소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

요약

우리는 수정 된 소규모 추출 및 젖 산 염 그리고 pyruvate는 선 충 류에서의 색도계 분석 실험 설명 C. 선 충. 상업적인 분석 키트를 이용 하는 때 그들의 감도 정확도의 기술 개발이 중요 합니다. 추출 강 수 단백질은 세포내 대사 산물의 양적 결정에 대 한 가장 중요 한 단계 이다.

초록

젖 산 염 그리고 pyruvate는 세포내 에너지 대사 경로의 핵심 중간체. 셀에 젖/pyruvate 비율 모니터링 연령과 관련 된 에너지 대사 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 및 호 기성 분해 사이에서 불균형이 있는지 여부를 확인 도움이 됩니다. 여기, 우리는 모델 유기 체 C. 선 충에 젖 산 염 그리고 pyruvate에 대 한 상업 색도계 분석 실험 키트 활용을 보여줍니다. 최근, 감도 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 정확도 개선 되었습니다 크게 연구 및 개발 시 약 제조 업체에 의해 실시. 향상 된 시 약은 C. 선 충에서 96 잘 접시와 함께 소규모 분석 실험의 사용을 활성화 했습니다. 일반적으로, fluorimetric 분석 결과 우수한 감도 색도계 분석 결과; 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실에서 사용에 대 한 더 적합 합니다. 양적 결정에 대 한 이러한 분석에 또 다른 중요 한 문제는 무 균된 C. 선 충 의 단백질 강 수 샘플. 우리의 단백질 강 수 방법에서는, 일반적인 침 (예., trichloroacetic 산과 염소 산 및 metaphosphoric 산) 샘플 준비를 위해 사용 됩니다. 분석 결과 단백질 무료 샘플 직접 균질 동안 차가운 비례적 (최종 농도 5%)를 추가 하 여 준비가 되어 있습니다.

서문

젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 에너지 대사의 중간체로 널리 그리고 분해, tricarboxylic 산 (TCA) 사이클, 에어로빅 생물의 세포에서 전자 전송 체인의 상태를 관련이 있습니다. 분해 반응의 시리즈 포도 당 변화 기로에 놓여 있으며 gluconeogenesis, 지방산 및 아 세 틸 coa, 통해 에너지 대사를 통해 탄수화물과 아미노산 알라닌 개조 될 수 있다 pyruvate에 산화. TCA 주기 충분 한 용 존된 산소의 존재에서 발생 하 고 포도 당 에너지 변환에 대 한 근본 이다. 특히, 보조 대사의 변경 분해 에너지 생산을 위한 주로 사용 되는 흥미로운 현상을 이며 TCA 주기 및 전자 전송 체인을 포함, 에어로빅 미토 콘 드리 아 호흡 downregulated 포유류 암에서 세포^1,2. 우리는 최근 젖 산 수준 및 필연적인 젖/pyruvate (L/P) 비율은 감소 모델 유기 체 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 노화 동안 보였다. 마찬가지로, 우리는 C. 선 충 에 포유류 종양 억제기 p53 ortholog CEP-1는 transcriptional 대상³의 활성화를 통해 에너지 대사의 연령 관련 변경에 중요 한 역할은 발견.

셀, 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 측정 등 생물학 분석 실험에 감도, 정확도, 샘플 크기 및 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 부 화 시간이 개선 되었습니다 극적으로. 기술 혁신으로 인하여 우리 지금 분석 다양 한 대사 산물 및 중간 대사 산물의 C. 선 충, 대규모 문화 없이 작은 크기를 주어 어려운 수 있다. 일반적으로 색도계 분석 실험의 감도 fluorimetric 분석 결과;의 그것 보다는 더 작은 크기 순서 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실의 설정에 더 적합 합니다. 이 선 충이 류는 외 골격에 묶여 있기 때문에 또한, 균질 및 단백질 강 수를 포함 하는 추출 기법 선 충 C. 셀에 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정 결정적 이다 포유류 배양된 세포 라인^4,5와 달리 표 피를 라고합니다. C. 선 충에서 샘플 추출에 대 한 팁을 포함 하 여 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 분석 하는 프로토콜을 설명 합니다.

프로토콜

1. C. 선 충 의 동기화 된 문화

1. 시드, 전에 문화 대장균 (대장균) 변형 OP50 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 국물 액체 매체의 300 mL에 37 ° C에서. -4 ° c.에 교양된 OP50 저장
   1. LB 국물 액체 매체, tryptone의 10 g, 효 모 추출 물 5g, NaCl의 10 g 1 N NaOH의 1.5 mL를 사용 하 여와 이온 물 1 L에 추가. 오토 클레이 브.
      참고: OP50 및 C. 선 충 종자는 꼬마 유전학 센터 (미네소타의 대학, 세인트 폴, 미네소타, 미국)에서 사용할 수 있습니다.
2. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 천 하 게, NaCl의 3 세대, 펩의 2.5 g, 한 천의 17 g 및 이온된 수의 975 mL을 사용 합니다. 오토 클레이 브. 55 ° C, 다음 sterilely 멋진 추가, 순서, 1 M MgSO₄의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl₂, 5mg/mL EtOH, 및 25 mL 1 M 칼륨 인산 염 pH 90에서 6.0의 콜레스테롤의 1 mL-mm 페 트리 접시.
   1. 1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0에 대 한 KH₂포₄ 108.3 g와 K₂HPO₄, 46.6 g 사용 하 고 1 L. 압력솥⁶이온된 수를 추가 합니다.
3. 1-2 mL NGM 한 천 배지에서 배양된 OP50의 확산. OP50의 얇은 층을 하려면 어떤 nematodes을 추가 하기 전에 실 온에서 하룻밤 번호판을 품 어.
   참고:는 NGM agar 접시 접종된 OP50는 2-3 주 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다.
4. 성인 단계까지 20 ° C에서 OP50, 및 문화 NGM 천 배지에 적어도 100 벌레를 추가 합니다. 적어도 3 개의 격판덮개는 필요 합니다.
5. Utero에서달걀 수집, 전송 3 NGM 한 천 격판덮개에서 각 15 mL 원뿔 튜브에 S 버퍼의 5 mL와 함께 광고에 나온 벗 것을 3 번 30 300 x g 에서 원심 분리를 사용 하 여 S 버퍼의 15 mL와 함께 벌레를 씻어 실 온에서 s.
   1. NaCl의 5.9 g 50 mL의 1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0 사용 하 여 S 버퍼 수 있도록, 이온 물 1 L를 추가 합니다. 압력솥⁶.
6. Axenization에 대 한 알칼리 성 차 아 염소 산 용액에 벌레를 해산 하 고 그 절연을 대량 (신선한 표 백제 또는 동급의 0.5 mL: 5-6% 염소, 10 M NaOH, S 버퍼의 약 4.5 mL의 0.1 mL)⁶, 10-15 분에 솔루션을 서 반전에 의해 혼합과 룸 온도입니다.
   참고: 15 분 이내 어른 벌레 해야 디졸브, 계란 (해방된 계란은 입체 현미경으로 확인 되어야 한다) 그들의 시체에서 해방의 흐릿한 솔루션을 떠나. 10 N NaOH의 0.1 mL, 대신 5 N NaOH의 0.2 mL도 사용할 수 있습니다.
7. 차 아 염소 산 처리 후 3 번 S 버퍼의 15 mL와 함께 계란 펠 릿을 세척 하 고 S 버퍼의 5-6 ml에서 resuspend. L1 무대 애벌레의 동기 나이 문화에 대 한 대장균 없이 S 버퍼에 20 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 기간 동안 나온된 계란을 부 화 한다.
8. L1 무대 애벌레의 대략적인 수를 확인 하려면 resuspending 애벌레 적어도 3 번 후 S 버퍼의 10 µ L에 입체 현미경을 사용 하 여 웜 세 고 평균을 계산. OP50 (1500-3000 벌레 당 90 mm 페 트리 접시를 사용 하 여 접시), 5 NGM 한 천 배지를 L1 무대 애벌레를 전송 그리고 그들은 젊은 성인 단계는 self-fertilization 시작 하 고 몇 알 (일반적으로 3 d 후 레이아웃 성장해 왔습니다 때까지 20 ° C에서 문화 ays)입니다.

2. C. 선 충 에서 셀룰러 분수의 추출

1. 젊은 성인 단계 (5-하루-오래 된 동물) S 버퍼 (그림 1A)와 5 NGM 한 천 배지에서 벌레를 수집 합니다.
   1. 30% (w/v) 자당에 부양에 대 한 자당 방법⁶ 을 사용 하 여 살아있는 벌레만을 선택, 15 mL 원뿔 튜브에 얼음 처럼 차가운 60% (w/v) 자당의 동등한 양으로 S 버퍼의 3-4 mL에 벌레를 혼합 한다. 1500 x g 15에서 튜브를 회전 s 4 ° C 및 부동 제거에 파스퇴르 피 펫과 튜브의 벽에서 이동 하 여 신선한 튜브로 벌레.
2. 1500 x g 30에 원심 분리에 의해 3 번 S 버퍼와 벌레를 씻어 4 ° c.에 s 1000 µ L micropipette 팁 (그림 1B)를 사용 하 여 원심 분리 후 세척된 벌레의 젖은 볼륨을 확인 합니다.
3. 단백질 강 수 (그림 1C)에 대 한 차가운 10% (w/v) trichloroacetic 산 (TCA, 5%의 최종 농도)의 동일한 볼륨을 씻어 벌레를 추가 합니다. TCA, 대신과 염소 산 (PCA) 또는 metaphosphoric 산 사용할 수 있습니다.
4. 얼음에 1300 rpm 까지의 회전 테 플 론 균질 화기 (포터 Elvehjem 조직 분쇄기)에 유 봉의 40 스트로크를 사용 하 여 비례적으로 벌레를 균질.
5. 파스퇴르 피 펫과 신선한 1.5 mL microtube에는 homogenate를 전송 하 고 3 분 (3 시간 1 분) 20% 듀티 사이클 얼음에 대 한 초음파 균질 화기를 사용 하 여 sonicate.
6. 4 ° c.에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여는 homogenate를 명확히 4 m 코 supernatants 중화 (0.25 볼륨 10 %TCA), 얼음에 4 ° c.에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리기 20 분 (테스트 샘플)로 상쾌한 다음 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 젖 산 분석 결과 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여

1. 색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 테스트 샘플에 있는 젖 산의 농도 측정 합니다. 테스트 샘플에 대 한 이중 검사를 실시 합니다. 테스트 샘플의 5 또는 10 µ L 96 잘 접시에 추가 하 고 젖이 나올 시험 버퍼 키트와 함께 제공 잘 당 50 µ L 볼륨을 조정 합니다.
2. 젖 산 표준 곡선에 대 한 희석 100 m m L (+)-젖이 나올 표준 1 mm 젖이 나올 시험 버퍼. 0, 2, 4, 6, 8, 및 10 µ L 1 m m L의 (+)를 추가-젖이 나올 표준, 우물의 시리즈에는 키트와 함께 제공 되는.
3. 각 잘에 반응 믹스 (젖이 나올 시험 버퍼, DMSO, 무수; 모든 시 약 키트와 함께 제공 됩니다에서 프로브 젖이 나올 젖이 나올 효소 혼합 46:2:2 포함) 또는 배경 제어 믹스 (프로브 젖이 나올 젖이 나올 시험 버퍼의 48:2 포함)의 50 µ L를 추가 그리고 샘플은 빛 으로부터 보호 하는 동안 30-60 분 동안 실내 온도에 품 어.
4. 각 잘 570에서의 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여 배경 제어 혼합 반응 혼합의 흡 광도에서 흡 광도 뺍니다.
5. 젖 산 표준 곡선을 플롯. 젖 산 표준 곡선에서 테스트 샘플의 젖 산 농도 계산 합니다.

4. pyruvate 분석 결과 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여

1. 색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 supernatants (테스트 샘플)에 pyruvate의 농도 측정 합니다. 테스트 샘플에 대 한 이중 검사를 실시 합니다. 96 잘 접시에 테스트 샘플의 10 µ L 및 작업 시 약 (효소 혼합 및 염료 시 약 키트와 함께 제공 되는 94:1를 포함 하는)의 90 µ L을 추가 하 고 샘플 빛 으로부터 보호 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어.
2. 각 잘 570에서의 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
3. Pyruvate 표준 곡선을 플롯. Pyruvate 표준 곡선에서 테스트 샘플의 pyruvate 농도 계산 합니다.

5. 단백질 단백질 콘텐츠 정규화에 대 한 분석 결과

1. 색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 supernatants (테스트 샘플)에서 단백질 농도 측정 합니다. 그러나,이 단계는 분석 결과 키트에 국한 되지 않습니다 그리고 다른 접근 단백질 농도 측정 하기 위하여 이용 될 수 있다.
2. 각 총 단백질 농도 사용 하 여 테스트 샘플 중 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 값을 정상화.
   참고: 테스트 샘플에 있는 단백질 농도 단백질 강 수 후에 충분히 감지 되 고 샘플 중 정규화 단계에 대 한 활용.

결과

젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정에 대 한 색도계 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 선 충 C.^7,8이전 보고서와 비교 분석 하는 이러한 실험의 정확도 보였다. 여기, 샘플 추출 하는 동안 단백질 강 수 과정은 정확한 값을 생성 하는 가장 중요 한 단계. 단백질 강 수, 일반적인 침에 대 한 (예., TCA, PCA, 또는 metaphosph...

토론

이러한 색도계 분석 실험 키트를 활용 하면 샘플 추출 세포 젖 산을 감지 하는 가장 중요 한 단계 및 pyruvate C. 선 충 에 정확 하 게 균질 (그림 1) 동안 단백질 강 수 과정입니다. 그것은 엄격 하 게 다른 균질으로 테 플 론 균질 화기를 사용 하는 데 필요한 (예., Dounce 및 조직 그 라인 더, 또는 비드 밀 테이퍼)는 또한 벌레의 소규모 추출에 적합. 우리 검색 하지 못?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton