JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол изучать белок белковых взаимодействий между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Этот метод подходит для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы на гипоксии.

Аннотация

Низкой кислорода (гипоксии) вызывают различные меры адаптационного реагирования с гипоксией индуцибельной фактор 1 (HIF-1) комплекс, действуя в качестве главного регулятора. HIF-1 состоит из кислорода регулируется α субъединица гетеродимерная (HIF-1α) и конститутивно выразил β-субъединица (HIF-1β) также известен как арил углеводородов рецептор ядерной вступают (ARNT), регулирующие генов, участвующих в различных процессах, включая ангиогенеза , эритропоэза и гликолиз. Идентификация HIF-1 взаимодействуя протеины является ключом к пониманию гипоксии, сигнальный путь. Помимо регулирования HIF-1α стабильности гипоксия также вызывает ядерной транслокации многих факторов транскрипции, включая HIF-1α и ARNT. В частности большинство нынешних методов, используемых для изучения таких взаимодействий протеин протеина (ИЦП) основаны на системах, где уровни белка искусственно увеличить через гиперэкспрессия белка. Гиперэкспрессия белка часто приводит к не физиологические результаты, вытекающие из временных и пространственных артефактов. Здесь мы описываем модифицированных co иммунопреципитация протокола после лечения гипоксии с использованием эндогенного ядерных белков и как доказательство концепции, чтобы показать взаимодействие между HIF-1α и ARNT. В этом протоколе гипоксических клетки были собраны в гипоксических условиях и Дульбекко физиологический Phosphate-Buffered (DPBS) мыть буфер был также предварительно уравновешенной гипоксические условия перед использованием смягчения последствий деградации белка или комплекс белков диссоциация во время реоксигенацию. Кроме того ядерная фракций впоследствии были извлечены сконцентрироваться и стабилизировать эндогенного ядерных белков и избежать возможных ложных результатов, часто видели во время гиперэкспрессия белка. Этот протокол может использоваться для демонстрации эндогенных и родной взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях.

Введение

Гипоксия происходит, когда недостаточно кислорода поступает в клетки и ткани тела. Она играет важную роль в различных физиологических и патологических процессах дифференцировки стволовых клеток, воспаление и рака1,2. Гипоксия индуцибельной факторов (HIFs) функции гетеродимерами состоит из кислорода регулируется α-субъединицы и конститутивно выраженной β-субъединица также известен как ARNT3. К настоящему времени было выявлено три изоформ субблоков HIF-α (HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α) и три HIF-β-субъединиц (ARNT/HIF-1β, ARNT2 и ARNT3). HIF-1α и ARNT повсеместно выражается, тогда как HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 и ARNT3 имеют более ограниченный выражение модели4. Комплекс белков HIF-1 является ключевым регулятором ответ гипоксии. В гипоксических условиях HIF-1α стабилизируется, затем translocates в ядро и последнего с ARNT5. Впоследствии этот комплекс связывается с конкретным нуклеотидов, известный как гипоксия реагировать элементов (HREs) и регулирует выражение генов-мишеней участвует в различных процессах, включая ангиогенеза, эритропоэза и гликолиз6. Помимо этого «канонической» ответ, гипоксия сигнальный путь также известен уровень помех с несколькими клеточный ответ, сигнальные пути как вырезка и ядерного фактора Каппа B (NF-κB)7,8,9.

Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для лучшего понимания гипоксии, сигнальный путь. В отличие от ARNT, которая нечувствительна к уровень кислорода и конститутивно выраженной, уровни белка HIF-1α плотно регулируется клеточного кислорода. В normoxia (21% кислорода) HIF-1α белки являются быстро деградированных10,11. Короткий период полураспада HIF-1α на normoxia представляет конкретные технические проблемы для обнаружения белка от выдержек клетки, а также для идентификации HIF-1α-взаимодействия белков. Кроме того несколько факторов транскрипции, в том числе HIF-1 комплекса перемещают в ядре при гипоксических условий12,,1314. Большинство нынешних методов, используемых для исследования PPI выполняются с использованием не физиологические гиперэкспрессия белков. Сообщается, что такие гиперэкспрессия белка причиной различных клеточных дефекты через несколько механизмов, включая перегрузки ресурсов, нейтро дисбаланс, неразборчивый взаимодействия и пути модуляции15,16. С точки зрения исследований PPI гиперэкспрессия белка может привести к ложный положительный, или даже ложные отрицательный, результаты в зависимости от свойства белков и функции гиперэкспрессия белка. Таким образом нынешние методы PPI исследований должны быть изменены для того, чтобы выявить физиологически соответствующих ИЦП в гипоксических условиях. Ранее мы продемонстрировали взаимодействие между HIF-1 и Ets семьи транскрипционный фактор GA-связывающий белок (GABP) в гипоксических P19 клеток, что способствует ответ промоутер Hes1 гипоксии17. Здесь мы описываем co иммунопреципитация протокол для изучения ИЦП между эндогенного ядерных белков в гипоксических условиях. Взаимодействие между HIF-1α и ARNT показано как доказательство концепции. Этот протокол предназначен для демонстрации взаимодействия факторов транскрипции и transcriptional совместно регуляторы в гипоксических условиях, включая, но не ограничиваясь идентификации HIF-1 взаимодействуя белками.

протокол

Этот протокол раздел, который использует человеческих эмбриональных почек 293A (HEK293A) клеток, s соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человеческого в Nanyang технологический университет, Сингапур.

1. индукция гипоксии в HEK293A клетках

  1. Подготовить четыре блюда 10 см и семян 3 – 5 x 10-6 HEK293A клетки за блюдо в 10 мл Дульбекко изменение орла среднего (DMEM, 4,5 г/Л глюкозы) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, пируват натрия 110 мг/Л, 100 ед/мл пенициллин и 100 мг / Мл стрептомицина. Культура клетки в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
    Примечание: Заполнение ячейки должны осуществляться в биологической безопасности кабинета (BSC). С 70% этанол следует протереть поверхности всех материалов, чтобы быть помещены в BSC.
  2. 24 ч после посева, когда клетки достигли 80 – 90% confluency, положить два блюда в subchamber гипоксии в инкубатор бардачком (см. Таблицу материалы) с 1% O2 и 5% CO2 при 37 ° C и держать два других блюд в normoxia (21% O 2, 5% CO2 при 37 ° C) для 4 ч. использовать один набор нормоксические и гипоксии клетки для оценки лечения гипоксии на западной помарке и использовать другой набор ячеек для co иммунопреципитация экспериментов.
    Примечание: Уровни кислорода могут быть установлены в 0 – 5% и продолжительность лечения гипоксии может изменяться в зависимости от типа клеток и изучить цели.

2. вся ячейка и ядерной добыча

Примечание: См. таблицу 1 для получения информации о буферы, используемые в настоящем Протоколе.

  1. Урожай клетки normoxia управления.
    1. Извлеките носитель культуры путем аспирации и промойте клетки с 10 мл DPBS (рН 7,0-7,2) с помощью пипетки 10 мл.
      Примечание: Не прикасайтесь к монослою клеток с пипеткой. Во время стирки, аккуратно Пипетка DPBS вниз по стене плиты культуры клеток во избежание потери клеток.
    2. Пипетка 5 мл ледяной DPBS в пластину и циклюют клетки с поверхности пластины в ледяной PBS с скребок ячейки.
    3. Передача суспензию клеток в 15 мл конические трубы и держать на льду.
  2. Урожай клетки культивировали в гипоксических условиях.
    1. Предварительно сбалансировать DPBS гипоксических условий, поместив открытая 100 эксперимент стекла реагентов мл заполнены с DPBS в subchamber гипоксии (1% O2 и 5% CO2 при 37 ° C) за 24 часа заранее.
    2. Примерно 1 час до уборки лечение гипоксии клетки, поместите лед окно, содержащее льда в камеру обработки бардачком, который сбалансирован для 1% O2 и 5% CO2. Передача флакон, содержащий предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS от гипоксии subchamber в камеру обработки и поместите его на льду.
    3. 4 h после лечения гипоксии, передачи клетки от гипоксии subchamber в камеру обработки, которая была предварительно уравновешенной 1% O2 и 5% CO2.
    4. Извлеките носитель культуры путем аспирации и промойте клетки один раз с 10 мл ледяной предварительно уравновешенной гипоксическая DPBS с 10 мл Пипетка.
    5. Добавьте 5 мл ледяной предварительно уравновешенной DPBS с 5 мл Пипетка и выбить клетки, соскоб с скребок ячейки.
    6. Наклона пластины культуры клеток и собирать отдельные клетки, с помощью пипетки 10 мл. Перевести суспензию клеток в DPBS на 15 мл конические трубы и держать на льду.
    7. Откройте дверь между обработки и буфера палаты бардачком, оба из которых были предварительно уравновешенной 1% O2 и 5% CO2. Передача 15 мл конические трубы на льду, содержащих лечение гипоксии клетки от обработки камеры в камеру буфера. Откройте дверь в камеру буфера и полностью удалить ячейки с бардачком.
  3. Пелле как нормоксические клетки от 2.1 и гипоксии клетки от 2.2 центрифугированием на 1000 x g 5 мин при 4 ° C.
  4. Подготовьте клеточных экстрактов.
    1. Ресуспензируйте клетки окатышей в 500 мкл буфера lysis ледяной радио иммунопреципитации пробирного (RIPA), содержащий 50 мм Trisaminomethane гидрохлорид (Tris-HCl) рН 8,0, 150 мм хлорид натрия (NaCl), 1% tergitol тип NP-40 (NP-40), 0,5% Дезоксихолат натрия, и 0,1% лаурилсульфат натрия (SDS), дополнены 1 x коктейль ингибитор протеазы (см. Таблицу материалы), закупорить гранулы ячейку вверх и вниз несколько раз.
    2. Передача lysates клетки в новой microcentrifuge 1.5 мл пробирок и держать на льду на 30 мин с случайные vortexing.
    3. Центрифуга lysates клетки на 13 000 x g 10 мин при 4 ° C.
    4. Собирать супернатанта, аликвота 50 мкл супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы и хранить при температуре-80 ° C.
  5. Подготовить ядерной выдержки, с использованием ядерных добыча комплект (см. таблицу материалы).
    1. Нежно ресуспензируйте клетки окатышей в 500 мкл NL буфера lysis дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль и 0,1 М Дитиотреитол (DTT), закупорить гранулы ячейку вверх и вниз несколько раз.
    2. 25 мкл моющего раствора NP суспензию клеток и вихревые для 10 s на максимальной скорости.
    3. Центрифуга на 10000 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Супернатант (цитоплазматических экстракты), аликвота 50 мкл супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы, собирать и хранить при температуре-80 ° C.
    5. Ресуспензируйте гранулы, содержащие клеточных ядер в 500 мкл буфера lysis NL, дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль и 0,1 М DTT vortexing для 5 s на максимальной скорости.
    6. Центрифуга на 10000 x g 5 минут при температуре 4 ° C и сохранить ядерный Пелле.
    7. Ресуспензируйте ядерной Пелле в 50 мкл извлечения буфер NX1 дополнен с 1 x ингибитор протеазы коктейль закупорить Пелле вверх и вниз несколько раз.
    8. Инкубируйте 30 минут на льду, vortexing для 10 s каждые 5 минут на максимальной скорости.
    9. Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C.
  6. Опреснения ядерной экстрактов.
    1. Соберите супернатант от шага 2.5.9 и передаче в устройства мини-диализа с максимальный объем 100 мкл на единицу.
    2. Крышка устройства мини-диализа и поместите их в устройство флотации.
    3. Поставьте устройство флотации в стакан, содержащий 500 мл буфера предварительно охлажденные диализа (20 мм трис-HCl рН 7,4, 20% глицерина, 100 мм хлористый калий (KCl), 0,2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,2 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) и 0,5 мм DTT) и Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C с мягким перемешиванием.
      Предупреждение: PMSF опасных. Избегайте прямого контакта с кожей или вдыхания.
    4. Сбор образцов от угла мини диализа устройств и передачи в новые трубы microcentrifuge 1,5 мл.
    5. Центрифуга на 12000 x g 10 мин при 4 ° C, аликвота 25 мкл каждого супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубку и хранить при температуре-80 ° C.

3. Оценка лечения гипоксии, обнаружение выражения протеина и внутриклеточных локализации HIF-1α

  1. Определите концентрацию белка всей ячейки или ядерных/цитоплазматических экстрактов, используя Гонав assay bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного комплекта согласно инструкции производителя18.
  2. Разбавить lysates клетки в 1 буфер образца x Laemmli, содержащих 5% 2-меркаптоэтанол и варить при 95 ° C за 5 мин.
    Предостережение: Не прикасайтесь к поверхности Отопление блока, так как это может вызвать ожоги.
  3. Отделить белки, электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE).
    1. Загрузите равных количеств белка (25 мкг) в каждую лунку градиента гелях SDS-PAGE сборный (4 – 20%), наряду с 3 мкл маркер молекулярного веса.
    2. Побегите гель в управлении буфер, содержащий 2,5 мм трис, 19.2 мм глицин, 0,01% SDS, PH8.3 на 30 мин в 200 V.
  4. Передать нитроцеллюлозные мембранные белки от геля.
    1. Соберите передачи сэндвич (Бумага фильтровальная бумага гель мембраны фильтр) с гелем на стороне анода и мембраны на стороне катода кассеты.
    2. Установите кассету в передачи бак заполнен буфер передачи, содержащий 2,5 мм trisaminomethane (Tris), 19.2 мм глицин и 20% метанола.
      Предупреждение: Метанол легковоспламеняющихся и должны храниться внутри Легковоспламеняющиеся жидкость хранения кабинета.
    3. Осуществлять передачи для 1 h 100 V в холодной комнате.
  5. Блокировать пятно в 10 мл блокирующий буфер, содержащий 50 мм трис-Cl (рН 7,6), 150 мм NaCl, 0.1 анимации 20 и 5% обезжиренное молоко за 1 ч при комнатной температуре на шейкер.
  6. Инкубировать блот с анти HIF-1α антитела (1/500 разрежения) в тот же блокирующий буфер на ночь при 4 ° C.
  7. Промойте пятно 3 раза за 5 мин каждый раз с 50 мл TBS-T.
  8. Инкубировать блот с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных вторичное антитело (1/1000 разрежения) в 10 мл TBS-T содержащие 5% обезжиренное сухое молоко, за 1 ч при комнатной температуре.
  9. Промойте пятно 3 раза за 5 мин каждый раз с 50 мл TBS-T.
  10. Смесь 500 мкл каждого расширения chemilumescent (ЭСЛ) реагента A и B в пробки microcentrifuge 1,5 мл и вихревой кратко.
  11. Применить ECL субстрата к пятно и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  12. Захват хемилюминесцентный сигналов с помощью зарядовой (связью ПЗС) системы на основе камеры.
    1. Слейте излишки ECL субстрата, прикоснувшись край мембраны с папиросной бумаги и мембраны в лист протектор.
    2. Поместите мембраны образца поддон CCD камеры-на основе изображений системы.
    3. Запуск программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалы) и захвата изображения со следующими параметрами: файл → новый протокол → → на один канал протокола установки → гель изображений (приложение: Панджаб; Область изображения: Био-Rad готов лари; Imaging экспозиции: Программное обеспечение будет автоматически оптимизировать время экспозиции для интенсивных полос) → запустить протокол
      Примечание: Время экспозиции можно вручную задать для достижения оптимального изображения.

4. иммунопреципитации и обнаружение белков Immunoprecipitated

  1. Вымойте 50 мкл протеина A/G sepharose бусины в 500 мкл буфера TBS в 1,5 мл microcentrifuge трубы и Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при 4 ° C.
  2. Отменить супернатант и Ресуспензируйте бисер в 100 мкл буфера TBS.
  3. 2 мкл антител моноклональных анти ARNT мыши (1,4 мг/мл) или мыши иммуноглобулина G (IgG) (1,4 мг/мл), который был подготовлен воссоздания мыши IgG 0,7 мг в 500 мкл буфера TBS.
  4. Место 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие бусины в ротатор трубки и проинкубируйте втечение 2 ч 10 об/мин в холодной комнате.
    Примечание: Осторожно обрабатывать трубы и держать суспензии, содержащей бусины в нижней части трубки.
  5. Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C и отбросить supernatants.
  6. Разбавьте 200 мкг ядерных белков lysate полученные в шаге 2.6.5 в 800 мкл буфера IP, состоящий из 50 мм трис-HCl (рН 7,4), 180 мм NaCl, 20% глицерина, ингибитор протеазы NP-40 и 1 x 0,2% коктейль. Инкубировать lysate антител в сочетании бисером, полученного на шаге 4.5 на ночь при 4 ° C.
  7. Пелле бисер центрифугированием в 3000 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, отменить supernatants и мыть бисер 3 раза с 1 мл ледяной TBS, содержащие 0,2% NP-40.
  8. Отварите бусины в буфер образца Лэмли 50 мкл на 95 ° C за 5 мин.
  9. Центрифуга бусы на 10000 x g 5 минут при температуре 4 ° C, собирать супернатанта и отбросить бисер.
    Примечание: Супернатант может храниться при температуре 4 ° C на короткий срок или от-20 ° C в долгосрочной перспективе.
  10. Обнаружить присутствие HIF-1α от белковых комплексов immunoprecipitated, Западная помарка, как описано в шаге 3,3 года.
    Примечание: Белка количественной оценки не требуется для этого шага. Загрузить полный объем (50 мкл) в надосадке каждого образца в каждой скважине градиента гелях SDS-PAGE сборный (4 – 20%)

Результаты

Чтобы оценить клеточный ответ к гипоксии, выражение были рассмотрены уровни и внутриклеточных локализации компонентов комплексного лечения следующих гипоксии HIF-1. HEK293A клетки были культивировали в гипоксических условиях для 4 h или храниться в normoxia как элементы управ...

Обсуждение

Комплекс HIF-1-главный регулятор клеточного кислорода гомеостаза и регулирует множество генов, участвующих в различных клеточных адаптационного реагирования к гипоксии. Определение Роман HIF-1 взаимодействуя протеины имеет важное значение для понимания гипоксических сигнала. Co Иммуноп?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим доцент Sin Tiong Онг за использование рабочей станции гипоксии. Эта работа была поддержана следующее: Сингапур министерства образования, МО 1T1-02/04 и MOE2015-T2-2-087 (чтобы ю.а.), ли Конг Чиан школа медицины, Наньянг технологический университет начальный Грант M4230003 (P.O.B.), Шведский исследовательский совет, Фонд семьи Эрлинг Перссон, Фонд Ново Нордиск, Stichting аф Йокников фонд, Шведской ассоциацией диабета, страховая компания скандия, Диабет исследований и оздоровительный фонд, Фонд причала фон Канцов, Программа стратегических исследований в диабета на Каролинского института, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage и Фонд Рауля Валленберга Алиса и кнут.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 1st BASE1415
Protein A/G Sepharose beadsAbcamab193262
Natural Mouse IgG proteinAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
Nitrocellulose Membrane   Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling7076
SignalFire ECL ReagentCell Signaling6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineCorning21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody Novus BiologicalsNB100-124 Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha AntibodyNovus BiologicalsNB100-479Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 AntibodyNovus BiologicalsNBP1-46218Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH AntibodySanta Cruzsc-47724Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%)SigmaG5516
Potassium chlorideSigmaP9541
RIPA bufferSigmaR0278
Sodium Chloride (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A cell lineThermo Fisher ScientificR70507
Methanol Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QSP gel loading tip Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioTekBTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological PipetsCorning4487
Costar 10mL Stripette Serological PipetsCorning4488
Costar 25mL Stripette Serological PipetsCorning4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene MicroplatesCorning3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge TubesCorning352095
Small Cell ScraperCorning3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge TubesGreiner Bio-One 616201
PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage CabinetsJustrite Manufacturing Co.896000
Vortex mixerLabnetS0200
CO2 incubatorNuAireNU-5820
Orbital shakersStuartSSL1
Tube rotator SB3StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrifugeThermo Fisher Scientific75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DeviceThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis DevicesThermo Fisher Scientific69588
LSE Digital Dry Bath HeatersThermo Fisher Scientific1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety CabinetsThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691

Ссылки

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138coHIFs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены