop in Rückenlage.
4. Gelten Sie Vaseline Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf die Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Antikoagulation (100 UI/kg) Rute Vene Injektion vor der Operation mit heparinisierten physiologischer Kochsalzlösung (50 UI/mL) verwalten.
5. Das Fell in der vorderen Bauchwand mit einer Rasierklinge rasieren Sie ab, und reinigen Sie die Haut mit Jod-Lösung und medizinischem Alkohollösung.
6. Führen Sie einen Mittellinie Laparotomie Schnitt mit chirurgische Scheren und sorgen dafür, dass der Schnitt ca. 4-5 cm lang ist und dann setzen die Bauchhöhle.
7. Einfahren Sie und wickeln Sie den Darm mit Gaze bevorzugt mit Salzlösung befeuchtet.
8. Die Bauchaorta sorgfältig zu sezieren.
9. Identifizieren Sie und verbinden Sie alle kleine Äste mit 9-0 Monofilament Nylon Nähte.
10. Klemmen Sie den isolierten Abschnitt (bis zu 1 cm Länge) der Aorta mit zwei vaskulären Schellen. Die Aorta kann eingespannten für 20-30 Minuten bleiben.
11. Transekt bauchschlagader zwischen zwei Klemmen mit Mikro-Schere, um die Anastomosen Websites zu erstellen.
12. Spülen Sie die beiden Enden der Aorta mit heparinisierten Kochsalzlösung (50 UI/mL) um das restliche Blut zu entfernen.
13. Die Adventitia mit Mikro-Schere abziehen.
14. Anastomosieren Sie das Transplantat mit 2 mm Innendurchmesser und 1 cm in der Länge, die Ratte bauchschlagader mit einem 8er-Naht-Muster mit 9-0 Monofilament Nylon Nähte.
15. Zuerst konstruieren Sie vier Anastomosen entsprechend der Reihenfolge der 9, 3, 12 und 06:00-Positionen an der proximalen Seite zu, dann anastomosieren Sie die Schnittkanten in 4 Maschen zwischen zwei Nähte. Nach Beendigung der proximalen Naht, Naht der distalen Seite nach der gleichen Methode.
    Hinweis: Jeder Stich ist erforderlich, um sicherzustellen, dass die systemeigene Seite leicht in das Transplantat eingebettet ist.
16. Die distalen Klammer um das Blut zu fließen in das Transplantat zu ermöglichen, dann entfernen Sie die proximale Klemme.
17. Drücken Sie die Fadenenden zu stoppen die Blutung ein steriler Wattebausch oder einem kleinen Gaze Schwamm. Drücken Sie für ca. 3 min bis Blutstillung.
18. Den Darm in die Bauchhöhle zurück.
19. Spülen Sie die Bauchhöhle mit warmer physiologischer Kochsalzlösung mit Gentamicin (320 U/mL).
20. Die Bauchdecke mit einer 3: 0-Nylon-Naht in der Muskeln und Haut Schicht bzw. vernähen.
21. Die Ratte in einem sauberen und trockenen Käfig legen Sie und ein Heizkissen unter den Käfig zu tierischen Körpertemperatur aufrechtzuerhalten; dann warten Sie, bis die Ratte aus der Narkose zu erholen. Kümmern Sie sich um das Tier, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.
22. Nachdem er das Bewusstsein wiedererlangt, setzen Sie die Ratte in einem einzigen Käfig mit Futter und Wasser. Gelten Sie Jod auf die Wunde zur Vorbeugung von Infektionen nach der Operation. Die Ratte, die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig erholt hat.
23. Ratten nach institutionellen Richtlinien zu vorgegebenen Zeitpunkten einschläfern.

Ergebnisse

Die PCL-Transplantate wurden auf 3 Monate und 12 Monate postoperativ explantiert und analysiert durch histologische Standardtechniken für Hämatoxylin und Eosin (H & E), Masson trichrome, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa und Immunfluoreszenz-Färbung für α-SMA, MYH, vWF und Elastin. Die histologische Bilder wurden mit einem aufrechten Mikroskop und die Immunfluoreszenz-Bilder wurden mit einem Fluoreszenzpräparate Mikroskop.

Diskussion

Zelle Infiltration ist entscheidend für die Erneuerung und Umbau der Gefäßprothese in Vivo¹⁶. Begrenzte Zelle eindringen bezieht sich oft auf die relativ kleinen Poren des Transplantats, die die Migration von Zellen in der Transplantat Wand behindern. Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir eine modifizierte Methode um Electrospun PCL vascular Grafts mit großen Porenstruktur vorzubereiten. Im einzelnen stiegen die Porengröße mit der Zunahme der Dicke Faser, die leicht von den...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000)	Sigma	704067
Methanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alcohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sucrose	Tianjin Fengchuan Company	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley rats	Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normal saline	Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloral hydrate	Tianjin Ruijinte chemical company	2223
Heparin sodium Injection	Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamycin Sulfate Injection	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody	Abcam	ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody	Abcam	ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody	Abcam	ab23748
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody	Abcam	ab6994
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normal goat serum	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxylin and eosin (H&E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Masson's trichrome	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	G3002b
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	H901