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摘要

在这里, 我们描述了一个共同免疫沉淀协议, 研究在缺氧条件下内源核蛋白的蛋白质相互作用。该方法适用于低氧转录因子与转录联合调节剂相互作用的证明。

摘要

低氧水平 (缺氧) 触发多种适应反应与缺氧诱导因子 1 (HIF-1) 复合体作为主调节器。HIF-1 由 heterodimeric 氧调节α亚基 (HIF-1α) 和组成性表达的β亚基 (HIF-1β) 也称为芳烃受体核转运体 (ARNT), 调节包括血管生成在内的不同过程中所涉及的基因、红细胞和糖酵解。HIF-1 相互作用蛋白的鉴定是了解缺氧信号通路的关键。除了调节 HIF-1α稳定性外, 缺氧还触发了许多转录因子的核易位, 包括 HIF-1α和 ARNT。值得注意的是, 目前用于研究这种蛋白质-蛋白质相互作用 (PPIs) 的方法大多是基于那些通过蛋白质过度表达人为地增加蛋白质水平的系统。蛋白质过度表达往往导致非生理结果的时间和空间文物。在这里, 我们描述了在低氧治疗后使用内源核蛋白的改进的免疫沉淀协议, 并作为概念的证明, 以显示 HIF-1α和 ARNT 之间的相互作用。在本议定书中, 缺氧细胞是在缺氧条件下收获的, Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 洗涤缓冲液也在使用前平衡缺氧条件, 以减轻蛋白质降解或蛋白质复合体复氧过程中的离解。此外, 核分数随后提取, 以集中和稳定内源性核蛋白, 并避免可能的假结果往往看到在蛋白质过度表达。该协议可用于证明转录因子与转录联合调节器在缺氧条件下的内源和本机相互作用。

引言

缺氧发生时, 没有足够的氧气供应给细胞和组织的身体。它在各种生理和病理过程中起着关键作用, 如干细胞分化、炎症和癌症1、2。缺氧诱导因子 (HIFs) 功能, heterodimers 由氧调节α亚基和组成性表达β亚基也称为 ARNT3。迄今已确定了 HIF α亚基 (HIF-1α、HIF-2α和 HIF-3α) 和三个 HIF β亚基 (ARNT/HIF-1β、ARNT2 和 ARNT3) 的三种异构体。HIF-1α和 ARNT 是无所不在表达的, 而 HIF-2α、HIF-3α、ARNT2 和 ARNT3 有更限制性的表达模式4。HIF-1 蛋白复合物是缺氧反应的关键调节因子。在缺氧条件下, HIF-1α变稳定, translocates 至细胞核, dimerizes ARNT5。随后, 这一复杂的结合到特定的核苷酸称为缺氧反应元素 (HREs), 并调节所涉及的目标基因的表达, 包括血管生成, 红细胞和糖酵解6。除了这种 "规范" 的反应, 缺氧信号通路也被称为串扰多细胞反应信号通路, 如缺口和核因子-卡伯 B (NF-nf-κb)7,8,9。

新的 HIF-1 相互作用蛋白的鉴定对于更好地理解缺氧信号通路是很重要的。与 ARNT, 这是不敏感的氧气水平和组成性表达, HIF-1α蛋白质水平是严格调节细胞氧水平。在 normoxia (21% 氧), HIF-1α蛋白质迅速退化10,11。HIF-1α在 normoxia 的短半衰期为细胞提取物中蛋白质的检测以及 HIF-1α-interacting 蛋白的鉴定提供了具体的技术挑战。此外, 一些转录因子, 包括那些 HIF-1 复合体植物常常将进入细胞核的缺氧条件下12,13,14。目前用于 PPI 研究的大多数方法都是使用非生理的蛋白质过度表达来进行的。这种蛋白过度表达通过多种机制 (包括资源超载、化学计量失衡、混杂相互作用和通路调制15、16) 引起了不同的细胞缺陷。在 PPI 研究方面, 蛋白质过度表达可能导致假阳性, 甚至是假阴性, 结果取决于蛋白质的性质和功能的抗原蛋白。因此, 目前的 PPI 研究方法必须修改, 以揭示在缺氧条件下的生理相关 PPIs。我们以前已经证明了 HIF-1 和 Ets 家族转录因子遗传结合蛋白 (GABP) 在缺氧 P19 细胞中的相互作用, 这有助于Hes1启动子对缺氧17的反应。在这里, 我们描述了一个共同免疫沉淀协议, 研究 PPIs 之间的内源性核蛋白在缺氧条件下。HIF-1α与 ARNT 的相互作用表现为概念的证明。该协议适用于证明转录因子与转录联合调节器在缺氧条件下的相互作用, 包括但不限于 HIF-1 相互作用蛋白的鉴定。

研究方案

本协议部分采用人类胚胎肾脏 293A (HEK293A) 细胞, 遵循新加坡南洋理工大学人类研究伦理学委员会的指导方针。

1. HEK293A 细胞缺氧的诱导

  1. 准备四10厘米的菜肴和种子 3–5 x 106 HEK293A 细胞每盘在10毫升 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM, 4.5 克/升葡萄糖) 辅以10% 胎牛血清 (血清), 2 毫米 l-谷氨酰胺, 110 毫克/升丙酮钠, 100 U/毫升青霉素和100毫克/链霉素。培养细胞在37°c, 5% CO2孵化器。
    注: 细胞播种应在生物安全柜 (BSC) 进行。要放置在平衡计分卡上的所有材料的表面应用70% 乙醇擦拭。
  2. 24小时播种后, 当细胞达到80–90% 融合时, 将两个盘子放入孵化 glovebox 中的缺氧 subchamber (见材料表) 与 1% O2和 5% CO2在37°c, 并保持其他两个盘子在 normoxia (21% O2, 5% co2在37°c) 为 4 h. 利用一组常氧和缺氧细胞对免疫沉淀的低氧治疗进行评价, 并利用另一组细胞进行联合实验。
    注: 氧水平可以设定在 0–5%, 缺氧治疗的持续时间可以根据细胞类型和研究目标而变化。

2. 全细胞和核萃取

注: 有关此协议中使用的缓冲区的信息, 请参见表 1 。

  1. 收获 normoxia 控制细胞。
    1. 用10毫升 DPBS (PH 7.0–7.2) 用10毫升的吸管去除培养基, 用吸入法冲洗细胞。
      注意: 避免用吸管接触细胞单层。在洗涤过程中, 轻轻地将 DPBS 在细胞培养板的壁上, 以避免细胞流失。
    2. 吸管5毫升冰冷 DPBS 进入板和刮的细胞表面上的冰冷 PBS 与细胞刮刀。
    3. 将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中, 并保持在冰上。
  2. 在缺氧条件下收获细胞培养。
    1. 预平衡的 DPBS 到缺氧条件通过放置一个发现100 毫升实验玻璃试剂瓶填充 DPBS 在缺氧 subchamber (1% O2和 5% CO 2 在 37 °c), 提前24小时。
    2. 大约 1 h 在收获缺氧治疗的细胞之前, 放置一个冰盒包含冰入 glovebox 的处理室, 已经平衡到 1% O2和 5% CO2。将含有预平衡缺氧 DPBS 的瓶子从缺氧 subchamber 转移到处理室并放在冰上。
    3. 低氧治疗后4小时, 将细胞从缺氧 subchamber 转移到平衡前 1% O2和 5% CO2的处理室。
    4. 通过吸入去除培养基, 用10毫升冰冷预平衡缺氧 DPBS 和10毫升吸管冲洗细胞一次。
    5. 添加5毫升冰冷预平衡 DPBS 与5毫升吸管, 并通过刮一个细胞刮刀去除细胞。
    6. 倾斜细胞培养板和收集分离细胞使用10毫升吸管。将 DPBS 中的细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中, 并保持在冰上。
    7. 打开 glovebox 的处理和缓冲室之间的门, 两者都已预平衡到 1% O2 和 5% CO2。将含有缺氧处理细胞的冰上的15毫升锥形管转移到缓冲室。打开缓冲室的门, 完全从 glovebox 中取出细胞。
  3. 常氧细胞从2.1 和缺氧细胞从2.2 通过离心在 1000 x g为5分钟在4°c。
  4. 准备整个细胞提取物。
    1. 并用重悬500µL 中的细胞颗粒, 包括50毫米 Trisaminomethane 盐酸盐 (三盐酸) pH 8.0、150毫米氯化钠 (NaCl)、1% tergitol 型 NP-40 (NP-40)、0.5% 钠脱氧和0.1% 月桂酸钠 (SDS), 辅以1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (见材料表) 通过吹打细胞颗粒上下几次。
    2. 将细胞裂解物转移到新的1.5 毫升离心管中, 并在冰上保持30分钟, 偶尔涡流。
    3. 离心细胞裂解物在 1.3万 x g 10 分钟在4°c。
    4. 收集上清, 整除50µL 的上清到1.5 毫升离心管, 并存储在-80 摄氏度。
  5. 用核萃取试剂盒准备核提取物 (见材料表)。
    1. 用1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒和0.1 米 dithiothreitol (并用重悬) 在500µL 的裂解缓冲液中轻轻地将细胞颗粒向上和向下吹打几次。
    2. 在十年代以最大速度添加25µL 的洗涤剂溶液 NP 到细胞悬浮和漩涡。
    3. 离心机在 1万 x g 5 分钟在4摄氏度。
    4. 收集上清 (细胞质提取物), 整除50µL 的上清到1.5 毫升离心管, 并贮存在-80 摄氏度。
    5. 并用重悬500µL 裂解缓冲物中含有细胞核的球团, 辅以1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒和0.1 米的涡流, 最大速度为5秒。
    6. 离心机在 1万 x g 5 分钟在4°c 和保存核球团。
    7. 并用重悬50µL 萃取缓冲液中的核球团 NX1 辅以1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 多次吹打颗粒。
    8. 在冰上孵化30分钟, 涡流为十年代每5分钟在最大速度。
    9. 离心机在 1.2万 x g 10 分钟在4摄氏度。
  6. 淡化核萃取物。
    1. 从步骤2.5.9 收集上清液, 并转入微型透析装置, 最大容积为每单位100µL。
    2. 将微型透析装置盖上, 放在浮选装置中。
    3. 将浮选装置放在装有500毫升预冷透析缓冲液的烧杯中 (20mM 三盐酸 pH 7.4, 20% 甘油, 100mM 氯化钾 (氯化钾), 0.2 毫米乙二胺二乙酸 (EDTA), 0.2 毫米 phenylmethylsulfonyl 氟 (PMSF) 和0.5 毫米)并孵育30分钟, 在4摄氏度与温和搅拌。
      警告: PMSF 是危险的。避免直接接触皮肤或吸入。
    4. 收集的样品从角落的迷你透析设备和转移到新的1.5 毫升离心管。
    5. 离心机在 1.2万 x g 10 分钟在4°c, 整除25µL 每上清入1.5 毫升离心管, 并且存放在-80 °c。

3. HIF-1α蛋白表达和亚细胞定位评价低氧治疗的价值

  1. 根据制造商的说明18, 测定二辛可宁酸 (微板块) 蛋白检测试剂盒的全细胞或核/细胞质提取物的蛋白质浓度。
  2. 稀释细胞裂解物在 1x Laemmli 样品缓冲包含 5% 2-巯基乙醇并且煮沸在95°c 为5分钟。
    注意: 不要接触加热块的表面, 因为它可能会引起烧伤。
  3. 用月桂酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 分离蛋白质。
    1. 将等量的蛋白质 (25 µg) 加载到 SDS 页预制梯度凝胶 (4–20%) 的每个井中, 以及分子量标记的3µL。
    2. 运行的凝胶在运行缓冲区中含有2.5 毫米三, 19.2 毫米甘氨酸, 0.01% SDS, PH8.3 30 分钟 200 v。
  4. 将蛋白质从凝胶转移到硝化膜。
    1. 将转移夹层 (过滤纸-凝胶膜过滤纸) 与阳极边上的凝胶和卡带负极端的膜组装起来。
    2. 将卡带放入装有2.5 毫米 trisaminomethane (三)、19.2 mm 甘氨酸和20% 甲醇的转移缓冲器的转储罐中。
      注意: 甲醇是易燃的, 应储存在易燃液体贮存柜内。
    3. 在冷室的100伏处进行1小时的转移。
  5. 在10毫升的阻挡缓冲器中, 用50毫米三氯 (pH 7.6), 150 毫米氯化钠, 0.1 吐温20和5% 个非脂牛奶, 在室温下在振动筛上阻挡印迹。
  6. 用 anti-HIF-1α抗体 (1/500 稀释) 在4摄氏度的同一阻塞缓冲液中孵化出印迹。
  7. 每次用50毫升的3次清洗污点5分钟。
  8. 用辣根过氧化物酶 (HRP)-共轭二级抗体 (1/1000 稀释) 在室温下用10毫升含5% 非脂肪干牛奶的1小时孵化出印迹。
  9. 每次用50毫升的3次清洗污点5分钟。
  10. 将500µL 的增强 chemilumescent (ECL) 试剂 a 和 B 混合在1.5 毫升离心管和涡流中。
  11. 在室温下将 ECL 基底涂抹在印迹上, 孵育1分钟。
  12. 利用电荷耦合器件 (CCD) 摄像成像系统捕获化学发光信号。
    1. 通过接触膜的边缘与纸巾, 将膜放在板料保护器中, 排出多余的 ECL 基体。
    2. 将膜放在 CCD 摄像成像系统的样品托盘上。
    3. 启动图像处理软件 (参见材料表), 并使用以下设置捕获图像: 文件→新协议→单通道→协议设置→凝胶成像 (应用: 化学;成像区域: 生物 Rad 准备凝胶;成像曝光: 软件将自动优化的曝光时间为强频带) →运行协议
      注意: 可以手动设置曝光时间, 以实现最佳图像。

4. Immunoprecipitated 蛋白的免疫沉淀和检测

  1. 在1.5 毫升离心管中, 将50µL 的蛋白 A/G 琼脂糖珠在500µL 的 tb 缓冲器中洗净, 用离心法在 3000 x G上以2°c 的方法将珠子颗粒化。
  2. 在100µL 的 tb 缓冲器中, 丢弃上清和并用重悬珠子。
  3. 添加2µL 的小鼠单克隆抗 ARNT 抗体 (1.4 毫克/毫升) 或小鼠免疫球蛋白 G (IgG) (1.4 毫克/毫升), 通过重组0.7 毫克鼠 IgG 在500µL tb 缓冲。
  4. 放置1.5 毫升的离心管, 其中包含珠在管转子和孵化2小时在 10 rpm 在冷室。
    注意: 轻轻地处理管子, 并保持悬浮在管子底部的珠子。
  5. 以 3000 x g为2分钟, 在4摄氏度处离心成珠, 然后丢弃上清液。
  6. 稀释200µg 在步骤2.6.5 中获得的核蛋白裂解物, 其800µL 的 IP 缓冲器由50毫米三盐酸 (pH 7.4)、180毫米氯化钠、20% 甘油、0.2% NP-40 和1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒组成。在4摄氏度, 在步骤4.5 中获得的抗体耦合珠孵化出裂解液。
  7. 以 3000 x g为2分钟, 在4摄氏度时, 将珠子颗粒离心, 丢弃上清液, 用1毫升冰冷 tb (含 0.2% NP-40) 将珠子洗净3次。
  8. 将珠子煮沸50µL Laemmli 样品缓冲器95°c 5 分钟。
  9. 离心 1万 x g 5 分钟的珠子在4摄氏度, 收集上清, 并丢弃珠。
    注: 上清液可储存在4摄氏度, 短期或-20 摄氏度长期。
  10. 从 immunoprecipitated 蛋白配合物中检测出 HIF-1α的存在, 如上文步骤3.3 所述。
    注: 此步骤不需要蛋白质量化。将每个样品上清的全部容积 (50 µL) 装入 SDS 页预制梯度凝胶 (4–20%) 的每个井中。

结果

为了评估细胞对缺氧的反应, 研究了缺氧治疗后 HIF-1 复合物的表达水平和亚单位定位。HEK293A 细胞在缺氧条件下培养4小时或保持在 normoxia 作为控制。HIF-1α和 ARNT 蛋白水平检查在整个细胞或核/细胞质提取物的西方印迹。按照预期, 缺氧上调总 HIF-1α水平, 而 ARNT 总细胞裂解物水平没有显著改变 (图 1A)。此外, 缺氧导致 HEK293A 细胞中 HIF-1α和 ARNT 的核积累...

讨论

HIF-1 复合体是细胞氧稳态的主调节器, 它调节了多种细胞适应缺氧反应的基因。新的 HIF-1 相互作用蛋白的鉴定对于了解缺氧信号转导具有重要意义。免疫沉淀实验通常用于 PPIs 研究, 描绘细胞信号转导通路。然而, 蛋白质过度表达仍然被广泛使用, 这可能导致实验性工件。此外, HIF-1α是一种高度不稳定的蛋白质, 它在重氧11期间迅速降解。此外, 缺氧会触发大多数哺乳动物细胞系中 ...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢张庆信教授对缺氧工作站的使用。这项工作得到以下方面的支持: 新加坡教育部、教育部 1T1-02/04 和 MOE2015-T2-2-087 (Y.A.)、李港医学院、南洋理工大学开办补助金 M4230003 (P.O.B.)、瑞典研究理事会、家庭苓基金会, 诺德基金会, Stichting af Jochnick 基金会, 瑞典糖尿病协会, 氧化钪保险公司, 糖尿病研究和健康基金会, 泊位冯 Kantzow 的基础,战略研究计划在糖尿病卡罗林斯卡 Institutet, 紧急救济 ERC-2013-AdG 338936 Betalmage, 和克努特和爱丽丝拉乌尔·沃伦贝格基金会。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 1st BASE1415
Protein A/G Sepharose beadsAbcamab193262
Natural Mouse IgG proteinAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
Nitrocellulose Membrane   Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling7076
SignalFire ECL ReagentCell Signaling6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineCorning21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody Novus BiologicalsNB100-124 Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha AntibodyNovus BiologicalsNB100-479Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 AntibodyNovus BiologicalsNBP1-46218Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH AntibodySanta Cruzsc-47724Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%)SigmaG5516
Potassium chlorideSigmaP9541
RIPA bufferSigmaR0278
Sodium Chloride (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A cell lineThermo Fisher ScientificR70507
Methanol Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QSP gel loading tip Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioTekBTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological PipetsCorning4487
Costar 10mL Stripette Serological PipetsCorning4488
Costar 25mL Stripette Serological PipetsCorning4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene MicroplatesCorning3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge TubesCorning352095
Small Cell ScraperCorning3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge TubesGreiner Bio-One 616201
PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage CabinetsJustrite Manufacturing Co.896000
Vortex mixerLabnetS0200
CO2 incubatorNuAireNU-5820
Orbital shakersStuartSSL1
Tube rotator SB3StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrifugeThermo Fisher Scientific75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DeviceThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DevicesThermo Fisher Scientific69588
LSE Digital Dry Bath HeatersThermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety CabinetsThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691

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