Implantation des greffons vasculaires électrofilées avec Structure optimisée dans un modèle de Rat

Résumé

Nous présentons ici une méthode électrofilage modifiés pour fabriquer des prothèses vasculaires PCL avec fibres épaisses et des pores dilatés et décrire un protocole d’évaluation du rendement en vivo dans un modèle de rat de remplacement de l’aorte abdominale.

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour fabriquer la prothèse vasculaire macroporeux PCL et décrire un protocole d’évaluation en utilisant un modèle de rat de remplacement de l’aorte abdominale. Les greffons vasculaires électrofilées possèdent souvent relativement petits pores, limitent l’infiltration cellulaire dans les greffes, qui entravent la régénération et le remodelage des neo-artères. Dans cette étude, greffes vasculaires PCL avec fibres plus épaisses (5-6 µm) et de plus grands pores (~ 30 µm) ont été fabriqués en utilisant une technique de traitement modifié. La performance à long terme du greffon a été évaluée par l’implantation dans un modèle d’aorte abdominale chez le rat. Analyse de l’échographie a montré que les greffons restent brevets sans anévrisme ou sténose survenant même après 12 mois d’implantation. Structure macroporeuse amélioré la croissance cellulaire et donc promu tissu régénéré à 3 mois. Plus important encore, il n’y avait aucun signe de remodelage indésirables, tels que la calcification dans la paroi de la prothèse après 12 mois. Donc, les prothèses vasculaires électrofilées PCL avec macroporeux mis à jour le traitement tenir potentiels comme un substitut de l’artère pour l’implantation à long terme.

Introduction

Des greffons vasculaires constitués de polymères synthétiques sont largement utilisés en clinique pour le traitement des maladies cardiovasculaires (maladies cardiovasculaires). Malheureusement, dans le cas de prothèses vasculaires de petit diamètre (D < 6 mm) il n’existe aucun produit avec succès en raison de la faible perméabilité déclenchée par la vitesse d’écoulement sanguin réduit, qui conduit souvent à la thrombose, l’hyperplasie intimale et d’autres les complications¹.

Génie tissulaire fournit une autre stratégie afin de réaliser la perméabilité à long terme et l’homéostasie basé sur un échafaud guidée vasculaire régénération et reconstruction. Dans le détail, la prothèse vasculaire, comme un modèle en trois dimensions, pourrait fournir support mécanique et structurelle conseils pendant la régénération des tissus vasculaires et l’influence des fonctions cellulaires, y compris l’adhésion cellulaire, migration, prolifération, et sécrétion de la matrice extracellulaire². Jusqu'à présent, divers polymères synthétiques ont été évalués pour des applications dans l’ingénierie des tissus vasculaires. Parmi ces polymères, poly(ε-caprolactone) (PCL) a été intensivement étudiée en raison de la cellule bonne compatibilité et de la lente dégradation allant de plusieurs mois à deux ans³. Un rat aorte modèle^4,5,6, greffes vasculaires PCL traitées par électrofilage exposées excellente intégrité structurale et perméabilité, invasion des cellules aussi bien que sans cesse accrue et une néovascularisation dans le paroi de la prothèse pendant 6 mois. Cependant, transformant tissus indésirables, y compris la régression des cellules et les capillaires et les calcifications, a également observé à des intervalles plus longs, jusqu'à à 18 mois.

Cellularisation du greffon vasculaire est un facteur clé déterminant la régénération tissulaire et remaniement⁷. Électrofilage, comme une technique polyvalente, a été largement employé pour la préparation des greffons vasculaires avec structure fibreuse-nano⁸. Malheureusement, la structure de pore relativement faible entraîne souvent une infiltration cellulaire insuffisante dans la prothèse vasculaire électrofilées, qui limite la régénération des tissus ultérieures. Pour résoudre ce problème, diverses techniques ont tenté d’augmenter la taille des pores et porosité globale, y compris le sel/polymère lessivage^9,10, modification des appareils de collecteur, après le traitement par rayonnement laser¹¹ , etc.. En fait, la structure des greffes d’électrofilées (y compris les fibres diamètre, la taille des pores et porosité) est étroitement liée à la transformation des conditions^12,13. Pendant électrofilage, le diamètre de la fibre peut être facilement contrôlé en changeant les paramètres, tels que la concentration de la solution de polymère, tension, débit, etc.. ^{14 , 15}, et par conséquent, la taille des pores et porosité ont été améliorées en conséquence.

Nous avons récemment rapporté une greffe d’électrofilées mis à jour le PCL avec structure macroporeuse (fibres de diamètre de 5 à 7 µm et pores de 30 à 40 µm). In vivo l’implantation en remplaçant l’aorte abdominale de rat a montré un taux élevé de perméabilité, ainsi que bonne régénération endothélialisation et muscle lisse à 3 mois post-opératoire¹⁶. Plus important encore, aucun tissu indésirable remodelage dont la régression de la calcification et cellule n’on observe même après un an de l’implantation.

Protocole

L’utilisation des animaux d’expérimentation a été approuvée par l’Animal expériences éthique Comité de Nankai University et effectuée selon le Guide d’entretien et d’utilisation des animaux de laboratoire.

1. fabrication des greffes électrofilées PCL

NOTE : Ici, une technique d’électrofilage a été utilisée pour fabriquer les prothèses vasculaires.

1. Préparer des solutions PCL de 25 % en poids et 10 % en poids, en dissolvant PCL dans un mélange de méthanol et le chloroforme, respectivement, (rapport de volume 1:5), à température ambiante (RT) pendant 12 h.
2. Chargez la solution PCL dans une seringue en verre de 10 mL.
3. Placer la seringue avec une aiguille de 21 G.
4. Placez le mandrin en acier inox (2 mm de diamètre, 25 cm de longueur) sur l’instrument de collecte.
5. Pour les greffes de fibres plus épaisses, utilisez la solution PCL de 25 % en poids, la distance de travail de 17 cm de la pointe de l’aiguille au collecteur, débit de 8 mL/h et la tension de 11 kV comme paramètres électrofilage. Pour les greffes de diluant-fibre, utiliser la solution PCL de 10 % en poids, distance de travail de 20 cm de l’extrémité de l’aiguille au collecteur, un débit de 2 mL/h et la tension de 18 kV comme paramètres électrofilage.
6. Faire en sorte que les greffons obtenus sont placés dans le vide pendant la nuit pour enlever le solvant résiduel. Stériliser tous les instruments avant la procédure et de maintenir une technique aseptique tout au long.
7. Avant l’implantation, désinfecter les greffons en l’immergeant dans 10 mL d’éthanol 75 % pendant 30 min et ensuite les exposant à la lumière UV durant la nuit.
8. Mesures de taille de fibre et pore : calculer le diamètre de la fibre moyenne à l’aide de logiciels ImageJ basée sur l’analyse des images de microscopie électronique (SEM).
9. Essais mécaniques des échafaudages :
   1. Couper les échafaudages tubulaires en sections de 3 mm de longueur à l’aide d’une lame de rasoir. Mesurer l’épaisseur des échafaudages à l’aide d’un micromètre.
   2. Placer les échafaudages tubulaires sur une machine d’essai de traction avec une capacité de charge de 100 N.
   3. Fixez les échafaudages avec une distance de 1 mm pince inter et tirez longitudinalement à raison de 10 mm/min jusqu'à la rupture. Mesurer la résistance à la traction et l’ultime allongement à la rupture. Calculer le module de Young de la zone linéaire initiale (jusqu'à 5 % de déformation) de la courbe contrainte-déformation.

2. modèle de l’Implantation d’aorte abdominale chez le rat

Remarque : Tous les matériaux et instruments utilisés en chirurgie sont stériles. Pendant l’intervention, assurez-vous que l’opérateur porte un masque de gaze et de gants stériles pour éviter les infections. S’assurer que la température ambiante est maintenue à 27-30 ° C pour maintenir la température du corps animal. Suivez les directives IACUC locales au sujet de l’analgésie.

1. Utiliser des rats Sprague Dawley mâles pesant 240-270 g pour recevoir le greffon vasculaire. S’assurer que le rat a jeûné 24 h avant la chirurgie. Le jeûne des rats pendant 24 h vise à vide les fèces dans le tractus intestinal suffisamment, et ainsi élargir les horizons de l’opérateur.
2. Saisir la base du cou du rat et garder sa tête vers le bas, introduire l’aiguille de springe dans la cavité abdominale du bas-ventre. Induire le rat pour l’anesthésie avec l’hydrate de chloral (330 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
3. Confirmer anesthetization adéquate en veillant à ce que le rat a assoupli les muscles et la respiration régulière. Placez le rat sous le microscope d’opération en position couchée.
4. Appliquer pommade ophtalmique vétérinaire de vaseline sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie. Administrer l’anticoagulation (100 UI/kg) avec une solution physiologique héparinée (50 UI/mL) par injection dans la veine queue avant la chirurgie.
5. Raser la fourrure dans la paroi abdominale antérieure à l’aide d’une lame de rasoir et nettoyer la peau à l’aide de la solution d’iode et de solution d’alcool médical.
6. Effectuer une incision de laparotomie médiane avec des ciseaux chirurgicaux et veiller à ce que l’incision est environ 4-5 cm de long, puis l’exposer la cavité abdominale.
7. Rétracter et envelopper les intestins de gaze imbibé d’une solution saline préférentiellement.
8. Analysez soigneusement l’aorte abdominale.
9. Identifier et ligaturer toutes les petites branches à l’aide de sutures de nylon monofilament 9-0.
10. Fixer la partie isolée (jusqu'à 1 cm de longueur) de l’aorte à l’aide de deux clamps vasculaires. L’aorte peut rester cramponné pendant 20-30 min.
11. Transect de l’aorte abdominale entre deux pinces à l’aide de micro-ciseaux pour créer les sites anastomotiques.
12. Rincer les deux extrémités de l’aorte à l’aide de solution de sérum physiologique hépariné (50 UI/mL) pour enlever les résidus de sang.
13. Décollez de l’adventice à l’aide de micro-ciseaux.
14. Anastomose du greffon avec diamètre intérieur de 2 mm et 1 cm de longueur à l’aorte abdominale du rat avec un motif de huit suture à l’aide de sutures de nylon monofilament 9-0.
15. Tout d’abord, construire des quatre anastomoses selon l’ordre de 9, 3, 12 et 06:00 postes du côté proximal, puis s’anastomosent les bords coupés en 4 points de suture entre deux sutures. Après avoir terminé la suture proximale, suture du côté distal par la même méthode.
    Remarque : Chaque point est nécessaire pour assurer que le côté natif est légèrement incorporé dans la prothèse.
16. Enlever la pince distale pour permettre au sang de circuler dans le greffon, puis ôter la bride proximale.
17. Appuyez sur les extrémités de la suture pour arrêter le saignement à l’aide d’une boule de coton stérile ou un petit tampon de gaze. Appuyez sur pendant environ 3 min, jusqu'à ce que de l’hémostase.
18. Retourner les intestins dans la cavité abdominale.
19. Rincer la cavité abdominale à l’aide de solution physiologique chaud avec gentamicine (320 U/mL).
20. Cousez vers le haut de la paroi abdominale en utilisant une suture de Nylon de 3-0 dans la couche de muscle et de peau, respectivement.
21. Placez le rat dans une cage propre et sec et mettre un coussin chauffant sous la cage pour maintenir la température du corps animal ; puis attendez que le rat récupérer de l’anesthésie. Assister à l’animal jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
22. Après qu’il reprend conscience, mettre le rat dans une cage simple avec la nourriture et l’eau. S’applique à iode sur la plaie pour prévenir l’infection après la chirurgie. Retourner le rat à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’il récupère complètement.
23. Euthanasier des rats selon directives institutionnelles à des moments prédéterminés.

Résultats

Les greffons PCL ont été cultivés à 3 et 12 mois après l’opération et analysés par des techniques histologiques standard pour l’hématoxyline et éosine (H & E), trichrome de Masson, Verhoeff-van Gieson (LCA), Von Kossa et immunofluorescence souillant pour α-SMA, MYH, vWF et l’élastine. Les images histologiques ont été prises à l’aide d’un microscope vertical, et les images d’immunofluorescence ont été prises à l’aide d’un microscope fluorescence.

Discussion

Infiltration de cellules est essentiel pour la régénération et remodelage de la prothèse vasculaire en vivo¹⁶. L’infiltration des cellules est souvent liée à des pores relativement faibles du greffon qui empêchent la migration de cellules dans la paroi de la prothèse. Pour remédier à cette difficulté, nous avons développé une méthode modifiée pour préparer les greffons vasculaires d’électrofilées PCL avec structure de gros pores. Dans le détail, la taille des pores ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000)	Sigma	704067
Methanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alcohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sucrose	Tianjin Fengchuan Company	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley rats	Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normal saline	Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloral hydrate	Tianjin Ruijinte chemical company	2223
Heparin sodium Injection	Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamycin Sulfate Injection	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody	Abcam	ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody	Abcam	ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody	Abcam	ab23748
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody	Abcam	ab6994
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normal goat serum	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxylin and eosin (H&E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Masson's trichrome	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	G3002b
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	H901