Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Zusammenfassung

Laktat und Pyruvat sind wichtige Zwischenprodukte der intrazellulären Energie Stoffwechselwege. Überwachung der Laktat/Pyruvat-Verhältnis in den Zellen hilft, festzustellen, ob ein Ungleichgewicht im altersbedingten Energiestoffwechsel zwischen Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung und aerobe Glykolyse. Hier zeigen wir die Nutzung von kommerziellen farbmetrischen Assay Kits für Laktat und Pyruvat bei Modellorganismus C. Elegans. Vor kurzem wurden durch die Forschung und Entwicklung von Reagenz Herstellern durchgeführt die Empfindlichkeit und Genauigkeit der kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay Kits stark verbessert. Die verbesserte Reagenzien ermöglichten den Einsatz von kleinen Assays mit einer 96-Well-Platte in C. Elegans. Im Allgemeinen ist eine Antikörper-Test überlegen in der Empfindlichkeit einer kolorimetrischen Assay; Allerdings ist der kolorimetrischen Ansatz besser geeignet für den Einsatz im gemeinsamen Labors. Ein weiteres wichtiges Thema in diesen Tests zur quantitativen Bestimmung ist Eiweiß Niederschlag von homogenisierten C. Elegans Proben. In unserer Eiweiß Niederschlag Methode, gemeinsame Fällungsmitteln (zB., Trichloressigsäure Säure, Perchlorsäure und Metaphosphoric Säure) dienen zur Probenvorbereitung. Eine eiweißfreie Assay-Probe wird vorbereitet, indem man direkt kalt Fällungsmittel (Endkonzentration von 5 %) während der Homogenisierung.

Einleitung

Laktat und Pyruvat-Konzentrationen gelten als Zwischenprodukte des Energiestoffwechsels, und beziehen sich auf die Staaten der Glykolyse, tricarboxylic Säure (TCA) Zyklus und Elektronentransport-Kette in den Zellen der aeroben Organismen. Eine Reihe von Reaktionen in Glykolyse oxidiert Glucose zu Pyruvat, das liegt am Scheideweg metabolische und Kohlenhydrate durch Glukoneogenese, Fettsäuren und Energiestoffwechsel durch Acetyl-CoA und die Aminosäure Alanin umgewandelt werden kann. Die TCA-Zyklus tritt unter das Vorhandensein von ausreichend gelöste Sauerstoff und ist von grundlegender Bedeutung für die Umwandlung von Glukose in Energie. Vor allem, die Veränderung des sekundärstoffwechsels ist ein interessantes Phänomen in dem Glykolyse überwiegend zur Energiegewinnung verwendet wird und mitochondriale Atmung, beinhaltet die TCA-Zyklus und Elektronentransport-Kette ist herunterreguliert in Säugetieren Krebs Zellen^1,2. Wir zeigten kürzlich, dass die Laktatwerte und die konsequente Laktat/Pyruvat (L/P)-Verhältnis während der Alterung bei Modellorganismus Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) abgenommen. Ebenso fanden wir, dass der Säugetier-Tumorsuppressor p53 Ortholog CEP-1 in C. Elegans eine wichtige Rolle in der altersbedingten Veränderungen des Energiestoffwechsels durch die Aktivierung von seinen transkriptionelle Ziele³hat.

In biologischen Tests, wie die Messung von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen in den Zellen wurden die Empfindlichkeit, Genauigkeit, Stichprobenumfang und Inkubationszeit der kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay Kits dramatisch verbessert. Dank technologischer Innovationen können wir analysieren verschiedene Metaboliten und Fortgeschrittene Metaboliten ohne groß angelegte Kultur von C. Elegans, was angesichts seiner geringen Größe schwierig ist. Im Allgemeinen ist die Empfindlichkeit eines farbmetrischen Assays eine Größenordnung kleiner als die eines fluorimetrischen Assays; Allerdings eignet sich der kolorimetrischen Ansatz mehr im Rahmen der gemeinsamen Labors. Außerdem ist ein Extraktiontechnik, Homogenisierung und Eiweiß Niederschlag enthält für die quantitative Bestimmung von Laktat und Pyruvat Konzentrationen in C. Elegans Zellen von entscheidender Bedeutung, da diese Nematoden in ein Exoskelett eingeschlossen ist die Kutikula, im Gegensatz zu kultivierten Säugetierzellen Linien^4,5genannt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu analysieren, Laktat und Pyruvat Konzentrationen mit kommerziellen farbmetrischen Assay Kits inklusive Tipps für Probe-Extraktion von C. Elegans.

Protokoll

(1) synchronisierte Kultur von C. elegans

1. Vor der Aussaat, Kultur Escherichia coli (E. Coli) Stamm OP50 über Nacht bei 37 ° C in 300 mL Brühe Flüssigmedium Luria-Bertani (LB). Speichern der kultivierten OP50 bei-4 ° C.
   1. LB Brühe flüssiges Medium zu machen, verwenden Sie 10 g Tryptone, Hefeextrakt 5 g, 10 g NaCl und 1,5 mL 1 N NaOH und 1 L mit entionisiertem Wasser hinzufügen. Autoklaven.
      Hinweis: OP50 und C. Elegans Stämme sind aus dem Caenorhabditis Genetik Center (Universität von Minnesota, St. Paul, MN, USA) zur Verfügung.
2. Um Nematoden Wachstum Medium (NGM) Agar zu machen, verwenden Sie 3 g NaCl, 2,5 g Pepton, 17 g Agar und 975 mL entionisiertem Wasser. Autoklaven. Cool bis 55 ° C, dann steril hinzufügen, in Ordnung, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin in EtOH und 25 mL 1 M Kalium Phosphat pH 6.0 in 90-mm-Petrischalen.
   1. Verwenden Sie für 1 M Kalium Phosphat pH 6.0 108,3 g KH₂PO₄ und 46,6 g K₂HPO₄und fügen Sie 1 L. Autoklaven⁶deionisiertes Wasser hinzu.
3. 1-2 mL der kultivierten OP50 auf der NGM Agarplatten zu verbreiten. Um eine dünne Schicht von OP50 zu machen, inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur vor dem Hinzufügen alle Nematoden.
   Hinweis: Die NGM Agarplatten, die beimpften OP50 für 2-3 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden können.
4. Fügen Sie mindestens 100 Würmer auf einer nährbodenplatte NGM mit OP50 und Kultur bei 20 ° C bis Erwachsenen Stadium. Mindestens drei Platten sind erforderlich.
5. Zum Sammeln von Eiern im Mutterleibübertragen trächtigen Zwitter aus den drei NGM Agarplatten jeweils mit 5 mL S Puffer in einem 15 mL konische Röhrchen, und waschen Sie die Würmer 3 Mal mit 15 mL S Puffer mit Zentrifugation bei 300 X g für 30 s bei Raumtemperatur.
   1. Damit S Puffer, 5,9 g NaCl und 50 mL 1 M Kalium Phosphat pH 6.0 verwenden, fügen Sie zu 1 L mit entionisiertem Wasser hinzu. Autoklaven-⁶.
6. Lösen sich die Würmer in einer alkalischen Hypochlorit-Lösung für Axenization und bulk-Ei-Isolierung (0,5 mL frische Bleichmittel oder äquivalent: 5-6 % Natriumhypochlorit, 0,1 mL 10 M NaOH, ca. 4,5 mL S Puffer)⁶, und stehen die Lösung für 10-15 min bei Raumtemperatur mit dem Mischen durch invertieren.
   Hinweis: Innerhalb von 15 Minuten, sollten Erwachsene Würmer auflösen lassen eine trübe Lösung von Eiern befreit ihre Kadaver (die befreiten Eier sollten mit einem stereoskopischen Mikroskop bestätigt werden). Anstelle von 0,1 mL 10 N NaOH kann auch 0,2 mL 5 N NaOH verwendet werden.
7. Waschen Sie nach Hypochlorit Behandlung das Ei Pellet 3 Mal mit 15 mL S Puffer, und in 5-6 mL S Puffer aufzuwirbeln. Schlüpfen Sie die freigesetzten Eier während eine Übernachtung Inkubation bei 20 ° C in S Puffer ohne E. Coli für eine Zeit-synchrone Kultur der Phase L1-Larven.
8. Um die ungefähre Anzahl der Phase L1-Larven bestimmen, zählen Sie die Würmer eine stereoskopische Mikroskop in 10 µL Puffer S nach resuspending der Larven mindestens 3 Mal, und berechnen Sie den Mittelwert. Dann übertragen Sie die L1-Larven Bühne auf fünf NGM Agarplatten mit OP50 (1.500-3.000 Würmer pro Platte mit einer 90-mm-Petrischale) und Kultur bei 20 ° C bis sie, die jungen Erwachsenen Stadium, gewachsen sind wenn die Selbstbefruchtung beginnt und ein paar (normalerweise nach 3 d Eier Ays).

2. Gewinnung von zellulären Anteil von C. elegans

1. Die jungen Erwachsenen Stadium (5 Tage alte Tiere) aus den fünf NGM-Agar-Platten mit S-Puffer (Abbildung 1A) Würmer zu sammeln.
   1. Wählen Sie nur lebende Würmer mit Saccharose Methode⁶ für Flotation auf 30 % (w/V) Saccharose, mischen Sie die Würmer in 3-4 mL S Puffer mit ein gleiches Volumen an eiskaltem 60 % (w/V) Saccharose in einem 15 mL konische Rohr aufgehängt. Drehen Sie das Rohr auf 1.500 X g für 15 s bei 4 ° C und entfernen die schwimmende Würmer in ein frisches Gefäß indem Sie sie von der Wand des Rohres mit einer Pasteurpipette verschieben.
2. Waschen Sie die Würmer 3 Mal mit S-Puffer durch Zentrifugation bei 1.500 X g für 30 s bei 4 ° C. Überprüfen Sie die nassen Lautstärke von gewaschenen Worms nach Zentrifugation mit einer 1.000 µL Mikropipette Spitze (Abbildung 1 b).
3. Fügen Sie die gewaschenen Würmer auf ein gleiches Volumen an eiskaltem 10 % (w/V) Trichloressigsäure Säure (TCA; Endkonzentration von 5 %) für Proteinfällung (Abbildung 1). Anstelle von TCA kann Perchlorsäure (PCA) oder Metaphosphoric Säure verwendet werden.
4. Die Würmer mit der Fällungsmittel mit 40 Schläge von einem Stößel in einem Teflon-Homogenisator (Potter-Elvehjem Gewebe Grinder) mit Rotation bis zu 1.300 u/min auf Eis zu homogenisieren.
5. Das Homogenat in eine frische 1,5 mL reaktionscup mit einer Pasteurpipette übertragen und beschallen mit einem Ultraschall Homogenisator für 3 min (3 mal 1 min) mit einer Einschaltdauer von 20 % auf Eis.
6. Klären Sie das Homogenat durch Zentrifugation bei 8.000 X g für 10 min bei 4 ° c Die Überstände mit 4 M KOH zu neutralisieren (0,25 Lautstärke auf 10 % TCA) für 20 min auf Eis und Zentrifuge bei 8.000 X g für 10 min bei 4 ° C. Der Überstand (als ein Testmuster) kann bei-80 ° C bis die folgenden Tests gespeichert werden.

3. Laktat-Test mit einer kolorimetrischen Assay Kit

1. Messen Sie die Konzentration von Laktat in der Prüflinge mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Table of Materials). Duplex-Untersuchungen der Prüflinge durchführen. Eine 96-Well-Platte 5 oder 10 µL der Prüflinge hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 50 µL pro Bohrloch mit dem Laktat-Assay-Puffer mit dem Kit zur Verfügung gestellt.
2. Für die Standardkurve Laktat verdünnen 100 mM L (+)-Laktat-Standard bis 1 mM mit Testpuffer Laktat. Fügen Sie 0, 2, 4, 6, 8 und 10 µL 1 mM L (+)-Laktat-Standard, die mit dem Kit in einer Reihe von Brunnen zur Verfügung gestellt wird.
3. Fügen Sie 50 µL Reaktion Mix (mit 46:2:2 von Laktat Testpuffer, Laktat-Enzym-Mix und Laktat-Probe in DMSO, wasserfreie; alle Reagenzien mit dem Kit bereitgestellt werden) oder Hintergrund Kontrolle Mix (mit 48:2 von Laktat Testpuffer und Laktat-Sonde) in jede Vertiefung und bei Raumtemperatur für 30-60 min inkubieren, während die Proben vor Licht geschützt sind.
4. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 570 nm mit einer Mikrotestplatte Reader und die Extinktion des Hintergrund Kontrolle Mix aus der Extinktion der Reaktion Mischung subtrahieren.
5. Plot der Standardkurve Laktat. Berechnen Sie die Laktat-Konzentrationen der Prüflinge aus der Standardkurve Laktat.

(4) Pyruvat Assay mit einer kolorimetrischen Assay Kit

1. Messen Sie die Konzentration von Pyruvat in die Überstände (Prüflinge) mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Table of Materials). Duplex-Untersuchungen der Prüflinge durchführen. Fügen Sie 10 µL der Prüflinge und 90 µL arbeiten Reagenz (mit 94:1 von Enzym-Mix und Farbstoff Reagenz, die mit dem Kit bereitgestellt werden) in eine 96-Well-Platte und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren Sie, während die Proben vor Licht geschützt sind.
2. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 570 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
3. Plot der Standardkurve Pyruvat. Berechnen Sie die Pyruvat-Konzentrationen der Prüflinge aus der Standardkurve Pyruvat.

5. Protein Assay für die Normalisierung mit Protein-Inhalt

1. Messen Sie die Konzentration des Proteins in die Überstände (Prüflinge) mit einer kolorimetrischen Assay Kit (Table of Materials). Jedoch diesen Schritt beschränkt sich nicht auf ein Test-Kit, und andere Ansätze zur Messung der Konzentration des Proteins genutzt werden.
2. Die Werte von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen unter der Prüflinge mit jeder Gesamt-Protein-Konzentration zu normalisieren.
   Hinweis: Proteinkonzentration in der Prüflinge ist ausreichend auch nach Proteinfällung erkannt und wird für die Normalisierung Schritt zwischen Proben genutzt.

Ergebnisse

Die farbmetrischen Assays zeigten für die quantitative Bestimmung von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen wir die Genauigkeit dieser Tests im Vergleich zu früheren Berichten in C. Elegans^7,8. Hier war der Prozess der Proteinfällung während der Probe Extraktion der wichtigste Schritt um exakte Werte zu generieren. Für Proteinfällung, gemeinsame Fällungsmitteln (zB., TCA, PCA, oder Metaphosphoric Säure) kann...

Diskussion

Wenn Sie diese farbmetrischen Assay Kits verwenden, ist der wichtigste Schritt in der Probengewinnung zellulärer Laktat zu erkennen und Pyruvat genau in C. Elegans der Prozess der Proteinfällung während der Homogenisierung (Abbildung 1). Es ist nicht unbedingt notwendig, eine Teflon-Homogenisator als andere Homogenisatoren zu verwenden (zB., Dounce und konisch Gewebe Schleifmaschinen oder Wulst Mühlen) eignen sich auch für die kleinen Extraktion von Würmern. Wir nicht...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton