השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה electrospinning ששונה כדי להמציא PCL שתלי כלי הדם עם נקבוביות גדולות וסיבים עבים, לתאר את פרוטוקול כדי להעריך את הביצועים ויוו במודל של עכברים של החלפת העורק הראשי.

Abstract

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק macroporous PCL שתל וסקולרית. ומתארות פרוטוקול הערכה באמצעות מודל עכברוש של החלפת העורק הראשי. השתלים כלי הדם electrospun לעיתים קרובות בעלי נקבוביות קטנות יחסית, אשר להגביל חדירה לתא השתלים ומעכבים את ההתחדשות ובניה של הניאו-העורקים. במחקר זה, PCL שתלי כלי הדם עם סיבי עבה יותר (5-6 מיקרומטר), נקבוביות גדולות יותר (~ 30 מיקרומטר) היו מפוברק באמצעות טכניקה לעיבוד ששונה. ביצועים לטווח ארוך של השתל הוערך על ידי ההשרשה במודל חולדה. העורק הראשי. אולטראסאונד הראה כי השתלים נותר פטנט ללא מפרצת או היצרות המתרחשים גם לאחר 12 חודשים של השרשה. Macroporous מבנה משופרת של ingrowth תא וקידם ובכך רקמות מחדש בגיל 3 חודשים. חשוב מכך, לא היה סימן של שיפוץ תופעות לוואי, כגון הסתיידות בתוך הקיר שתל לאחר 12 חודשים. לכן, electrospun PCL שתלי כלי דם עם macroporous ששונה עיבוד החזק פוטנציאל להיות תחליף עורק להשתלה לטווח ארוך.

Introduction

שתלי כלי הדם מחומרים פולימרים סינתטיים מנוצלים נרחב במרפאה לטיפול במחלות לב וכלי דם (CVDs). למרבה הצער, במקרה של השתלים דם בקוטר קטן (D < 6 מ מ) יש מוצרים מוצלחים זמינים עקב נמוך patency מופעלות על ידי מהירות זרימת דם מופחתת, אשר מובילה לעיתים קרובות פקקת, היפרפלזיה intimal, ועוד סיבוכים¹.

הנדסת רקמות מספק אסטרטגיית חלופיים כדי להבין patency לטווח ארוך, הומאוסטזיס מבוסס על התחדשות נימי הדם מונחה לגרדום שחזור. בפירוט, השתל וסקולרית, כתבנית תלת מימדי, יכול לספק תמיכה מכנית והדרכה מבניים במהלך לרגנרציה של רקמות עילאיים ועל ההשפעה פונקציות הסלולר, כולל תא אדהזיה, הגירה, התפשטות, ו הפרשת מטריצה חוץ-תאית². עד עכשיו, פולימרים סינתטיים שונים תאימותם ליישומים בהנדסת רקמות עילאיים. בין אלה פולימרים, poly(ε-caprolactone) (PCL) נחקר באינטנסיביות עקב תא טוב תאימות והשפלה איטי שנעו בין כמה חודשים עד שנתיים³. בעכברוש העורקים מודל^4,5,6, שתלי כלי הדם PCL שעובדו על-ידי electrospinning הציג המבנית מעולה, patency, עלייה מתמדת כמו גם תא הפלישה, כורוידאלית ב שתל קיר עד 6 חודשים. עם זאת, רקמות לוואי שיפוץ, כולל רגרסיה של תאים, נימים, הסתיידות, גם נצפו ב timepoints יותר, עד ל-18 חודשי.

Cellularization של כלי הדם השתל היא גורם מפתח בקביעת התחדשות רקמות, ותתמוך⁷. Electrospinning, כמו טכניקה רב-תכליתי, כבר נרחב מועסקים עבור הכנת שתלי כלי הדם עם מבנה סיבי ננו⁸. למרבה הצער, המבנה הנקבובית קטן יחסית מובילה לעיתים קרובות לא מספיקות תא בחדירת השתל electrospun כלי דם, אשר מגביל את התחדשות רקמות עוקבות. כדי לפתור בעיה זו, טכניקות שונות נוסו כדי להגדיל את גודל הנקבוביות נקבוביות הכוללת, לרבות המלח/הפולימר שטיפת^9,10, שינוי של אספן המנגנון, שלאחר הטיפול על ידי קרינת לייזר¹¹ , ועוד. למעשה, המבנה של שתלי electrospun (כולל סיבים בקוטר גודל הנקבוביות, נקבוביות) קשורה קשר הדוק עיבוד התנאים^12,13. במהלך electrospinning, קוטר סיבים ניתן לשלוט בקלות על-ידי שינוי הפרמטרים, כגון הריכוז של פולימר פתרון, קצב הזרימה, מתח, וכו '. ^{14 , 15}, ו. לכן, גודל הנקבוביות ואת נקבוביות שופרו בהתאם.

לאחרונה דיווחנו PCL ששונה electrospun שתל למבנה macroporous (סיבי עם קוטר של 5-7 מיקרומטר, הנקבוביות של 30-40 µm). In vivo השרשה על-ידי החלפת עכברוש. העורק הראו שיעור גבוה של patency, כמו גם התחדשות endothelialization, שריר חלק טוב בגיל 3 חודשים לאחר הניתוח¹⁶. וחשוב מכך, אין תופעות לוואי רקמות כולל רגרסיה הסתיידות והתא יכול להיות שנצפו גם לאחר שנה אחת של השרשה.

Protocol

השימוש של חיות ניסוי שאושרו על-ידי חיה ניסויים אתית הוועדה של שינקאנסן האוניברסיטה, ביצעו תואם המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה.

1. ייצור שתלי Electrospun PCL

הערה: בזאת, טכניקת electrospinning היה מנוצל כדי לבדות שתלי כלי הדם.

1. להכין PCL פתרונות של 25 wt % ו 10 wt %, על ידי המסת PCL בתערובת של מתנול, כלורופורם, בהתאמה, (יחס נפח של 1:5), בטמפרטורת החדר (RT) במשך 12 שעות.
2. לטעון את הפתרון PCL לתוך מזרק זכוכית 10-mL.
3. מקם את המזרק עם מחט 21-G.
4. מניחים את מוט פלדה אל חלד (2 מ מ בקוטר 25 ס מ אורך) על המכשיר אוסף.
5. עבור שתלים סיבי עבה יותר, השתמש PCL הפתרון של 25 wt %, ומרחק עבודה של 17 ס מ מחט לאספן, קצב הזרימה של 8 mL/h, מתח של 11 kV כפרמטרים electrospinning. לשימוש שתלי רזה-סיבים, הפתרון PCL של 10 wt %, ומרחק עבודה של 20 ס מ מחט לאספן, קצב זרימה של 2 מ ל/h, מתח של 18 kV כפרמטרים electrospinning.
6. ודא כי השתלים שהושג מוצבים בתוך ואקום למשך הלילה כדי להסיר שאריות הממס. לעקר את כל הכלים לפני ההליך ולשמור על הטכניקה aseptic ברחבי.
7. לפני ההשתלה, לחטא את השתלים על ידי אנו ממליצים להם 10 מ"ל של 75% אתנול למשך 30 דקות ואז לחשוף אותם לאור אולטרא סגול לילה.
8. מדידות גודל סיבים, נקבוביות: לחשב את הקוטר הממוצע סיבים באמצעות תוכנת ImageJ מבוסס על סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).
9. בדיקות מכניות של פיגומים:
   1. חותכים פיגומים צינורי למקטעים 3 מ מ אורך בעזרת סכין גילוח. למדוד את העובי של פיגומים באמצעות מיקרומטר.
   2. למקם פיגומים הכרישים על מכונת בדיקות מתיחה עם עומס קיבולת של 100 ש
   3. מלחציים פיגומים עם 1 מ"מ הבין-קלאמפ מרחק, למשוך longitudinally בקצב של 10 מ מ/דקה עד קרע. למדוד את חוזק ואת האולטימטיבי התארכות בהפסקה. לחשב את האלסטיות של האזור הליניארי הראשונית (עד 5% זן) של העקומה מתח-זן.

2. עכברוש. העורק השרשה מודל

הערה: כל חומרים, כלים המשמשים בניתוח הם סטרילי. במהלך הניתוח, ודא כי המפעיל לובש מסכה גזה וכפפות סטרילי למניעת זיהומים. ודא שטמפרטורת החדר נשמרת ב- 27-30 ° C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בבעלי חיים. פעל לפי ההנחיות IACUC המקומית בנוגע שיכוך כאבים.

1. השתמש חולדות ספראג Dawley זכר שוקל 240-270 גרם מקבלים שתל של כלי הדם. ודא שהחולדה יש התענה 24 שעות לפני הניתוח. המטרה של חולדות צום של 24 שעות היא ריקה הצואה של המעיים מספיק, ובכך להרחיב האופק של המפעיל.
2. לתפוס הצוואר האחורי של החולדה, הראש כלפי מטה, את המחט springe לתוך חלל הבטן הבטן התחתונה. זירוז של עכברוש בשביל הרדמה עם קלוראל-הידרייט (330 מ ג/ק ג) על ידי זריקה בקרום הבטן.
3. לאשר ההרדמה נאותה על ידי הבטחת העכברוש הגמיש השרירים ונשימה יציבה. מקם את החולדה תחת המיקרוסקופ ההפעלה במצב פרקדן.
4. החל וזלין הוטרינר אופטלמולוגיות משחה על העיניים למניעת יובש תחת הרדמה. לנהל בדיקות דם (UI 100/kg) עם תמיסת מלח פיזיולוגית heparinized פתרון (UI 50/mL) בזריקה וריד הזנב לפני הניתוח.
5. לגלח את הפרווה בקיר הבטן הקדמי באמצעות סכין גילוח, לנקות את העור באמצעות יודיפלור תמיסה תמיסת כוהל רפואי.
6. לבצע חתך laparotomy קו האמצע עם מספריים כירורגיים להבטיח החתך כ 4-5 ס"מ ו ואז לחשוף את חלל הבטן.
7. . משכי, עוטפים את המעיים עם גזה לחלח עם תמיסת מעדיפים.
8. לנתח את העורק הראשי בקפידה.
9. לזהות, מאתרים ומפסיקים את כל הענפים קטן בעזרת תפרים ניילון monofilament 9-0.
10. תהדק את המקטע מבודד (עד 1 ס מ אורך) של אבי העורקים באמצעות שני תופסנים כלי הדם. אבי העורקים יכולים להישאר בחוזקה למשך 20-30 דקות.
11. Transect העורק הראשי בין שני תופסנים באמצעות מיקרו-מספריים כדי ליצור את האתרים anastomotic.
12. לרוקן את שני הקצוות של אבי העורקים באמצעות פתרון heparinized מלוחים (UI 50/mL) כדי להסיר את שאריות הדם.
13. לקלף את adventitia באמצעות מיקרו-מספריים.
14. Anastomose השתל ועם הקוטר הפנימי של 2 מ מ 1 ס"מ אורך על העורק הראשי של החולדה עם דפוס התפר של-שמונה בעזרת תפרים ניילון monofilament 9-0.
15. ראשית, לבנות ארבע. חיבור בהתאם לרצף של 9, 3, 12, ו 6 o ' שעון עמדות על הצד צינתור, ואז anastomose את הקצוות לחתוך 4 תפרים בין שני תפרים. לאחר שסיים את התפר צינתור, תפר הצד דיסטלי באותה שיטה.
    הערה: כל תפר נדרש כדי להבטיח שהצד יליד מעט שמוטבע השתל.
16. להסיר את המלחציים דיסטלי כדי לאפשר את הדם לזרום לתוך השתל ולאחר מכן להסיר את המלחציים הפרוקסימלית.
17. הקש את הקצוות התפר כדי לעצור את הדימום באמצעות כדור צמר גפן סטרילי או ספוג גזה קטנים. הקש על 3 דק ', עד hemostasis.
18. להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.
19. לשטוף את חלל הבטן בעזרת תמיסת מלח פיזיולוגית חמימים פתרון גנטמיצין (320 U/mL).
20. לתפור לקיר הבטן באמצעות ניילון 3-0 בתפר לשכבת השריר והעור, בהתאמה.
21. למקם את החולדה לתוך כלוב נקי ויבש, לשים כרית החימום תחת הכלוב כדי לשמור על טמפרטורת הגוף החי; ואז לחכות החולדה להתאושש מן ההרדמה. לטפל החיה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
22. אחרי זה יחזור להכרה, לשים את החולדה לכלוב יחיד עם מים ואוכל. החל יוד על הפצע כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח. להחזיר את החולדה מחברתם של חיות אחרות עד זה יחלים במלואו.
23. המתת חסד חולדות בהתאם להנחיות מוסדיים בנקודות זמן מוגדרים מראש.

תוצאות

השתלים PCL היו explanted ב 3 חודשים ל- 12 חודשים וכאב לאחר הניתוח, נותחו על ידי טכניקות היסטולוגית סטנדרטי עבור hematoxylin ואאוזין (H & E), מאסון trichrome, Verhoeff-ואן Gieson (VVG), פון Kossa ו- immunofluorescence מכתים עבור α-SMA, MYH, vWF ואלסטין. היסטולוגית התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ זקוף, immunofluorescence התמונות צו...

Discussion

חדירה לתא הוא קריטי עבור ההתחדשות, שיפוץ של שתל וסקולרית ויוו¹⁶. חדירה לתא מוגבל קשורה לעיתים קרובות הנקבוביות קטן יחסית של השתל המעכבים את ההעברה של תאים לתוך הקיר שתל. כדי לטפל הקושי הזה, פיתחנו שיטה שונה להכין electrospun PCL שתלי כלי הדם עם מבנה גדול שם. בפירוט, גודל הנקבוביות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000)	Sigma	704067
Methanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alcohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sucrose	Tianjin Fengchuan Company	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley rats	Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normal saline	Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloral hydrate	Tianjin Ruijinte chemical company	2223
Heparin sodium Injection	Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamycin Sulfate Injection	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody	Abcam	ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody	Abcam	ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody	Abcam	ab23748
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody	Abcam	ab6994
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normal goat serum	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxylin and eosin (H&E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Masson's trichrome	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	G3002b
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	H901