Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Özet

Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.

Özet

Laktat ve pyruvate hücre içi enerji metabolik yollar anahtar ara ürün vardır. Hücrelerdeki laktat/pyruvate oranı izleme yaşa bağlı enerji metabolizması mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon ve aerobik glikoliz arasında bir dengesizlik var olup olmadığını belirlemek için yardımcı olur. İşte, model organizma C. elegansticari Renkölçer tahlil kitleri için laktat ve pyruvate kullanımını göstermektedir. Son zamanlarda, duyarlılık ve kolorimetrik/fluorimetric tahlil kitleri doğruluğunu büyük ölçüde araştırma ve geliştirme reaktif üreticileri tarafından yürütülen tarafından geliştirilmiştir. Geliştirilmiş reaktifler C. elegansbir 96-şey plaka ile küçük ölçekli deneyleri kullanımı etkinleştirdiniz. Genel olarak, bir fluorimetric tahlil kolorimetrik bir tahlil için duyarlılık içinde üstündür; Ancak, Renkölçer yaklaşım daha laboratuarında ortak kullanım için uygundur. Başka bir önemli kantitatif tayin için bu deneyleri homojenize C. elegans protein yağış sorundur örnekleri. Bizim protein yağış yöntemindeki ortak precipitants (Örn., trichloroacetic asit, perklorik asit ve metaphosphoric asit) numune hazırlama için kullanılır. Bir tahlil protein ücretsiz örnek doğrudan homojenizasyon sırasında soğuk precipitant (% 5'lik son konsantrasyonu) ekleyerek hazırlanır.

Giriş

Laktat ve pyruvate konsantrasyonları glikoliz, tricarboxylic asit (TCA) ve elektron taşıma zinciri aerobik organizmalar hücrelerdeki Devletleri ile ilgili ve yaygın olarak enerji metabolizmasının ara ürün kabul edilmektedir. Glikoliz reaksiyonları bir dizi okside glikoz pyruvate, metabolik bir kavşakta yatıyor ve karbonhidrat gluconeogenesis, yağ asitleri ve enerji metabolizması acetyl-CoA aracılığıyla aracılığıyla ve amino asit alanin dönüştürülebilir için. TCA döngüsü yeterli çözünmüş oksijen varlığı altında oluşur ve enerji glikoz dönüştürmeye temelini oluşturur. Özellikle, ikincil İLETİMLERİNİZE ilginç bir fenomen glikoliz ağırlıklı olarak enerji üretimi için kullanılır ve TCA döngüsü ve elektron taşıma zinciri içerir, aerobik mitokondrial solunum downregulated memeli kanser hücreleri^1,2. Biz son zamanlarda laktat seviyeleri ve bunun sonucunda laktat/pyruvate (L/P) oranı model organizma Caenorhabditis elegans (C. elegans) yaşlanma sırasında azalma gösterdi. Aynı şekilde, bulduk C. elegans içinde memeli tümör baskılayıcı p53 ortholog CEP-1 yaşa bağlı değişiklikler onun transkripsiyon hedefleri³aktivasyonu ile enerji metabolizmasının önemli bir role sahiptir.

Hücreleri, laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda ölçümü gibi biyolojik deneyleri, hassasiyet, doğruluk, örnek boyutu ve kolorimetrik/fluorimetric tahlil kitleri kuluçka süresi önemli ölçüde yeniden geliştirilmiştir. Teknolojik yenilikler sayesinde artık zor olan kendi küçük boyutları verilen çeşitli metabolitleri ve ara metabolitleri C. elegans, büyük ölçekli kültür olmadan çözümlenecek edebiliyoruz. Genel olarak, Renkölçer Testin duyarlılığı bir büyüklük fluorimetric tahlil küçük olduğunu; Ancak, Renkölçer yaklaşım daha ortak laboratuvarlar ayarında uygundur. Bu yuvarlak solucanlar bir exoskeleton eklenmiş olduğundan Ayrıca, homojenizasyon ve protein yağış içeren bir ayıklama tekniği C. elegans hücreleri laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda kantitatif tayini için çok önemlidir memeli kültürlü hücre hatları^4,5aksine kütikül aradı. Burada, laktat ve pyruvate konsantrasyonları C. elegansörnek çıkarılması için ipuçları da dahil olmak üzere ticari Renkölçer tahlil kitleri kullanarak çözümlemek için bir protokol açıklayın.

Protokol

1. C. elegans eşitlenmiş kültürü

1. Tohum önce kültür Escherichia coli (e.coli) süzün OP50 gecede Luria-Bertani (LB) et suyu sıvı orta 300 ml 37 ° C'de. -4 ° C'de kültürlü OP50 depolamak
   1. LB suyu sıvı orta yapmak için tryptone 10 g, 5 g, maya özü, NaCl 10 g ve 1 N NaOH 1,5 mL kullanıp için 1 L deiyonize su ile ekleyebilirsiniz. Basınçlı kap.
      Not: OP50 ve C. elegans suşları Caenorhabditis genetik Merkezi'nden (Minnesota Üniversitesi, St. Paul, MN, ABD) alınabilir.
2. Nematot büyüme orta (NGM) agar yapmak, NaCl, 3 g, pepton 2.5 g, agar 17 g ve 975 mL deiyonize su kullanın. Basınçlı kap. 55 ° c, sonra sterilely serin eklemek, sipariş, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 mL 1 M CaCl₂, 5 mg/mL kolesterol alkol ve içinde 1 M potasyum fosfat pH 6.0 90 25 mL 1 mL-mm Petri yemekler.
   1. 1 M potasyum fosfat pH 6.0, KH₂PO₄ 108.3 g ve K₂HPO₄46.6 g kullanın ve deiyonize su 1 L. otoklav⁶' ya eklemek.
3. 1-2 mL NGM agar plakaları kültürlü OP50 yayıldı. İnce bir tabaka halinde OP50 yapmak için herhangi bir nematodlar eklemeden önce gecede, oda sıcaklığında plakaları kuluçkaya.
   Not: aşısını OP50 oda sıcaklığında 2-3 hafta boyunca saklanabilir NGM agar tabakları.
4. En az 100 solucanlar OP50 ve kültüre sahip bir NGM agar plaka üzerine 20 ° C'de yetişkin sahne kadar ekleyin. En az üç tabak gereklidir.
5. Yumurta rahim içindetoplamak için aktarım üzerinden üç NGM agar pilakalar ve her 5 mL de bir 15 mL konik tüp arabellekte S gravid Hünsa ve solucanlar 3 kez 300 x g 30 de Santrifüjü kullanarak S arabellek 15 mL ile yıkayın s, oda sıcaklığında.
   1. S arabellek, NaCl 5.9 g ve 1 M potasyum fosfat pH 6.0 50 mL kullanın yapmak için 1 L deiyonize su ile ekleyin. Otoklav⁶.
6. Axenization için bir alkali hipoklorit çözüm de solucan dağıtılması ve toplu yumurta yalıtım (0.5 mL taze çamaşır suyu veya eşdeğeri: % 5-6 sodyum hipoklorit, 10 M NaOH, S arabellek yaklaşık 4.5 mL 0.1 mL)⁶, ve çözüm için 10-15 dk stand ters çevirme tarafından karıştırma ile Oda sıcaklığında.
   Not: 15 dk içinde yetişkin solucanlar, puslu bir çözüm (kurtarılmış yumurta stereoskopik mikroskop kullanarak onaylanması) onların leşleri kurtarılmış yumurta bırakarak dağıtılması. 10 N NaOH 0,1 mL yerine 5 N NaOH 0.2 mL de kullanılabilir.
7. Hipoklorit tedaviden sonra 3 kez ile S arabellek 15 mL yumurta Pelet yıkama ve 5-6 mL S arabellek resuspend. L1 sahne larva yaş zaman uyumlu bir kültür için E. coli olmadan S arabellekte 20 ° C'de gecede bir kuluçka sırasında serbest bırakılan yumurtalar çatlar.
8. L1 sahne larvaları yaklaşık sayısını belirlemek için en az 3 kez larvalar resuspending sonra S arabellek 10 µL içinde bir stereoskopik mikroskop kullanarak solucanlar saymak ve ortalamasını hesaplamak. O zaman, beş NGM ağar kaplamalar (1500-3000 solucanlar başına 90 mm Petri kabına kullanarak plaka) OP50 ile L1 sahne larva transfer ve onlar-si olmak büyümek Genç Yetişkin Sahne Alanı'na, self-fertilization başlar ve birkaç yumurta (normalde 3 d sonra koyulur kadar 20 ° C'de kültür ays).

2. C. elegans üzerinden hücresel kesir çıkarımı

1. Genç Yetişkin Sahne (5 bayat hayvanlar) beş NGM ağar kaplamalar S arabelleği (Şekil 1A) ile gelen solucanlar toplamak.
   1. Sadece yaşayan solucanlar için %30 (w/v) sükroz flotasyon sükroz Yöntem⁶ kullanarak seçmek için 3-4 ml S arabellek buz gibi %60 (w/v) sükroz 15 mL konik tüp içinde eşit bir birimdeki askıya solucanlar karıştırın. Tüp 1.500 x g 15 de spin s 4 ° C ve kayan kaldır Pasteur pipet ile tüp duvarından taşıyarak taze bir tüp solucanlar.
2. Santrifüjü 1.500 x g 30, tarafından 3 kez ile S arabellek solucanlar yıkama s 4 ° C'de Islak hacim yıkanmış Worms 1.000 µL micropipette ucu (Şekil 1B) kullanarak Santrifüjü sonra kontrol edin.
3. Yıkanmış solucanlar buz gibi % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA; % 5'lik son konsantrasyonu) eşit bir birime protein yağış (Şekil 1 c) ekleyin. Perklorik asit (PCA) veya metaphosphoric asit TCA yerine kullanılabilir.
4. Solucanlar döndürme 1300 rpm buzda bir havaneli ile 40 vuruş bir Teflon homogenizer (Potter-Elvehjem doku değirmeni) kullanarak precipitant ile homojenize.
5. Pasteur pipet ile taze bir 1.5 mL microtube içine homogenate transfer ve solüsyon içeren bir ultrasonik homogenizer 3 dk (3 kez 1 min) % 20 iş hacmi ile buz üzerinde kullanarak temizleyicide.
6. Santrifüjü 8.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından homogenate açıklamak Supernatants 4 M KOH ile nötralize (%0.25 10 birime TCA) buz ve 8.000 x g , santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için 20 dakika Süpernatant (olarak test örneği)-80 ° C'de aşağıdaki deneyleri kadar saklanabilir.

3. laktat tahlil Renkölçer tahlil Kit kullanarak

1. Renkölçer tahlil kiti (Tablo reçetesi) kullanarak test örneklerinde laktat konsantrasyonu ölçmek. Test örnekleri için çift yönlü sınav yerine getirir. 5 veya 10 µL test örnekleri bir 96-şey plakasına ekleyebilir ve laktat tahlil kit ile sağlanan arabellek ile iyi başına 50 µL birime ayarlayabilirsiniz.
2. Laktat standart eğri için 100 mM L (+) seyreltik-laktat standart 1 mM için laktat tahlil arabelleği ile. 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 µL (+) 1 mm L Ekle-laktat kit ile wells bir dizi sağlanan standart,.
3. Reaksiyon Mix (46:2:2 laktat tahlil arabellek, laktat enzim karışımı ve laktat Probe DMSO, susuz; tüm reaktifler kit ile sağlanan içinde içeren) veya arka plan denetimi (içeren 48:2 laktat tahlil arabellek ve laktat Probe) Mix 50 µL her kuyuya Ekle ve 30-60 dakika oda sıcaklığında örnekleri ışıktan korunan iken kuluçkaya.
4. 570 her kuyuda absorbans ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm ve reaksiyon Mix absorbans arka plan denetimi karışımından absorbans çıkarın.
5. Laktat standart eğri çizmek. Laktat standart eğri test örnekleri laktat konsantrasyonu hesaplayın.

4. pyruvate tahlil Renkölçer tahlil Kit kullanarak

1. Renkölçer tahlil kiti (Tablo reçetesi) kullanarak supernatants (test örnekleri) pyruvate konsantrasyonu ölçmek. Test örnekleri için çift yönlü sınav yerine getirir. Test örnekleri 10 µL ve çalışma (94:1 enzim karışımı ve boya reaktifi kit ile sağlanan içeren) reaktif 90 µL 96-şey plaka ekleyip örnekleri ışıktan korunan iken, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
2. 570 her kuyuda absorbans ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm.
3. Pyruvate standart eğri çizmek. Test örnekleri pyruvate standart eğri pyruvate konsantrasyonları hesaplayın.

5. protein tayini için normalleştirme Protein içerikli

1. Renkölçer tahlil kiti (Tablo reçetesi) kullanarak supernatants (test örnekleri) protein konsantrasyonu ölçmek. Ancak, bu adım bir tahlil kiti için sınırlı değildir ve diğer yaklaşımlar protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.
2. Laktat ve pyruvate konsantrasyonları her toplam protein konsantrasyonu kullanarak test örnekleri arasında değerleri normalize.
   Not: Test örneklerinde Protein konsantrasyonu yeterince bile protein yağış sonra algılanır ve normalleştirme adım örnekleri arasında için kullanılmaktadır.

Sonuçlar

Renkölçer deneyleri laktat ve pyruvate konsantrasyonları kantitatif tayin için biz C. elegans^7,8önceki raporlar ile karşılaştırıldığında bu deneyleri doğruluğunu gösterdi. Burada, örnek çıkarma sırasında protein yağış süreç doğru değerleri oluşturmak için en önemli bir adım oldu. Protein yağış, ortak precipitants için (Örn., TCA, PCA, veya metaphosphoric asit) test örnekleri ...

Tartışmalar

Bu Renkölçer tahlil kitleri kullanarak zaman hücresel laktat algılamak için örnek çıkarma en kritik adımda ve pyruvate C. elegans içinde doğru homojenizasyon (Şekil 1) sırasında protein yağış işlemidir. Teflon homogenizer, diğer homogenizers kullanmak kesinlikle gerekli değildir (Örn., Dounce ve konik doku öğütücüler veya boncuk fabrikaları) da solucanlar küçük ölçekli çıkarılması uygundur. Biz hücresel laktat ve pyruvate homogenizer pro...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton