JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasındaki protein-protein etkileşimler çalışmaya açıklar. Bu yöntem gösteri transkripsiyon faktörleri ve hipoksi, transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler için uygundur.

Özet

Düşük oksijen düzeyleri (hipoksi) hipoksi-indüklenebilir faktörü 1 (kurulan-1) bir ana düzenleyici hareket karmaşık adaptif yanıt çeşitli tetikler. Kurulan-1 bir heterodimeric oksijen düzenlenir α birimi (kurulan-1α) oluşur ve yapısal genler angiogenez dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde dahil düzenleyen β alt birim (kurulan-1β) olarak da bilinen aril hidrokarbon reseptör nükleer ışınlama (ARNT), ifade , arttığından ve glikoliz. Kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması yolu sinyal hipoksi anlama anahtarıdır. Kurulan-1α istikrar düzenlemenin yanı sıra, hipoksi da kurulan-1α ve ARNT dahil olmak üzere birçok transkripsiyon faktörleri nükleer translocation tetikler. Özellikle, bu tür protein-protein etkileşimleri (PPIs) eğitim için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu nerede protein düzeyleri Yapay protein overexpression artan sistemleri temel alır. Protein overexpression kez zamansal ve mekansal yapılardan kaynaklanan fizyolojik olmayan sonuçlara yol açar. Burada biz değiştirilmiş bir co-immunoprecipitation tarif protokol endojen nükleer proteinler hipoksi tedavi sonrasında ve kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi göstermek için kavramının bir kanıtı olarak. Bu iletişim kuralı, hipoksik hücrelerin hipoksik koşullarda hasat edildi ve Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (DPBS) yıkama arabellek ayrıca protein yıkımı veya protein kompleksi azaltmak için kullanımdan önce hipoksik koşulları için önceden denge ayrılma sırasında reoxygenation. Ayrıca, nükleer kesirler daha sonra konsantre ve endojen nükleer proteinler stabilize ve sık görülen bir protein overexpression sırasında olası sahte sonuçları önlemek için elde. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve transkripsiyon Co düzenleyiciler hipoksik koşullarda endojen ve yerel Hofstede göstermek için kullanılabilir.

Giriş

Yetersiz oksijen hücre ve vücut dokuları sağlandığında hipoksi oluşur. Kök hücre farklılaşması, inflamasyon ve kanser1,2gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler kritik bir rol oynar. Hipoksi-indüklenebilir faktörler (HIFs) oluşan bir oksijen düzenlenir α alt birim ve yapısal ifade β alt birim olarak da bilinen ARNT3heterodimers işlev. Kurulan-α alt birimleri (kurulan-1α, kurulan-2α ve kurulan-3α) ve üç kurulan-β alt birimleri (ARNT/kurulan-1β, ARNT2 ve ARNT3) üç izoformlarının bugüne kadar tespit edilmiştir. Kurulan 2α, kurulan-3α, ARNT2 ve ARNT3 daha ifade desenleri4ile ilgili bir kısıtlama ise kurulan-1α ve ARNT ubiquitously, ifade edilir. Kurulan-1 protein kompleksi hipoksi yanıt anahtar düzenleyicisidir. Hipoksik koşullarda kurulan-1α stabilize hale gelir, o zaman için çekirdek translocates ve ARNT5ile dimerizes. Daha sonra bu karmaşık hipoksi duyarlı öğeler (Xact_s_lastresourcemanager) olarak bilinen belirli nükleotit bağlar ve anjiogenezi, arttığından ve glikoliz6dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde ilgili hedef genlerin ifade düzenler. Bu "kanonik" Yanıt yanı sıra, hipoksi sinyal yolu da crosstalk için birden çok hücre tepkisini yolları çentik ve nükleer faktör kappa B (NF-κB) gibi sinyal ile bilinen7,8,9.

Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinlerin daha iyi yolu sinyal hipoksi anlamak için önemlidir. Oksijen seviyesi duyarsız ve yapısal ifade, ARNT aksine kurulan-1α protein düzeyleri sıkıca Hücresel oksijen düzeyleri tarafından düzenlenmektedir. Normoxia (% 21 oksijen) kurulan-1α hızla bozulmuş10,11proteinlerdir. Kurulan-1α kısa yarılanma normoxia, belirli teknik sorunlar hücre özleri protein tespiti için hem de kurulan 1α etkileşim proteinlerin tanımlanması için sunar. Ayrıca, hipoksik koşulları12,13,14altında çekirdek içine kurulan-1 kompleks de dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon faktörleri translocate. ÜFE çalışmaları için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu fizyolojik olmayan overexpression proteinlerin kullanarak gerçekleştirilir. Bu tür protein overexpression kaynak aşırı yük, stokiometrik dengesizlik, önüne gelenle yatıp kalkan etkileşimleri ve yol modülasyon15,16da dahil olmak üzere birden çok mekanizmalar aracılığıyla farklı hücresel kusurları neden olduğu bildirilmiştir. ÜFE çalışmalar açısından yanlış pozitif veya bile yanlış negatif, sonuçlarına bağlı olarak protein özellikleri ve işlevleri overexpressed proteinlerin protein overexpression yol açabilir. Bu nedenle, ÜFE çalışmaları için geçerli yöntemleri fizyolojik ilgili PPIs hipoksik koşullarda ortaya çıkarmak için değiştirilmesi gerekir. Daha önce kurulan-1 ve Ets aile transkripsiyon faktörü Hes1 organizatörü yanıt hipoksi17katkı GA-bağlayıcı protein (GABP) hipoksik P19 hücrelerdeki arasındaki etkileşimi göstermiştir. Burada, bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasında PPIs çalışmaya açıklar. Kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi kavramının bir kanıtı olarak gösterilir. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve hipoksik koşullarda transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimleri gösteren için uygundur dahil ama bunlarla sınırlı olmamak üzere kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması.

Protokol

İnsan embriyonik böbrek 293A kullanır bu protokolü bölüm (HEK293A) hücre, s insan Araştırma Etik Komitesi Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur ve kuralları izler.

1. indüksiyon HEK293A hücrelerindeki hipoksi

  1. Dört 10 cm yemekleri ve tohum 3-5 x 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM, 4,5 g/M glikoz) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 2 mM L-glutamin, takıma çanak başına 106 HEK293A hücre hazırlamak 110 mg/L sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin. Bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka hücrelerde kültür.
    Not: Hücre tohum bir biyolojik güvenlik kabini (BSC) yapılmalıdır. BSC yerleştirilmesi için tüm malzemeler yüzeylerin % 70 etanol ile sildi.
  2. tohum sonra 24 h hücreleri % 80-90 confluency, ulaştığında kuluçka torpidoda hipoksi subchamber içine iki tabak koymak ( Tablo malzemelerigörmek) ve O % 12 ile % 5 CO2 37 ° C ve diğer iki normoxia (% 21 O yemekleri tutun 2, 37 ° C'de % 5 CO2 ) 4 h için bir dizi normoxic ve hipoksik hücrelerin hipoksi tedavi tarafından western blot değerlendirmek ve diğer co-immunoprecipitation deneyleri için hücre kümesi kullanmak için kullanın.
    Not: Oksijen düzeyleri ayarlanabilir 0-%5 ve hipoksi tedavi süresi hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir ve çalışma amacı.

2. tüm cep telefonu ve nükleer çıkarma

Not: Bu protokol için kullanılan arabellekleri hakkında bilgi için bkz. Tablo 1 .

  1. Normoxia kontrol hücreleri hasat.
    1. Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) hücrelerle durulama 10 mL pipet kullanarak.
      Not: pipet ile hücre monolayer dokunmaktan kaçının. Yıkama sırasında hücre kaybı önlemek için DPBS hücre kültür plaka duvar aşağı yavaşça pipette.
    2. 5 mL pipet plaka içine buz gibi DPBS ve buz gibi PBS plaka yüzeyi kapalı hücre hücre sıyırıcı kazıyorum.
    3. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve buz üzerinde tutun.
  2. Hipoksik koşullarda kültürlü hücre hasat.
    1. Hipoksik koşullarına DPBS hipoksi subchamber (%1 O2 ve %5 CO2 37 ° C'de) DPBS dolu bir ele geçen 100 mL deneme cam reaktif şişe için 24 saat önceden yerleştirerek önceden equilibrate.
    2. Tedavi hipoksi hücre hasat öncesinde yaklaşık 1 h %1 O2 ve %5 CO2equilibrated torpidoda işleme TMMOB buza içeren bir buz kutusu yerleştirin. Hipoksi subchamber üzerinden önceden dengelenmiş hipoksik DPBS işlem odasına içeren şişe aktarmak ve buza koyun.
    3. hipoksi tedavi, aşağıdaki 4 h %1 O2 ve %5 CO2önceden dengelenmiş oldu işlem odasına hipoksi subchamber hücreleri aktarın.
    4. Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve hücreleri ile 10 mL 10 mL ile buz gibi önceden dengelenmiş hipoksik DPBS pipet sonra durulayın.
    5. 5 mL 5 mL ile buz gibi önceden dengelenmiş DPBS pipet ve hücreleri hücre sıyırıcı kazıma çıkarmak ekleyin.
    6. Hücre kültür plaka eğilme ve 10 mL pipet kullanarak müstakil hücreleri toplamak. DPBS hücre süspansiyon 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve buz üzerinde tutun.
    7. İkisi de % 1 O2 ve %5 için CO2önceden dengelenmiş olmuştur işleme ve tampon odaları torpidoda arası kapıyı açın. 15 mL Konik Boru işleme odası tedavi hipoksi hücrelerden arabellek odasına içeren buz aktarmak. Arabellek odası kapıyı açıp hücreleri tamamen torpidoda kaldırmak.
  3. Santrifüjü 1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından hem 2.1 normoxic hücrelerden ve 2.2 hipoksik hücrelerden cips
  4. Bütün hücre özleri hazırlayın.
    1. Buz gibi radyo immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabelleği 50 mM Trisaminomethane hidroklorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM sodyum klorür (NaCl), % 1 tergitol tipi NP-40 (NP-40), % 0.5 sodyum deoxycholate, içeren 500 µL hücre granül resuspend ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile takıma % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), ( Tablo malzemelerigörmek) hücre topakları yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından.
    2. Hücre lysates yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarmak ve ara sıra vortexing ile 30 dk için buz üzerinde tutun.
    3. Hücre lysates 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi
    4. Süpernatant, aliquot 50 µL süpernatant ile 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak ve-80 ° C'de depolayın
  5. Nükleer bir çıkarma kullanarak nükleer özleri hazırlayın (tablo malzemeleri görmek) kit.
    1. Yavaşça lizis arabellek NL 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 0.1 M dithiothreitol (DTT) ile takıma 500 µL hücre granül hücre topakları yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından resuspend.
    2. Hücre süspansiyon ve 10 için girdap deterjan solüsyonu NP 25 µL eklemek s maksimum hızda.
    3. 4 ° C'de 5 min için 10.000 x g , santrifüj
    4. Süpernatant (sitoplazmik özler), aliquot 50 µL süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüpler, içine, toplamak ve-80 ° C'de depolayın
    5. Hücre çekirdeği içinde 500 µL lizis arabelleği için 5 vortexing 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 0.1 M DTT ile desteklenmiştir NL içeren pelet resuspend s maksimum hızda.
    6. 10.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve nükleer Pelet kaydedin.
    7. Nükleer Pelet ayıklama arabellek 1 proteaz inhibitörü kokteyl x ile yukarı ve aşağı birkaç kez Pelet pipetting takıma NX1 50 µL resuspend.
    8. Kuluçkaya buz üzerinde 30 dk, vortexing 10 s maksimum hızda her 5 dak.
    9. 4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g , santrifüj
  6. Nükleer özler desalt.
    1. Süpernatant birim başına 100 µL maksimum hacmi ile mini diyaliz cihazların içine adım 2.5.9 ve transfer toplamak.
    2. Mini Diyaliz cihazları kap ve bir can kurtarma aleti koyun.
    3. Can kurtarma aleti önceden soğutulmuş diyaliz arabelleği (20 mM Tris-HCl pH 7.4, % 20 gliserol, 100 mM potasyum klorür (KCl), 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 0.2 mM phenylmethylsulfonyl Flor (PMSF) ve 0,5 mM DTT) 500 mL içeren bir ölçek koymak ve nazik karıştırma ile 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
      Dikkat: PMSF zararlıdır. Cilt veya inhalasyon ile doğrudan temas önlemek.
    4. Mini Diyaliz cihazları köşesinden örnekleri toplamak ve yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın.
    5. 12.000 x g 4 ° c, aliquot 25 µL her süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüp içine, 10 min için de santrifüj kapasitesi ve-80 ° C'de depolayın

3. Protein ifade ve kurulan-1α hücre altı yerelleştirme hipoksi tedavisi algılama tarafından değerlendirilmesi

  1. Tüm cep telefonu protein konsantrasyonu belirlemek veya nükleer/sitoplazmik Mikroplaka tahlil kitinin bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil üreticisinin yönergeleri18göre kullanarak ayıklar.
  2. 1 x Laemmli örnek arabelleği %5 2-Mercaptoethanol içeren hücre lysates sulandırmak ve 95 ° c 5 dakika kaynatın.
    Uyarı: yanıklara neden beri Isıtma blok yüzeyine dokunmayın.
  3. Proteinler Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez tarafından (SDS-sayfa) ayırın.
    1. Protein (25 µg) eşit miktarda bir SDS-sayfa prekast degrade jelleri (4-%20), her kuyuya molekül ağırlığı işaret 3 µL ile birlikte yükleyin.
    2. Jel içeren 2.5 mM Tris, 19.2 mM glisin, % 0,01 SDS, PH8.3 200 V 30 dk için arabellek çalıştırma.
  4. Jel üzerinden protein nitroselüloz membran için transfer.
    1. Transfer sandviç (filtre kağıdı-jel-membran-filtre kağıdı) jel ile anot tarafı ve kaset katot tarafındaki membran üzerinde topla.
    2. 2.5 mM trisaminomethane (Tris), 19.2 mM glisin ve % 20 metanol içeren aktarım arabellek ile dolu transfer tankı kaset yerleştirin.
      Dikkat: Metanol yanıcı ve yanıcı sıvı depolama kabine içinde saklanmalıdır.
    3. Transfer için 1 h 100 V soğuk oda içinde yerine getirir.
  5. 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, bir shaker üzerinde oda sıcaklığında 1 h için 0,1 ara 20 ve % 5 yağsız süt içeren 10 mL engelleme arabellek blot engelleyin.
  6. Gecede 4 ° C'de aynı engelleme arabellekte anti-kurulan-1α antikor (1/500 seyreltme) ile leke kuluçkaya
  7. Leke 50 mL TBS-T. ile her zaman 5 min için 3 kez yıkamak
  8. Leke horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Konjüge ikincil antikor (1/1000 seyreltme) 10 mL TBS-T içeren % 5 Sigara yağlı kuru süt oda sıcaklığında 1 h için.
  9. Leke 50 mL TBS-T. ile her zaman 5 min için 3 kez yıkamak
  10. Mix 500 µL her, gelişmiş chemilumescent (ECL) Reaktif A ve B 1.5 mL microcentrifuge tüp ve girdap kısa bir süre içinde.
  11. ECL substrat leke için geçerli ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
  12. Bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tabanlı görüntüleme sistemi kullanarak chemiluminescent sinyalleri yakalamak.
    1. Kağıt mendil ile membran kenarına dokunarak aşırı ECL substrat drenaj ve bir levha koruyucu membran yerleştirin.
    2. Membran kamera tabanlı görüntüleme sistemi CCD örnek tepsiye yerleştirin.
    3. Görüntü işleme yazılımı başlatmak ( Tablo malzemelerigörmek) ve aşağıdaki ayarlarla çekim: → yeni protokol → tek kanal → protokolü Kur → jel görüntüleme dosya (uygulama: kimya; Görüntüleme alanı: Bio-Rad hazır jel; Pozlama: görüntüleme Yazılımı otomatik olarak yoğun bantları için çekim hızı optimize eder) → Çalıştır iletişim kuralı
      Not: Çekim hızı en iyi görüntüleri elde etmek için el ile ayarlanabilir.

4. Immunoprecipitation ve algılama Immunoprecipitated proteinlerin

  1. TBS arabelleği 1.5 mL microcentrifuge tüpler 500 µL protein A/G sepharose boncuk 50 µL yıkayın ve boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından cips
  2. Süpernatant atın ve boncuk TBS arabellek 100 µL içinde resuspend.
  3. Fare monoklonal anti-ARNT antikor (1,4 mg/mL) veya fare immünoglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL) 0.7 mg fare IgG 500 µL TBS arabelleği başlamaktan tarafından hazırlanan 2 µL ekleyin.
  4. Bir tüp rotator boncuklar içeren 1.5 mL microcentrifuge tüpler yerleştirin ve soğuk odada 10 rpm'de 2 h için kuluçkaya.
    Not: tüpler yavaşça işlemek ve tüpün dibinde boncuk içeren süspansiyon tutun.
  5. Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından boncuk cips ve supernatants atın.
  6. Nükleer protein lysate 180 mM NaCl, % 20 gliserol, % 0,2 NP-40 ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), oluşan IP arabellek adım 2.6.5 800 µL içinde elde edilen 200 µg sulandırmak. Adım 4.5 gecede 4 ° C'de elde antikor birleştiğinde boncuk ile lysate kuluçkaya
  7. Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından boncuk cips, supernatants atmak ve 3 kez ile 1 mL boncuk yıkama buz gibi TBS % 0,2 içeren NP-40.
  8. Boncuk 50 µL Laemmli örnek arabelleği 95 ° c 5 dakika kaynatın.
  9. 10.000 x g 4 ° C'de 5 min için de boncuk santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve boncuk atmak.
    Not: Süpernatant 4 ° C-20 ° C veya kısa vadeli için uzun süre saklanabilir.
  10. Daha önce açıklandığı adım 3.3 itibaren Batı leke tarafından kurulan-1α olup olmadığını immunoprecipitated protein kompleksleri gelen belirlemek.
    Not: Protein miktar için bu adım gerekli değildir. Tam birim (50 µL) SDS-sayfa prekast degrade jelleri (4-%20) her kuyuya her örnek süpernatant yük

Sonuçlar

Hücresel yanıt hipoksi, ifade olarak değerlendirmek için düzeyleri ve kurulan-1 karmaşık aşağıdaki hipoksi tedavi bileşenlerinin hücre altı yerelleştirme incelenmiş. HEK293A hücreleri 4 h için hipoksik koşullarda kültürlü veya normoxia denetimler olarak devam etti. Bütün hücre içinde kurulan-1α ve ARNT protein düzeyleri incelenmiş veya nükleer/sitoplazmik tarafından western blot ayıklar. Toplam hücresel lysates ARNT düzeyleri önemli ölçüde değildi, an...

Tartışmalar

Kurulan-1 karmaşık Hücresel oksijen homeostazı bir ana Regülatörü ve genlerin farklı hücresel adaptif yanıt-e doğru hipoksi katılan bir bolluk düzenler. Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinler hipoksik sinyal iletimi anlamak için önemlidir. Co-immunoprecipitation deneyleri genellikle PPIs çalışmaları için hücresel sinyal iletim yollarının betimlemek için kullanılır. Ancak, protein overexpression hala yaygın olarak kullanılır ve bu deneysel eserler yol açabilir. Buna ek olarak, kurulan...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Dr. günah Tiong Ong hipoksi iş istasyonu kullanım için teşekkür ederiz. Bu eser aşağıdaki tarafından desteklenmiştir: Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, MOE 1T1-02/04 ve MOE2015-T2-2-087 (için içeride), Lee Kong Chian Okulu tıp, Nanyang Teknoloji Üniversitesi açılış hibe M4230003 (P.O.B.), İsveçli Araştırma Konseyi Aile Erling Persson Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Stichting af Jochnick Vakfı, İsveç Diyabet Derneği, Scandia sigorta şirketi, diyabet araştırma ve Sağlık Vakfı, yatak von Kantzow'ın Vakfı, Diyabet, Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı Stratejik araştırma programı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 1st BASE1415
Protein A/G Sepharose beadsAbcamab193262
Natural Mouse IgG proteinAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
Nitrocellulose Membrane   Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling7076
SignalFire ECL ReagentCell Signaling6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineCorning21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody Novus BiologicalsNB100-124 Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha AntibodyNovus BiologicalsNB100-479Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 AntibodyNovus BiologicalsNBP1-46218Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH AntibodySanta Cruzsc-47724Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%)SigmaG5516
Potassium chlorideSigmaP9541
RIPA bufferSigmaR0278
Sodium Chloride (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A cell lineThermo Fisher ScientificR70507
Methanol Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QSP gel loading tip Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioTekBTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological PipetsCorning4487
Costar 10mL Stripette Serological PipetsCorning4488
Costar 25mL Stripette Serological PipetsCorning4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene MicroplatesCorning3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge TubesCorning352095
Small Cell ScraperCorning3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge TubesGreiner Bio-One 616201
PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage CabinetsJustrite Manufacturing Co.896000
Vortex mixerLabnetS0200
CO2 incubatorNuAireNU-5820
Orbital shakersStuartSSL1
Tube rotator SB3StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrifugeThermo Fisher Scientific75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DeviceThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DevicesThermo Fisher Scientific69588
LSE Digital Dry Bath HeatersThermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety CabinetsThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691

Referanslar

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 138molek ler biyolojico immunoprecipitationprotein protein etkile imleri PPIshipoksihipoksi ind klenebilir fakt rler HIFsendojen proteinlern kleer zler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır