İnsan yağı için bir Microphysiologic Platform: beyaz yağ dokusu sandviç

Özet

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) farmakolojik geliştirme ve metabolik çalışmalar engelleyen onun geçerli birincil kültür modelleri içinde önemli eksiklikleri vardır. Burada, bir yağ microphysiological sistem tarafından sandviç WAT levha stromal hücreler arasında üretmek için bir protokol mevcut. Bu yapıyı birincil WAT kültür için istikrarlı ve uyarlanabilir bir platform sağlar.

Özet

Beyaz Yağ dokusundan (WAT) ağırlık ve her gün sağlık düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Yine de, mevcut birincil kültür modelleri, tüm bunların sadakatle adipose microenvironment özetlemek veya WAT canlılık iki hafta ötesinde genişletmek için başarısız olmuş önemli sınırlamalar vardır. Güvenilir birincil kültür manken eksikliği ciddi araştırma WAT metabolizma ve ilaç geliştirme engellemektedir. Bu amaçla NIH'ın standartları için WAT birincil kültür 'SWAT' (gözükeceksin beyaz yağ dokusu) adı verilen yeni bir platform geliştirmek için bir microphysiologic sisteminin kullanılan. Adiposit doğal yüzdürme kıyılmış WAT kümeleri stromal hücreler yağ kaynaklı levha arasında sandviç tarafından üstesinden gelmek. Bu yapıyı kültür uygun üzerinde sekiz hafta WAT örnekleri var. SWAT sağlam ECM, hücre hücre kişiler ve in vivo WAT koşullardan fiziksel baskılara tutar; Ayrıca, SWAT sağlam bir transkripsiyon profil eksojen kimyasal sinyal ve bütün doku fonksiyon duyarlılık korur. SWAT birincil adipose kültür basit, tekrarlanabilir ve etkili bir yöntem temsil eder. Büyük olasılıkla, WAT fizyolojisi, patofizyolojisi, metabolizma ve ilaç geliştirme araştırmaları genel olarak uygun bir platformdur.

Giriş

Yağ dokusu içinde ABD¹147 milyar dolar ve 210 milyar dolar arasında doğrudan yıllık tıbbi maliyeti taşır obezite birincil organıdır. Yağ doku birikimi de önde gelen diğer kalp hastalığı, tip II diyabet ve kanser²belirli türleri gibi ölüm nedenleri katkıda bulunur. Vitro kültür modelleri metabolik çalışmaları ve ilaç geliştirme için gerekli olan, ama yağ dokusu geçerli araştırma modelleri büyük eksiklikleri var. Adiposit kırılgan, neşeli ve ölümcül hücre kültür plastikler için uygun olmaz ve bu nedenle geleneksel hücre kültür yöntemleri kullanarak kültürlü cant hücreleri Ayrıştırılan. Cam coverslips, tavan kültür, süspansiyon kültür ve ekstraselüler matrisler^3,4,5, kullanımı da dahil olmak üzere bu engelleri aşmak için girişimleri birkaç yöntem kullanılmıştır 1970'lerden beri ^{6 , 7}. ancak, bu yöntemlerin hücre ölümü ve dedifferentiation tarafından işaretlenmiş ve genellikle en fazla bir iki haftalık çalışma dönemi için kullanılır. Ayrıca, bu modeller yapmak değil kalkışmak gibi sağlam ECM korumak değil, etkileşimleri adiposit arasında ve stromal hücreler destek, ne de contractile kuvvetleri hücrelerin birbirlerine içinde içinde vivo sarfetmek yerli adipose microenvironment özetlemek WAT.

Altın standart birincil adipose kültür yöntemi yokluğunda, öncelikle farklılaştırılmış öncesi adiposit üzerinde (diffAds) yağ araştırma güvendi. DiffAds multilocular, yapışık ve metabolik olarak aktif. Buna karşılık, birincil beyaz adiposit üniloküler, nonadherent ve nispeten düşük metabolizma göstermek. Sağlıklı Olgun yağ dokusu fizyolojisi özetlemek için geçerli adipose kültür modellerin büyük olasılıkla doğrudan hedef adiposit FDA onaylı ilaçlar yokluğunda önemli bir faktör başarısızlıktır. Aslında, fizyolojik vitro organ modelleri büyük bir sorun birçok organ ve hastalık olmaması.

Onun pozisyon kağıt, Microphysiological sistemleri (MPS) programın yaratılması duyurmak Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tüm insan ilaç klinik çalışmalar arasında 2013 başarı oranı sadece %18 için faz II ve Evre III için % 50 olduğunu bildirdi Klinik çalışmalarda⁸. MPS programı doğrudan vitro Monokültür yetersizlik modeli insan fizyolojisi için karşılayacak şekilde tasarlanmıştır. NIH MPSs insan birincil veya kök hücreler organ işleyen özetlemek çok hücreli 3D yapıları içinde oluşan kültür sistemleri olarak tanımlar. Homojen, ölümsüzleştirdi hücre kültürleri indirgemeci modellerinin MPSs doğru bir şekilde hücre-hücre, hücre içi uyuşturucu, ilaç-ilaç ve organ-ilaç etkileşimleri⁹modeli. Kısa vadeli birincil kültür yöntemlerinden farklı olarak, NIH standartları 4 haftadan kültür⁸MPS sürdürülebilirlik dikte. NIH'ın RFAs (#RFA-TR-18-001)¹⁰, MPS programının daha fazla bilgi bulunabilir.

Basit, bir roman, uyarlanabilir, geliştirdiğimiz ve ucuz yağ MPS olarak adlandırdığı "beyaz yağ dokusu sandviç" (SWAT)¹¹. "Sandviç" kıyılmış birincil yağ dokusu stromal hücreler (ADSCs) (resim 1) yağ kaynaklı levha arasında tarafından adiposit doğal yüzdürme üstesinden gelmek. Elde edilen 3D yapı hücre-hücre iletişim ve doğal yağ microenvironment bir doğal adipocyte destek hücre popülasyonu içeren olgun adiposit çevreleyen tarafından beyannamedir. SWAT 8 haftalık canlılığı, eksojen sinyal, adipokine salgılanması ve engraftment bir hayvan modeli içine yanıt gösteren tarafından doğrulandı.

Protokol

Tüm görevler uyum içinde #8759 ve #9189, iletişim kuralları için gerçekleştirilen IRB Office LSUHSC-NO. tarafından onaylanmış Uyum içinde iletişim kuralı # LSUHSC-No IACUC ofiste tarafından onaylanmış 3285 için gerçekleştirilmiş tüm hayvan işleri

1. hücre sayfaları sandviç tohum

Not: Bkz. Şekil 1.

1. Tohum ADSCs, yaklaşık % 80'i confluency doku kültürü tabak (6 cm veya 6-şey tabak) içinde. 1 geleneksel doku kültürü iyi ve 1 kuyusu doku kültürü poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) kaplı plastik plaka üzerinde karşılık gelen boyut SWAT istenen her şey için tohum.
   Not: Buna göre bir 6-şey tabak SWAT hücreleri bir 6-şey standart doku kültürü plaka (temel katman) ve bir doku kültürü 6-şey pNIPAAm kaplı levha (üst katman) tohum gerektirir. pNIPAAm kaplamalı plakalar ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvar^12,13,14üretilen.
2. 37 ° C ve % 5 CO₂ içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (10 ile desteklenmiş DMEM) ADSCs korumak % FBS ve 1 x penisilin/streptomisin_. Medya 2 günde değiştirin.
3. Onlar % 100 birleşmesi olmak ve bir çizgili desen (yaklaşık 6-8 gün) almak kadar birleşim hücrelere izin.
   Not: Bu hücreler batmaz yağ dokusu stabilize etmek için bir tek sağlam hücre sayfası çalışması gerekir. Yeterince konfluent hücreleri WAT ile tohum üzerine parçası.

2. SWAT malzemeleri hazırlanması

1. Birkaç 10 mL aliquots, 1 x Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) hazırlamak; yedek birim ile plakalar için istediğiniz sayıyı yetecek hazırlayın.
2. Dalgıç aparatı SWAT tohum için hazırlayın. Yuvarlak bir diske bağlı bir kök oluşur, basit akrilik plastikler kullanarak pistonu oluşturmak. Doku kültürü wells çevresi içinde sığdığından emin olun (çapı: < için 6 cm çanak, 6 cm < 6-şey plaka için 3,5 cm; yaklaşık kitle: 6 cm yemek, bir 6-şey plaka için 5,1 g için 6,7 g).
   1. Yordamı sorunsuz durumda herhangi bir bireysel pistonu ile ilgili bir sorun çalışır emin olmak için ekstra itici hazırlayın.
   2. Laboratuvar bant dalgıç diskin kenarında etrafında sarın jelatin çözüm kaçağı önlemek için en az 2 x.
   3. Biyogüvenlik kabini (BSC) % 70 ile sprey alkol. 15 mL konik tüp raf BSC boş, kapağını 15 mL konik tüpler içinde aşağı sprey; tüpler jelatin itici yerleşimini güvenli yardımcı olacaktır.
   4. Her bant sarılmış dalgıç iyice %70 alkol ve yer ile raf bir 15 mL konik tüp içine sprey. Metal rondelalar (yaklaşık kitle 6.3 g) sprey ve bir çift çengel forseps ile birlikte rafta koyun; contalar ağırlık-ecek eklemek için itici SWAT tohum sırasında.
   5. BSC kanat ve UV kurutma ve sterilizasyon kolaylaştırmak ışık.
      Not: İdeal olarak, bu adım SWAT tohum önce 24 h kuralları. Alternatif olarak, işlem doku toplama/SWAT tohum günde yapmak; Ancak, bu durumda, 15-45 dk UV kurutma/sterilizasyon için izin verir.

3. jelatin itici hazırlanması — üst hücre sayfalara uygulama

1. Bir su banyosu ile 75 ° c ısı
2. Jelatin çözüm 1 x HBSS 10 mL hisse senedi için 0.75 g jelatin tozu ekleyerek hazırlayın. Bir duman başlık altında çözüm pH dengelemek için 1 M NaOH 100 µL ekleyin.
   1. 10 mL hisse senetleri için su banyosu ekleyin ve çözüm toz eriyene kadar şiddetle her 5 dk sallamak. Yakında sıcak su banyosu ekledikten sonra toz jelatin boşanmak hedefliyoruz.
   2. BSC üfleyici açmak, UV ışığı söndür ve kanat yükseltmek. BSC yüzey sprey ve filtre malzemeleri (5 mL radarı-kilit şırınga ve 0.2 µm şırınga filtreler) hazırlamak. Verimli bir şekilde jelatin itici için uygulamak için yeterli miktarda zorlanma için birden çok filtre hazır olun.
3. Jelatin çözüm homojen bir tutarlılık ulaştığında, çözüm filtre ve itici için uygulayın. Jelatin şırınga yükleyin. Jelatin şırınga filtresi (~2.5 mL 6-şey tabağı, 6 cm yemek için ~4.5 mL) ile plastik itici uygulayın ve (~ 20 dk) kuvvetlendirmek için izin.
4. Jelatin katı olduğunda, itici kenarından teyp paketini açmak. Çengel forseps ile jelatin pistonu dış kenarından kaldırmak (Yani, menisküs yükseltilmiş kenarlarını). Pistonu merkezinde kalan jelatin tamamen düzeyde olduğundan emin olun iletişim ADSC levha ile en üst düzeye çıkarmak için.
5. Yavaşça bir kez aşırı jelatin kaldırılır, jelatin itici pNIPAAm kaplı ADSC plakaları için geçerlidir. Metal rondelalar pistonu tartmak için kullanın. Hücre sayfaları itici uygulanırken kesme değil.
6. Oda sıcaklığında 1,5 saat için hücre sayfalardaki itici bırakın. Plakalar/itici ayrılma pNIPAAm kaplı plaka yüzeyinden hücre sayfasının tamamlamak 1,5 saat için bir buzlu su banyosunda kuluçkaya.
   1. Buz banyosunda kuluçka sırasında dikkatli olun; Kuluçka sırasında hücre medya kirletmek buz banyosu izin vermez.
   2. Kuluçka tamamladıktan sonra alt non-steril su kaldırmak için pNIPAAm kaplı plakaların temiz.

4. beyaz yağ doku işleme

1. İnsan yağ dokusu işletim odasından toplarken, tüm örnekleri buza SWAT seribaşı kadar olan steril bir kap içinde tutun. Steril bakım medya, fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), gibi doku istikrar için yağ dokusu kapsayıcı ekleyin.
2. 1.5 mL microcentrifuge tüpler olmak her şey/yemek için soğuk hücre kültür ortamına seribaşı (6-şey plaka için 100 µL, 6 cm yemek için 200 µL) ekleyin.
3. Yağ dokusu kıyma.
   1. Katı yağ dokusu kesimine yönelik aşağıdaki gibi yapın.
      1. Yağ dokusu 3 büyük parçalarını yıkayın steril PBS x ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.
      2. Kaba doku forseps ve steril ustura ile kıyma ve çok damarlara ve fasya mümkün olduğunca kaldırın (daha fazla ayrıntı için konuya bakın).
      3. İnce kadar kıyılmış doku üzerinde kalın, sıvı tutarlılık alır ustura ile yağlı kıyma.
         Not: Bu her zaman mümkün olmasa da ideal doku WAT görünür hiçbir bireysel parçaları ile homojen görünür.
   2. Lipoaspirate aşağıdaki gibi işlem.
      1. BSC altında bir ölçek üst üzerinde steril gazlı bez bant ve bu kabı herhangi bir aşırı sıvı toplamak için daha büyük bir ölçek içinde yer.
      2. 25 mL serolojik pipet kullanarak, fazla lipoaspirate gerektiği gibi çizmek ve steril gazlı bez yüzey için geçerlidir. PBS doğrudan bu yüzey için lipoaspirated yağ yıkamayı ve aşırı kan ve lipid kalıntı kaldırmak için geçerlidir.
      3. Forseps süzülmüş doku kurtarmak, steril bir kıyma yüzeye aktarmak ve lipoaspirate bin dereden su getirmek için kullanın.
4. Steril bir ustura p1000 pipet ipuçları kıyılmış doku aktarmak için distal ucunu kesmek için kullanın; Bu adipocyte lizis yol açabilir kesme stres en aza indirmek olacaktır. Uygun doku tutarlılık ulaşıldığında kıyılmış doku istenen hacmi her 1,5 mL tüp (300-400 µL 6-şey plaka için 500-600 µL 6 cm yemek için) aktarın. Kıyılmış WAT ve tüpler medyada kısaca karıştırın.
5. Taban ADSC plakaları almak ve medya dikkatle boşaltmak/Aspire edin. WAT/medya karışımı her 1,5 mL tüp ile ortamı değiştirin.
   1. Yavaşça jelatin itici pNIPAAm kaplı plakalar kaldır ve WAT karışıma taban ADSC plakaları üzerinde uygulayabilirsiniz. Hücresel dekolmanı onaylamak için bir mikroskop altında pNIPAAm kaplı plakaların monolayer inceleyin.
6. Yaklaşık olarak 37-40 ° c lisans altında bir ısı blok ayarlayın. Hala yerinde itici ile tabakalar ısı bloğunun yüzeye hareket. 2-3 mL ılık kültür hücreleri kuluçkaya ve jelatin erime kolaylaştırmak için medya ekleyin.
7. ~ 30 dakika sonra plaka yüzeyinden itici yavaşça çıkarın. Temel doku kültürü tabak kapakları yerine ve bir hücre kültür kuluçka taşıyın. Jelatin tamamen 37 ° C'de sıvılaşmış, Aspire edin ve hücre kültür ortamı değiştirin.
8. Fenol red-Alerjik M199 orta 7 µM insülin, 30 µM deksametazon, 1 x 37 ° C ve % 5 CO₂ ' de SWAT korumak penisilin/streptomisin. Ortamda yaklaşık 2 mL 6-şey plakaları için ve 3 mL 6 cm yemekler için korumak. Medya 2 günde değiştirin.

5. SWAT hasat

1. Collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM Adenozin, PBS) hazırlamak aliquots 15 mL konik tüpler (yaklaşık hacmi 10 mL). Tüpler donma ve onları-20 ° C'de depolayın
2. Herhangi bir kültür ortamından hücreleri Aspire edin, 1 x PBS ile yıkayın ve PBS Aspire edin. Collagenase aliquots bir 37 ° C su banyosunda çözdürme tarafından hazırlayın.
   Not: İdeal olarak, 37 ° C collagenase çözüm ulaşacak; hemen sonra doku ekleyin.
3. Tüm doku SWAT plaka için bireysel aliquots ekleyin. Bir steril hücre kavgacı tip kullanarak SWAT hasat ve collagenase aliquots kesme p1000 pipet ucu ile aktarmak. Doku collagenase solüsyon içeren doğrudan 15 mL konik tüpler için ekleyin.
   1. Alternatif olarak, bir 50 mL konik tüp doku/collagenase karışımı kuluçkaya; artan yüzey alanı daha fazla enzimatik sindirim kolaylaştıracaktır.
4. Örnek tüpler bir inkübe orbital çalkalayıcı 45 ° açıyla yerleştirin. 30-60 dk 37 ° C'de 200 devirde kuluçkaya.
5. Yer 250 µm koleksiyonu için yeni 15 mL konik tüp içine filtre kafes. Filtre sindirilmiş adipocyte solüsyonu dökün.
   Not: Bu tüm hücreleri fibröz doku filtreleme süre geçmesine izin verir.
6. Faz ayrılması için izin vermek için oda sıcaklığında 5 min için oturmak akışı aracılığıyla izin.
   Not: yağ stromal hücreler (ASCs) alt aşamalar halinde razı olacak iken adiposit çözüm dön yüzer olacak. Santrifüjü 500 x g de 5 min için Ayrıca hücre ayırma veya ADSCs Pelet çevreleyen hasat maksimize edebilirsiniz.
7. Bir kesme p1000 pipet ucu kullanarak, adipositler (collagenase çözüm üst yüzen tabaka) 1.5 mL microcentrifuge toplama tüp aktarın. Yavaş yavaş adiposit toplamak için tüp kenarı boyunca pipet ~ 250 µL teker teker alarak.
   1. Tüpü yavaşça içeriye doğru kalarak hücre kurtarma maksimize etmek için adiposit toplarken döndürün. 1.5 mL microcentrifuge tüp dolu olduğu kadar daha fazla hücre çizim tutmak.
8. Aşırı sıvı bir iğne (~ 21 G) bağlı bir Ģırınga kullanarak izole adiposit kaldırın. İğneyi yüzen adipocyte tabaka altında daldırın. Kısa bir süre için iğne mili kalarak hücreler çıkarmak için iğne kışkırtmak ve sonra dön yüzer yerinden çıkar adiposit bekleyin.
9. Yavaş yavaş adiposit istenmeyen kaldırılmasını önlemek için dikkatli olmak aşırı sıvı çizin. Microcentrifuge tüp mezuniyet sürekli örnek birimleri belirlemek için kullanın (Örneğin,. 0.1 mL her örnek için).
10. İzole hücre DNA/RNA ayıklama, Glikoz alımı tahlil, lipoliz tahlil, vb için kullanın

Sonuçlar

SWAT canlılığı başlangıçta bireysel WAT kümeleri seri aydınlık alan görüntüleme tarafından değerlendirildi (n = 12) yaklaşık 7.6 hafta içinde. Kümeleri güvenli monolayer bu süre boyunca üzerinde yerinde kaldı. Hafif morfolojik değişiklikler ile biraz çözgü veya konumları değişen bireysel adiposit gözlendi. Ancak, adipositler de zamanla dedifferentiation eksikliği gösteren multilocular haline, ne de herhangi bir görünür işaretleri hücresel blebbing, l...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı sandviç insan beyaz yağ dokusu ADSCs kullanımına detayları; insan ADSC hücre hatları via köklü protokolleri¹⁵ayrılmış olabilir. Ancak, sistem (örneğin sandviç fare WAT hücrelere 3T3L-1 kullanarak) bireyselleştirilmiş araştırma gereksinimleri için adapte edilebilir. Bu işlem birincil insan dokusu işleme içerir. Standart güvenlik önlemlerini istihdam edilmelidir; insan doku (Örneğin, HIV, HepC) BSL-2 patojen işlemek. Sadece doğrudan bir lis...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics