Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Abstract

Lattato e piruvato sono intermedi chiave delle vie metaboliche di energia intracellulare. Monitoraggio del rapporto lattato/piruvato in cellule aiuta a determinare se vi è uno squilibrio nel metabolismo energetico senile tra fosforilazione ossidativa mitocondriale e glicolisi aerobica. Qui, ci mostra l'utilizzo di kit di analisi colorimetrica commerciale per lattato e piruvato nell'organismo modello di c. elegans. Recentemente, la sensibilità e la precisione dei kit colorimetrico/fluorimetrica dosaggio sono stati migliorati notevolmente dalla ricerca e sviluppo condotti da produttore di reagente. I reagenti migliorati hanno permesso l'uso di dosaggi in piccola scala con una piastra a 96 pozzetti in c. elegans. In generale, un'analisi fluorimetrica è superiore nella sensibilità a un saggio colorimetrico; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto per l'uso nei comuni laboratori. Un'altra questione importante in queste analisi per la determinazione quantitativa è precipitazione della proteina di omogeneizzato di c. elegans campioni. Nel nostro metodo di precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad es., acido tricloroacetico, acido perclorico e acido metafosforico) vengono utilizzati per la preparazione del campione. Un campione di analisi senza proteine è preparato aggiungendo direttamente freddo precipitante (concentrazione finale del 5%) durante l'omogeneizzazione.

Introduzione

Le concentrazioni di lattato e piruvato sono ampiamente considerate come prodotti intermedi del metabolismo energetico e sono correlate agli Stati di glicolisi, ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e catena di trasporto degli elettroni nelle cellule degli organismi aerobici. Una serie di reazioni nella glicolisi ossidare il glucosio a piruvato, che si trova a un bivio metabolico e può essere convertito per carboidrati attraverso gluconeogenesi, acidi grassi e metabolismo energetico attraverso acetil-CoA e l'aminoacido alanina. Ciclo del TCA si verifica in presenza di sufficiente ossigeno disciolto ed è fondamentale per la conversione del glucosio in energia. Soprattutto, l'alterazione del metabolismo secondario è un fenomeno interessante in cui la glicolisi è usata principalmente per la produzione di energia e la respirazione mitocondriale aerobica, che coinvolge il ciclo del TCA e la catena di trasporto degli elettroni, è downregulated in mammiferi cancro cellule^1,2. Abbiamo mostrato recentemente che i livelli di lattato e il rapporto lattato/piruvato conseguente (L/P) è diminuito durante l'invecchiamento dell'organismo modello Caenorhabditis elegans (c. elegans). Allo stesso modo, abbiamo trovato che il mammifero tumore soppressore p53 ortholog CEP-1 c. elegans ha un ruolo importante nelle alterazioni del metabolismo energetico attraverso l'attivazione dei suoi bersagli trascrizionali³età-correlate.

In saggi biologici, come la misurazione delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule, sono stati migliorati drammaticamente la sensibilità, precisione, dimensione del campione e tempo di incubazione di kit di saggio colorimetrico/fluorimetrico. A causa di innovazioni tecnologiche, siamo ora in grado di analizzare vari metaboliti e metaboliti intermedi senza la cultura su larga scala di c. elegans, che è difficile date le sue piccole dimensioni. In generale, la sensibilità di un saggio colorimetrico è un ordine di grandezza più piccolo di quello di un'analisi fluorimetrica; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto nella cornice di laboratori comuni. Inoltre, una tecnica di estrazione contenente la precipitazione della proteina e di omogeneizzazione è cruciale per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule di c. elegans , perché questo nematode è racchiuso in un esoscheletro chiamato la cuticola, a differenza di linee cellulari di mammifero coltivate^4,5. Qui, descriviamo un protocollo per analizzare le concentrazioni di lattato e piruvato usando i kit di analisi colorimetrica commerciali compresi suggerimenti per l'estrazione del campione da c. elegans.

Protocollo

1. sincronizzata cultura di c. elegans

1. Prima della semina, cultura dell' Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo OP50 durante la notte a 37 ° C in 300 mL di terreno liquido di brodo di Luria-Bertani (LB). Conservare il OP50 coltivate-4 ° C.
   1. Per rendere il mezzo liquido di brodo LB, utilizzare 10 g di triptone, 5 g di Estratto di lievito, 10 g di NaCl e 1,5 mL di NaOH N 1 e aggiungere a 1 L con acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave.
      Nota: Ceppi OP50 e c. elegans sono disponibili dal centro di genetica della Caenorhabditis (Università del Minnesota, St. Paul, MN, USA).
2. Per rendere agar medio (NGM) crescita del nematode, utilizzare 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone, 17 g di agar e 975 mL di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave. Raffreddare a 55 ° C, quindi sterilmente aggiungere, in ordine, 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL di EtOH e 25 mL di 1 M potassio fosfato pH 6.0 in 90-mm piastre di Petri.
   1. Per 1 M potassio fosfato pH 6.0, utilizzare 108,3 g di KH₂PO₄ e 46,6 g di K₂HPO₄e aggiungere acqua deionizzata a 1 Autoclave L.⁶.
3. Spread 1-2 mL della OP50 coltivate su piastre di agar NGM. Per rendere un sottile strato di OP50, incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente prima di aggiungere qualsiasi nematodi.
   Nota: Le piastre di agar NGM a che OP50 inoculato può essere conservato temperatura ambiente per 2-3 settimane.
4. Aggiungere almeno 100 vermi su una piastra di agar NGM con OP50 e cultura a 20 ° C fino allo stadio adulto. Almeno tre piastre sono necessari.
5. Per raccogliere le uova nell'utero, trasferire gravid ermafroditi dalle tre NGM agar piastre ciascuna con 5 mL di buffer di S in una provetta conica da 15 mL e lavare i vermi 3 volte con 15 mL di buffer di S mediante centrifugazione a 300 x g per 30 s a temperatura ambiente.
   1. Per rendere S buffer, utilizzare 5,9 g di NaCl e 50 mL di 1 M potassio fosfato pH 6.0, aggiungere 1 L con acqua deionizzata. Autoclave⁶.
6. Sciogliere i vermi in una soluzione di ipoclorito alcalino per axenization e uovo isolamento di massa (0,5 mL di candeggina fresco o equivalente: 5-6% ipoclorito di sodio, 0,1 mL di NaOH 10 M, circa 4,5 mL di buffer di S)⁶, e riposare la soluzione per 10-15 min a temperatura ambiente con miscelazione invertendo.
   Nota: Entro 15 min, vermi adulti dovrebbero sciogliere, lasciando una soluzione nebuloso di uova liberati dalle loro carcasse (le uova liberate devono essere confermate usando un microscopio stereoscopico). Invece di 0,1 mL di NaOH 10 N, 0,2 mL di NaOH N 5 può anche essere utilizzato.
7. Dopo il trattamento di ipoclorito, lavare la pallina di uovo 3 volte con 15 mL di buffer di S e risospendere in 5-6 mL di buffer di S. Si schiudono le uova rilasciate durante un'incubazione overnight a 20 ° C nel buffer di S senza Escherichia coli per una cultura età-sincrono di larve della fase L1.
8. Per determinare il numero approssimativo di larve della fase L1, contare i vermi utilizzando un microscopio stereoscopico a 10 µ l di tampone di S dopo risospendere le larve almeno 3 volte e calcolare la media. Quindi, trasferire le larve della fase L1 a cinque piastre di agar NGM con OP50 (1.500-3.000 worm al piatto utilizzando una capsula di Petri di 90 mm) e della coltura a 20 ° C fino a quando non sono cresciuti alla fase adulta giovane, quando comincia l'autofecondazione e poche uova (in genere dopo 3 d AYS).

2. estrazione della frazione cellulare da c. elegans

1. Raccogliere i giovani vermi fase adulta (5-giorno-vecchio animali) dalle cinque piastre di agar NGM con buffer di S (Figura 1A).
   1. Per selezionare solo viti senza fine viventi che usando il saccarosio metodo⁶ per flottazione il saccarosio 30% (p/v), mescolare i vermi sospesi in 3-4 mL di buffer di S con un volume uguale di saccarosio ghiacciata di 60% (p/v) in una provetta conica da 15 mL. Girare il tubo a 1.500 x g per 15 s a 4 ° C e rimuovere il galleggiante vermi in una nuova provetta spostandoli fuori la parete del tubo con una pipetta Pasteur.
2. Lavare i vermi 3 volte con tampone di S mediante centrifugazione a 1.500 x g per 30 s a 4 ° C. Controllare il volume bagnato di vermi lavati dopo centrifugazione utilizzando una punta di una micropipetta di 1.000 µ l (Figura 1B).
3. Aggiungere i vermi lavati per un volume uguale di gelida 10% (p/v) l'acido tricloroacetico (TCA; concentrazione finale del 5%) per precipitazione della proteina (Figura 1). Invece di TCA, acido perclorico (PCA) o acido metafosforico può essere utilizzato.
4. Omogeneizzare i vermi con il precipitante con 40 colpi di un pestello in un omogeneizzatore di Teflon (Potter-Chazen smerigliatrice di tessuto) con rotazione fino a 1.300 giri/min su ghiaccio.
5. Trasferire l'omogeneizzato in una fresca microprovetta 1,5 mL con una pipetta Pasteur e sottoporre ad ultrasuoni utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni per 3 minuti (3 volte di 1 min) con un 20% duty cycle su ghiaccio.
6. Chiarire l'omogeneizzato mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C. Neutralizzare i surnatanti con 4M KOH (0,25 volume 10% TCA) per 20 min in ghiaccio e centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il surnatante (come un esempio di test) si possa depositare a-80 ° C fino a quando i seguenti saggi.

3. lattato Dosaggio utilizzando un Kit di analisi colorimetrica

1. Misurare la concentrazione di lattato nei campioni di prova utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Effettuare l'esame duplex per i campioni di prova. Aggiungere 5 o 10 µ l dei campioni in una piastra a 96 pozzetti e regolare il volume a 50 µ l per pozzetto con il lattato Assay Buffer fornito con il kit.
2. Per la curva standard di lattato, diluire 100 mM L (+)-lattato Standard a 1 mM con tampone del lattato. Aggiungere 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µ l della mM 1 L (+)-lattato Standard, che viene fornito con il kit, in una serie di pozzi.
3. Aggiungere 50 µ l di miscela di reazione (contenente 46:2:2 di tampone del lattato, Mix di enzima lattato e lattato sonda in DMSO, anidro; tutti i reagenti sono forniti con il kit) o sfondo controllo Mix (contenente 48,2 del tampone del lattato e del lattato Probe) in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30-60 min, mentre i campioni sono protetti dalla luce.
4. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre l'assorbanza del controllo Mix sfondo dall'assorbanza della miscela di reazione.
5. Tracciare la curva standard di lattato. Calcolare le concentrazioni di lattato dei campioni dalla curva standard del lattato.

4. piruvato analisi usando un Kit di analisi colorimetrica

1. Misurare la concentrazione di piruvato nei surnatanti (campioni) utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Effettuare l'esame duplex per i campioni di prova. Aggiungere 10 µ l di campioni e 90 µ l di reagente di lavoro (contenente 94:1 enzima Mix e il reagente colorante, che sono forniti con il kit) in una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, mentre i campioni sono protetti dalla luce.
2. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
3. Tracciare la curva standard del piruvato. Calcolare le concentrazioni di piruvato dei campioni dalla curva standard del piruvato.

5. protein Assay per normalizzazione con contenuto proteico

1. Misurare la concentrazione di proteina nei surnatanti (campioni) utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Tuttavia, questo passaggio non è limitato a un kit di dosaggio, e altri approcci possono essere utilizzati per misurare la concentrazione di proteina.
2. Normalizzare i valori delle concentrazioni di lattato e piruvato fra i campioni di prova usando ogni concentrazione di proteine totali.
   Nota: Concentrazione nella proteina nei campioni di prova sufficientemente viene rilevato anche dopo la precipitazione della proteina ed è utilizzata per il passo di normalizzazione tra i campioni.

Risultati

Utilizzando l'analisi colorimetriche per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato, abbiamo mostrato la precisione di questi saggi rispetto ai rapporti precedenti in c. elegans^7,8. Qui, il processo di precipitazione della proteina durante l'estrazione del campione è stato il passaggio più importante per generare valori accurati. Per precipitazione della proteina, precipitanti comune (...

Discussione

Quando si utilizzano questi kit di analisi colorimetrica, la fase più critica nell'estrazione del campione per rilevare cellulare del lattato e del piruvato con precisione in c. elegans è il processo di precipitazione della proteina durante l'omogeneizzazione (Figura 1). Non è strettamente necessario utilizzare un omogeneizzatore di Teflon, come altri omogeneizzatori (ad es., lisata e conico smerigliatrici del tessuto, o mulini del branello) sono adatti anche per l'estra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton