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Neste Artigo

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Resumo

Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação para estudar interações da proteína-proteína entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. Este método é adequado para demonstração das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em hipóxia.

Resumo

Baixos níveis de oxigênio (hipóxia) desencadear uma variedade de respostas adaptativas com o Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complexos atuando como um regulador de mestre. HIF-1 consiste de uma subunidade α oxigênio-regulado de heterodimérica (HIF-1 α) e constitutivamente expressa a subunidade beta (HIF-1 β) também conhecido como aril hidrocarboneto do receptor nuclear translocator (ARNT), regulação de genes envolvidos em diversos processos, incluindo a angiogênese , eritropoiese e glicólise. A identificação das proteínas de interação de HIF-1 é a chave para a compreensão da hipóxia via de sinalização. Além do Regulamento de HIF-1 α estabilidade, a hipóxia também aciona a translocação nuclear de muitos fatores de transcrição, incluindo HIF-1 α e ARNT. Notavelmente, a maioria dos atuais métodos utilizados para estudar tais interações da proteína-proteína (PPIs) é baseada em sistemas onde os níveis de proteína são artificialmente aumentados através da superexpressão da proteína. Superexpressão da proteína, muitas vezes leva a resultados não-fisiológicos decorrentes de artefatos temporais e espaciais. Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação modificada após o tratamento de hipóxia usando proteínas nucleares endógenas e como uma prova de conceito, para mostrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT de protocolo. Neste protocolo, as células hipóxicos foram colhidas em condições de hipóxicos e tampão de lavagem de o Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) também foi previamente equilibrado a hipoxia condições antes do uso para mitigar a degradação de proteína ou proteína complexa dissociação durante a reoxigenação. Além disso, as frações nucleares foram posteriormente extraídas para concentrar e estabilizar proteínas nucleares endógenas e evitar possíveis resultados espúrios muitas vezes vistos durante a superexpressão da proteína. Este protocolo pode ser usado para demonstrar endógenas e nativas de interações entre fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos.

Introdução

Hipóxia ocorre quando insuficiente oxigênio é fornecido para as células e tecidos do corpo. Desempenha um papel crítico em vários processos fisiológicos e patológicos, tais como a diferenciação de células-tronco, inflamação e câncer1,2. Hypoxia-inducible fatores (transplanta) funcionam como heterodímeros, compostos por uma subunidade α oxigênio-regulado e uma subunidade β constitutivamente expressa ARNT também conhecido como3. Até à data, foram identificadas três isoformas de três subunidades de HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) e as subunidades de HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3α). HIF-1 α e ARNT ubiquitously são expressos, Considerando que o HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 e ARNT3 têm mais restrito de padrões de expressão4. A complexo de proteína HIF-1 é o regulador chave da resposta hipoxia. Em condições de hipóxicos, HIF-1 α torna-se estabilizado, então translocates ao núcleo e dimeriza com ARNT5. Posteriormente, este complexo liga de nucleotídeos específicos conhecidos como elementos responsivos de hipóxia (HREs) e regula a expressão de genes-alvo envolvidos nos diversos processos, incluindo a angiogênese, eritropoiese e glicólise6. Além desta resposta "canônica", a via de sinalização de hipóxia é também conhecida por crosstalk com múltiplas resposta celular, sinalização de vias como entalhe e Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.

A identificação das proteínas de interação romance HIF-1 é importante para uma melhor compreensão da hipóxia via de sinalização. Em contraste com ARNT, que é insensível aos níveis de oxigênio e constitutivamente expressa, níveis de proteína HIF-1 α estão fortemente regulamentados pelos níveis de oxigênio celular. No normoxia (21% de oxigênio), proteínas de HIF-1 α são rapidamente degradadas10,11. A meia-vida curta de HIF-1 α no normoxia apresenta desafios técnicos específicos para a deteção da proteína da célula extratos, bem como para a identificação das proteínas HIF-1 α-interagindo. Além disso, vários fatores de transcrição, incluindo aqueles do complexo HIF-1 translocar para o núcleo sob condições de hipóxia12,13,14. A maioria dos atuais métodos utilizados para estudos PPI é executada usando não-fisiológica superexpressão de proteínas. Tal superexpressão da proteína foi relatado para causar defeitos celulares diferentes através de vários mecanismos, incluindo a sobrecarga de recursos, desequilíbrio estequiométrico, interações promíscuas e via modulação15,16. Em termos de estudos PPI, a superexpressão da proteína pode levar a falso negativo positivo, ou mesmo falso, resultados, dependendo das propriedades da proteína e funções das proteínas Blumental. Portanto, os métodos atuais para estudos PPI tem que ser modificado a fim de revelar o IPP fisiologicamente relevantes sob condições de hipoxia. Nós demonstramos anteriormente a interação entre o HIF-1 e o fator de transcrição família Ets GA-proteína (GABP) em células de P19 hipóxicos, que contribui para a resposta do promotor Hes1 à hipóxia17. Aqui, descrevemos um co-imunoprecipitação para estudar PPIs entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. A interação entre o HIF-1 α e ARNT é mostrada como uma prova de conceito. Este protocolo é apropriado para demonstrar as interações entre os fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos, incluindo mas não limitado à identificação das proteínas de interação de HIF-1.

Protocolo

Esta seção de protocolo, que usa o rim embrionário humano 293A célula (HEK293A), s segue as diretrizes do Comitê de ética pesquisa humana em Nanyang Technological University, Singapore.

1. indução de hipóxia em células HEK293A

  1. Prepare-se quatro pratos de 10cm e sementes de 3 – 5 x 106 HEK293A células por prato em 10 mL Dulbecco modificado suplementado do Eagle (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio de 110 mg/L, 100 U/mL penicilina e 100 mg / estreptomicina mL. Cultura de células em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
    Nota: Célula semeadura deve ser realizada em uma câmara de segurança biológica (CSB). As superfícies de todos os materiais sejam colocados o BSC devem ser limpo com álcool 70%.
  2. 24 h após a semeadura, quando as células têm alcançado a confluência de 80-90%, colocou dois pratos a hipóxia subchamber no porta-luvas incubadora (ver Tabela de materiais) com 1% de O2 e 5% CO2 a 37 ° C e manter os outros dois pratos no normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) por 4 h. usar um conjunto de células hipóxicos e normoxic para avaliar o tratamento de hipóxia por western blot e utilizar o outro conjunto de células para as experiências de co-imunoprecipitação.
    Nota: Os níveis de oxigênio podem ser definidos em 0 – 5% e a duração do tratamento a hipóxia pode ser variado dependendo do tipo de célula e estudo objetivo.

2. toda célula e extração Nuclear

Nota: Consulte a tabela 1 para obter informações sobre buffers usados no presente protocolo.

  1. As células de controle de normoxia da colheita.
    1. Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células com 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) utilizando uma pipeta de 10 mL.
      Nota: Evite tocar a monocamada de células com a pipeta. Durante a lavagem, pipete suavemente o DPBS abaixo o muro da placa de cultura de células para evitar a perda de células.
    2. Pipetar 5 mL DPBS gelada na placa e raspe as células da superfície da placa em PBS gelado com um raspador de célula.
    3. Transferir a suspensão de eritrócitos para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.
  2. Colha as células cultivadas em condições de hipóxicos.
    1. Pre-equilibrar a DPBS às condições de hipóxicos, colocando um descoberta 100 mL experimento reagente frasco de vidro cheio de DPBS no subchamber de hipóxia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) por 24 h de antecedência.
    2. Aproximadamente 1 h antes da colheita de células a hipóxia tratada, coloque uma caixa de gelo contendo gelo na câmara de processamento do porta-luvas, que a solução foi equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2. O frasco contendo a pre-equilibrado DPBS hipóxica da hipóxia subchamber para a câmara de processamento de transferência e colocá-lo no gelo.
    3. 4 h após o tratamento de hipóxia, transferir as células de subchamber a hipóxia para a câmara de transformação que tem sido pre-equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2.
    4. Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células uma vez com 10 mL geladas DPBS hipóxicos pre-equilibradas com um 10 mL pipeta.
    5. Adicione 5 mL geladas DPBS pre-equilibradas com um 5 mL pipeta e desalojar as células por raspagem com uma espátula de célula.
    6. Inclinação da placa de cultura de células e coletar as células desanexadas usando uma pipeta de 10 mL. Transferir a suspensão de eritrócitos em DPBS para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.
    7. Abra a porta entre as câmaras processamento e tampão do porta-luvas, as quais foram previamente equilibradas para 1% O2 e 5% de CO2. Transferi os tubos cônico de 15 mL contendo células de hipóxia tratada da câmara de processamento para a câmara de tampão de gelo. Abra a porta da câmara reserva e remova completamente as células no porta-luvas.
  3. Pelota tanto as células normoxic de 2.1 e as células hipóxicos de 2.2 por centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C.
  4. Prepare a célula inteira extratos.
    1. Resuspenda as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de lise do ensaio (RIPA) imunoprecipitação rádio gelada contendo 50 mM pH cloridrato de Trisaminomethane (Tris-HCl) 8.0, 150 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1% preparar-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% de sódio Deoxycholate do, e 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS), suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease (ver Tabela de materiais) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.
    2. Transferir os lisados celulares para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e manter no gelo por 30 min com ocasional num Vortex.
    3. Centrifugue os lisados celulares a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    4. Recolher o sobrenadante, alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.
  5. Preparar os extratos nucleares usando uma extração nuclear kit (veja a tabela de materiais).
    1. Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M ditiotreitol (DTT) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.
    2. Adicione 25 µ l de solução detergente NP para a suspensão de células e vórtice para 10 s na velocidade máxima.
    3. Centrifugação a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C.
    4. O sobrenadante (extratos citoplasmáticos), alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga, de coletar e armazenar a-80 ° C.
    5. Resuspenda o pellet contendo núcleos de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M DTT vortexing para 5 s na velocidade máxima.
    6. Centrifugar a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C e salvar a pelota nuclear.
    7. Resuspenda o pellet nuclear em 50 µ l de Buffer de extração NX1 suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease pipetando a pelota subindo e descendo várias vezes.
    8. Incubar durante 30 min no gelo, num Vortex para 10 s cada 5 min na velocidade máxima.
    9. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.
  6. Do desalt os extratos nucleares.
    1. Recolha o sobrenadante da etapa 2.5.9 e transferência para os dispositivos de diálise mini com um volume máximo de 100 µ l por unidade.
    2. Tampe os dispositivos mini diálise e colocá-los em um dispositivo de flutuação.
    3. Colocar o dispositivo de flutuação em um béquer contendo 500 mL de tampão de diálise pre-refrigerados (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% de glicerol, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 0,2 ácido etilenodiaminotetracético de mM (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoreto (PMSF) e 0,5 mM DTT) e incube por 30 min a 4 ° C, com agitação suave.
      Cuidado: PMSF é perigosa. Evite o contato direto com a pele ou por inalação.
    4. Coletar as amostras do canto dos dispositivos mini diálise e transferir para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.
    5. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C, alíquota 25 µ l de cada sobrenadante para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.

3. avaliação do tratamento hipóxia por detecção da expressão da proteína e localização Subcellular de HIF-1 α

  1. Determinar a concentração de proteína da célula inteira ou nuclear/citoplasmática extrai usando o ensaio de microplacas de bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio kit de acordo com as instruções de18 do fabricante.
  2. Diluir os lisados celulares em 1 x Laemmli amortecedor da amostra contendo 5% 2-Mercaptoetanol e ferva a 95 ° C por 5 min.
    Cuidado: Não toque na superfície do bloco de aquecimento, uma vez que pode causar queimaduras.
  3. Separe as proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE).
    1. Carrega quantidades iguais de proteínas (25 µ g) em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%), juntamente com 3 µ l do marcador de peso molecular.
    2. Funcione o gel em marcha tampão contendo 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 por 30 min a 200 V.
  4. Transferi as proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose.
    1. Monte o sanduíche de transferência (papel de filtro-gel-membrana-filtro de papel) com o gel do lado do ânodo e a membrana do lado do cátodo da fita.
    2. Coloque a fita no tanque de transferência preenchido com buffer de transferência contendo 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% de metanol.
      Cuidado: O metanol é inflamável e deve ser armazenado dentro do armário de armazenamento líquido inflamável.
    3. Efectue a transferência para 1 h a 100 V na sala fria.
  5. Bloquear o borrão em 10 mL de tampão de bloqueio contendo 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% leite desnatado por 1h à temperatura ambiente em um shaker.
  6. Incubar o blot com anticorpo anti-HIF-1 α (diluição de 1/500), a mesma reserva de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
  7. Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.
  8. Incubar o blot com peroxidase de rábano (HRP)-anticorpo secundário conjugado (diluição de 1/1.000) em 10 mL TBS-T contendo 5% desnatado leite seco por 1h à temperatura ambiente.
  9. Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.
  10. Mix de 500 µ l cada de chemilumescent reforçada (ECL) reagente A e B em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice brevemente.
  11. Aplicar o substrato ECL para o Borrão e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
  12. Capture os sinais quimioluminescente usando um dispositivo de carga acoplada (CCD) sistema de imagens baseado em câmera.
    1. Escorra o excesso substrato ECL tocando a borda da membrana com um papel absorvente e colocar a membrana em um protetor de folha.
    2. Coloque a membrana sobre a bandeja de amostra do CCD sistema de imagens baseado em câmera.
    3. Lançar o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais) e capturar as imagens com as seguintes configurações: arquivo → novo protocolo → único canal → configuração protocolo → Gel de imagem (aplicativo: Chemi; Área da imagem: Gel pronto Bio-Rad; Exposição de imagens: O software automaticamente irá otimizar o tempo de exposição para intensas bandas) protocolo de execução →
      Nota: O tempo de exposição pode ser ajustado manualmente para conseguir as imagens ideais.

4. imunoprecipitação e detecção de proteínas de Immunoprecipitated

  1. Lave a 50 µ l de grânulos de proteína A/G sepharose em 500 µ l de tampão TBS em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C.
  2. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as contas em 100 µ l de tampão TBS.
  3. Adicione 2 µ l de anticorpo monoclonal anti-ARNT de rato (1,4 mg/mL) ou mouse imunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) que foi preparado pela reorganização do mouse 0,7 mg IgG no buffer TBS 500 µ l.
  4. Coloque os tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo os grânulos em um rotador de tubo e incubar durante 2 h a 10 rpm na sala fria.
    Nota: Lidar com os tubos suavemente e manter a suspensão contendo os grânulos no fundo do tubo.
  5. Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.
  6. Dilua 200 µ g da proteína nuclear lisada obtida na etapa 2.6.5 em 800 µ l de buffer IP consistindo de 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM de NaCl, 20% de glicerol, 0,2% x NP-40 e 1 inibidor da protease cocktail. Incubar o lisado com os grânulos de anticorpos acoplados obtidos na etapa 4.5 durante a noite a 4 ° C.
  7. Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C, descartar os sobrenadantes e lave os grânulos 3 vezes com 1 mL gelada TBS contendo 0,2% NP-40.
  8. Ferva os grânulos em 50 amortecedor da amostra Laemmli µ l a 95 ° C por 5 min.
  9. Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e descartar os grânulos.
    Nota: O sobrenadante pode ser armazenado a 4 ° C para o curto prazo ou a-20 ° C, a longo prazo.
  10. Detecta a presença de HIF-1 α partir os complexos de proteína immunoprecipitated pelo borrão ocidental, conforme descrito no passo 3.3 em diante.
    Nota: A quantificação da proteína não é necessária para esta etapa. Carregar o volume completo (50 μL) do líquido sobrenadante de cada amostra em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%)

Resultados

Para avaliar a resposta celular a hipóxia, a expressão de níveis e Localização subcellular dos componentes do tratamento de hipóxia seguir HIF-1 complexo foram examinados. HEK293A as células foram cultivadas em condições de hipóxicos para 4h ou mantidos no normoxia como controles. Níveis de proteína HIF-1 α e ARNT foram examinados no celular ou nuclear/citoplasmática extrai pelo borrão ocidental. Como esperados, totais de níveis de HIF-1 α foram upregulated por hipóxia, ...

Discussão

O complexo HIF-1 é um mestre regulador da homeostase celular oxigênio e regula uma infinidade de genes envolvidos em diferentes respostas adaptativas celulares à hipoxia. Identificação de novas proteínas de interação de HIF-1 é importante para a compreensão da transdução de sinal de hipoxia. Co-imunoprecipitação experimentos são comumente usados para estudos de IPP para delinear as vias de transdução de sinal de celular. No entanto, superexpressão de proteínas é ainda amplamente utilizada e isso pode ...

Divulgações

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos o Prof Assoc. Sin Tiong Ong para a utilização da estação de hipóxia. Este trabalho foi apoiado pelo seguinte: Singapura Ministério da educação, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (para cá), Lee Kong Chian da faculdade de medicina, Universidade Tecnológica de Nanyang arranque grant M4230003 (p.o.b.), o Conselho Sueco de pesquisa, o Erling Persson Fundação da família, a Novo Nordisk Foundation, o Stichting af Jochnick Foundation, associação sueca de Diabetes, a companhia de seguros Scandia, a pesquisa do Diabetes e Wellness, Fundação do cais von Kantzow, o Programa de investigação estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e a Fundação de Wallenberg Alice e Knut.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 1st BASE1415
Protein A/G Sepharose beadsAbcamab193262
Natural Mouse IgG proteinAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
Nitrocellulose Membrane   Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling7076
SignalFire ECL ReagentCell Signaling6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineCorning21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody Novus BiologicalsNB100-124 Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha AntibodyNovus BiologicalsNB100-479Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 AntibodyNovus BiologicalsNBP1-46218Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH AntibodySanta Cruzsc-47724Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%)SigmaG5516
Potassium chlorideSigmaP9541
RIPA bufferSigmaR0278
Sodium Chloride (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A cell lineThermo Fisher ScientificR70507
Methanol Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QSP gel loading tip Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioTekBTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological PipetsCorning4487
Costar 10mL Stripette Serological PipetsCorning4488
Costar 25mL Stripette Serological PipetsCorning4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene MicroplatesCorning3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge TubesCorning352095
Small Cell ScraperCorning3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge TubesGreiner Bio-One 616201
PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage CabinetsJustrite Manufacturing Co.896000
Vortex mixerLabnetS0200
CO2 incubatorNuAireNU-5820
Orbital shakersStuartSSL1
Tube rotator SB3StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrifugeThermo Fisher Scientific75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DeviceThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DevicesThermo Fisher Scientific69588
LSE Digital Dry Bath HeatersThermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety CabinetsThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691

Referências

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

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