Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc

Résumé

Le tissu adipeux blanc (WAT) a des lacunes critiques dans ses modèles actuels de la culture primaire, qui entravent le développement pharmacologique et études métaboliques. Nous présentons ici un protocole visant à produire un système adipeux microphysiological par WAT intercaler entre deux feuilles de cellules stromales. Cette construction fournit une plateforme stable et adaptable pour la culture primaire de WAT.

Résumé

Le tissu adipeux blanc (WAT) joue un rôle crucial dans la régulation du poids et tous les jours de la santé. Néanmoins, il y a des limites importantes aux modèles disponibles culture primaire, qui n’ont pas fidèlement récapituler le microenvironnement adipeux ou prolonger la viabilité WAT au-delà de deux semaines. L’absence d’un modèle de culture primaire fiable entrave gravement recherche dans WAT du métabolisme et du développement des médicaments. À cette fin, nous avons utilisé des normes NIH d’un système de microphysiologic pour développer une nouvelle plate-forme pour la culture primaire de WAT appelée « SWAT » (sandwich le tissu adipeux blanc). Nous surmontons la flottabilité naturelle des adipocytes en intercalant hachées WAT grappes entre feuilles de cellules stromales dérivées d’adipeux. Dans cette construction, les échantillons WAT sont viables sur huit semaines de culture. SWAT maintient l’ECM intact, contacts cellule-cellule et les pressions physiques in vivo le conditions de WAT ; en outre, SWAT maintient un profil transcriptionnel robuste, sensibilité à la signalisation chimique exogène et fonction de tissus entiers. SWAT représente une méthode simple, reproductible et efficace de culture de tissu adipeuse primaire. Potentiellement, c’est une plateforme largement applicable pour la recherche en physiologie, physiopathologie, métabolisme et développement pharmaceutique WAT.

Introduction

Le tissu adipeux est le principal organe de l’obésité, qui transporte les coûts médicaux annuels directs entre $ 147 milliards et $ 210 milliards dans l’US¹. L’accumulation de tissu adipeux contribue également à d’autres causes principales de décès comme les maladies cardiaques, diabète de type II et certains types de cancer². Modèles de culture in vitro sont essentiels pour les études du métabolisme et le développement de médicaments, mais les modèles actuels de recherche du tissu adipeux ont des lacunes majeures. Les adipocytes sont fragiles, flottant et différencient en phase terminale des cellules qui ne peut pas adhérer aux plastiques de culture cellulaire et par conséquent ne peuvent pas être cultivées à l’aide de méthodes de culture cellulaire conventionnel. Depuis les années 1970, plusieurs méthodes ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter ces obstacles, y compris l’utilisation de lamelles de verre, plafond culture, culture en suspension et matrices extracellulaires^{3,4,5, 6 , 7}. Toutefois, ces méthodes ont été marquées par la mort cellulaire et la dédifférenciation, et ils sont généralement utilisés pour pas plus d’une période d’étude de deux semaines. En outre, ces modèles ne pas récapituler le microenvironnement adipeux natif car ils ne conservent pas l’ECM intact, les interactions entre les adipocytes et stromales soutiennent les cellules, ni les cellules contractiles forces exercent les uns des autres en in vivo WAT.

En l’absence d’une méthode de culture de tissu adipeux primaire étalon-or, recherche adipeuse s’est appuyé principalement sur les pré-adipocytes différenciés (diffAds). DiffAds sont multiloculaire, adhérente et métaboliquement actives. En revanche, les adipocytes blancs primaires sont uniloculaires, non adhérentes et démontrent métabolisme relativement faible. L’échec des modèles actuels de culture de tissu adipeux à récapituler la physiologie des tissus sains d’adipeux mature est probablement un facteur important en l’absence de médicaments approuvés par la FDA qui ciblent directement les adipocytes. En fait, le manque de modèles d’organe physiologique in vitro est un problème majeur dans la plupart des organes et des maladies.

Dans son document annonçant la création de son programme de Microphysiological Systems (MPS), le National Institutes of Health (NIH) ont indiqué que le taux de réussite de 2013 à travers tous les essais cliniques pharmaceutiques humains était seulement 18 % pour la phase II et 50 % pour la phase III essais cliniques⁸. Le programme MPS est conçu pour traiter directement de l’incapacité de in vitro de la monoculture de la physiologie humaine modèle. Le NIH définit MPSs comme les systèmes de culture composés des humains primaires ou de cellules souches dans des constructions 3D multicellulaires qui récapitulent le fonctionnement des organes. Contrairement aux modèles réductionnistes de cultures de cellules immortalisées, homogène, MPSs devraient modeler exactement cellules, cellules drogue, médicamenteuses et orgue-drug interactions⁹. À la différence des méthodes de culture primaire à court terme, normes NIH dictent durabilité MPS pendant 4 semaines dans la culture⁸. On trouvera plus de détails sur le programme MPS à la NIH ad (#RFA-TR-18-001)¹⁰.

Nous avons développé un roman simple, adaptable, et peu coûteux MPS adipeuse appelé « en sandwich le tissu adipeux blanc » (SWAT)¹¹. Nous avons surmonté la flottabilité naturelle des adipocytes en « sandwich » haché primaire tissu adipeux entre les feuilles des cellules stromales dérivées d’adipeux (ADSCs) (Figure 1). La construction 3D résultante récapitule le contact de cellule-cellule et le microenvironnement adipeux natif en entourant les adipocytes matures avec une population de cellules de soutien naturel adipocyte. SWAT a été validé en démontrant la viabilité de 8 semaines, réponse à exogène de signalisation, sécrétion adipokine et greffe dans un modèle animal.

Protocole

Toutes les tâches ont été effectuées dans le respect des protocoles 8759 # et #9189, tel qu’approuvé par le Bureau de la CISR de LSUHSC-NO. Tous les animaux travaux ont été réalisés dans le respect du protocole #3285 approuvées par le Bureau de IACUC participant-no

1. ensemencement d’intercaler les feuilles de la cellule

Remarque : Voir la Figure 1.

1. ADSCs de semences à environ 80 % de confluence en plaques de culture de tissus (6 cm ou 6 plats). Pour chaque puits de SWAT désiré, graines 1 culture de tissus classique bien et 1 puits de taille correspondante sur la plaque de plastique de culture de tissu enduit de poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm).
   Remarque : En conséquence, une plaque 6 puits de SWAT nécessiteront l’ensemencement des cellules sur une plaque standard 6 puits culture tissulaire (couche de base) et une plaque de culture de tissu enduit pNIPAAm 6 puits (couche supérieure). plaques de revêtement pNIPAAm peuvent être achetés dans le commerce ou produites en laboratoire^12,13,14.
2. Maintenir le ADSCs à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % de SVF et 1 x pénicilline/streptomycine_. Modifier les médias tous les 2 jours.
3. Permettre aux cellules de fusionner jusqu'à ce qu’ils deviennent 100 % anastomosé et prennent un motif strié (environ 6 à 8 jours).
   Remarque : Ces cellules devra fonctionner comme une feuille unique cellule intacte afin de stabiliser le tissu adipeux flottant. Insuffisamment confluentes seront fragmenter après ensemencement avec WAT.

2. préparation des fournitures SWAT

1. Préparer plusieurs portions de 10 mL de 1 x Hank Balanced Salt Solution (HBSS) ; préparer suffisamment la quantité désirée de plaques avec volume à revendre.
2. Préparer l’appareil plongeur pour l’ensemencement de SWAT. Construire le piston à l’aide de simples plastiques acryliques, composés d’une tige attachée à un disque rond. Faire en sorte qu’elle s’inscrit dans la circonférence des puits de culture tissulaire (diamètre : < 6 cm pour 6 cm plat, < 3,5 cm pour plaque 6 puits ; masse approximative : 6,7 g pour un plat de 6 cm, 5,1 g pour une plaque 6 puits).
   1. Préparer les plongeurs supplémentaires pour s’assurer que la procédure se déroulera sans heurts en cas qu'il y a un problème avec n’importe quel plongeur individuel.
   2. Enroulez lab ruban sur le pourtour du disque piston, au moins 2 x, pour éviter les fuites de solution de gélatine.
   3. Vaporiser une armoire de sécurité biologique (BSC) avec 70 % EtOH. Pulvériser sur un support de tube à fond conique de 15 mL à l’intérieur de la BSC avec tubes coniques 15 mL de vide, non plafonnés ; tubes contribuera à garantir la mise en place des plongeurs de la gélatine.
   4. Vaporisez soigneusement chaque plongeur rubans avec 70 % EtOH et la place dans un tube conique 15mL sur la grille. Pulvériser les rondelles métalliques (masse approximative 6,3 g) et les placer sur la grille avec une paire de pinces crochu ; les rondelles ajoutera des poids pour les plongeurs lors de l’ensemencement de SWAT.
   5. Fermer la ceinture BSC et allumez la lampe à UV lumière pour faciliter le séchage et la stérilisation.
      NOTE : Idéalement, effectuer cette étape 24 h avant l’ensemencement de SWAT. Vous pouvez également diriger le processus sur le jour du tissu collection/SWAT ensemencement ; Toutefois, dans ce cas, laisser 15 – 45 min de séchage/stérilisation UV.

3. préparation de gélatine pistons — Application aux feuilles de cellule supérieure

1. Faire chauffer un bain d’eau à 75 ° C.
2. Préparer la solution de gélatine en ajoutant 0,75 g de poudre de gélatine à 10 mL de bouillon de 1 x HBSS. Sous une hotte aspirante ajouter 100 µL de 1 NaOH M pour équilibrer le pH de la solution.
   1. Ajouter les stocks de 10 mL pour le bain d’eau et agiter vigoureusement toutes les 5 min jusqu'à ce que la poudre se dissout dans la solution. But pour dissoudre la gélatine en poudre bientôt après l’ajout à la baignoire d’eau chaude.
   2. Mettre en marche le ventilateur BSC, éteindre la lumière UV et soulever le vantail. Vaporiser sur la surface de la BSC et préparer le filtre fournitures (seringues de 5 mL luer-lock et filtres de seringue 0,2 µm). Préparer plusieurs filtres pour filtrer efficacement des volumes suffisants de la gélatine à appliquer aux plongeurs.
3. Lorsque la solution de gélatine atteint une consistance homogène, filtrer la solution et l’appliquer sur les pistons. Charger la seringue avec de la gélatine. Appliquer les feuilles de gélatine pour les plongeurs en plastique à travers le filtre de seringue (~2.5 mL pour une plaque 6 puits, ~4.5 mL pour un plat de 6 cm) et laisser pour solidifier (~ 20 min).
4. Une fois la gélatine solide, déroulez le ruban du bord des plongeurs. Avec une pince crochetée, enlever les feuilles de gélatine du bord extérieur du piston (c.-à-d., les rebords du ménisque). S’assurer que les feuilles de gélatine restantes dans le centre du piston est absolument plat pour maximiser le contact avec la feuille de l’ADSC.
5. Une fois la gélatine excès est enlevé, appliquer doucement les plongeurs de la gélatine aux plaques ADSC pNIPAAm-enduit. Utiliser les rondelles métalliques à peser sur le piston. Pas cisaillement feuilles cellulaire tout en appliquant les plongeurs.
6. Laisser les plongeurs sur les feuilles de la cellule pendant 1,5 h à température ambiante. Incuber les plaques/pistons dans un bain d’eau glacée pendant 1,5 h terminer la dissociation de la plaque de cellules de la surface de la plaque de revêtement pNIPAAm.
   1. Faire preuve de prudence lors de l’incubation dans le bain de glace ; ne laissez pas le bain de glace contaminer les milieux cellulaires durant l’incubation.
   2. À l’issue de l’incubation, nettoyer le fond des plaques pNIPAAm-enduit pour enlever l’eau non stérile.

4. traitement de tissu adipeux blanc

1. Lors de la collecte des tissus adipeux humains de la salle d’opération, garder tous les échantillons dans un récipient stérile qui est sur la glace jusqu'à ce que le SWAT est pour l’ensemencement. Ajouter des éléments multimédias entretien stérile, comme une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), au conteneur de tissu adipeux pour la stabilité des tissus.
2. Ajouter le milieu de culture de cellule glaciale à tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour chaque puits/plat à être ensemencé (100 µL pour une plaque 6 puits, 200 µL pour un plat de 6 cm).
3. Émincer le tissu adipeux.
   1. Cas de tissu adipeux plein, procédez comme suit.
      1. Laver les segments importants du tissu adipeux 3 x dans du PBS stérile et supprimer autant PBS que possible.
      2. Grossièrement hacher le tissu avec des pinces et rasoir stérile et supprimer autant de vascularisation et carénage que possible (voir pour plus de détails).
      3. Finement hacher gras avec le rasoir jusqu'à ce que le tissu haché prend une consistance épaisse et liquide.
         NOTE : Idéalement tissu paraîtra homogène avec les segments individuels pas visibles du WAT même si ce n’est pas toujours possible.
   2. Traiter les lipoaspirate comme suit.
      1. Sous le BSC, bande de gaze stérile sur le dessus d’un bol et placer ce bécher dans un plus grand bécher pour recueillir tout le liquide en excès.
      2. À l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL, dessiner autant lipoaspirate selon les besoins et l’appliquer à la surface de la gaze stérile. Appliquer PBS directement sur cette surface à laver lipoaspirated de graisse et pour enlever le sang excédentaire et les résidus de lipides.
      3. Forceps permet de récupérer les tissus drainés, transférez-la sur une surface de hâchoir stérile et émincer le lipoaspirate.
4. Utiliser un rasoir stérile de couper l’extrémité distale du p1000 pointes de pipette de transfert tissu haché ; Cela réduira la contrainte de cisaillement qui peuvent conduire à la lyse adipocytaire. Après avoir atteint une consistance de bon tissu transfert le volume souhaité de tissu haché dans chaque tube de 1,5 mL (300 – 400 µL pour plaque 6 puits, 500 – 600 µL pour plat de 6 cm). Mélange haché WAT et médias brièvement dans les tubes.
5. Prenez les plaques ADSC et décanter/aspirer les médias. Remplacer les médias avec le mélange WAT/médias de chaque tube de 1,5 mL.
   1. Doucement, retirer les pistons de gélatine les plaques de revêtement pNIPAAm et appliquez-les au mélange WAT sur les embases ADSC. Examiner la monocouche des plaques pNIPAAm-enduit au microscope afin de confirmer le détachement cellulaire.
6. Définir un bloc chauffant à environ 37 – 40 ° C en vertu de la BSC. Avec les pistons toujours en place, déplacer les plaques à la surface du bloc de la chaleur. Ajouter 2 à 3 mL chauffé de milieux de culture pour Incuber les cellules et faciliter la fusion de la gélatine.
7. Après environ 30 min, retirez délicatement les plongeurs de la surface de la plaque. Remplacer les couvercles des plaques base culture de tissus et se déplacer dans un incubateur de culture cellulaire. Une fois que la gélatine a complètement liquéfié à 37 ° C, aspirer et remplacer les milieux de culture cellulaire.
8. Maintenir le SWAT à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un milieu M199 sans rouge de phénol avec 7 insuline µM, 30 dexaméthasone µM, 1 x pénicilline/streptomycine. Maintenir à environ 2 mL de milieu pour plaques 6 puits et 3 mL pour les plats de 6 cm. Modifier les médias tous les 2 jours.

5. récolte SWAT

1. Préparer la collagénase (collagénase de 0,5 mg/mL, 500 nM adénosine, dans du PBS) aliquotes dans des tubes coniques 15 mL (volume approximatif de 10 mL). Geler les tubes et les stocker à-20 ° C.
2. Aspirer à n’importe quel milieu de culture de cellules, laver 1 fois avec du PBS et aspirer puis PBS. Prép. les aliquotes de collagénase de les décongeler dans un bain-marie à 37 ° C.
   NOTE : Idéalement, la solution de collagènase atteindra 37 ° C ; immédiatement après, ajouter le tissu.
3. Ajouter tous les tissus de la plaque SWAT pour les portions individuelles. Récolter des SWAT à l’aide d’un racloir de cellule stérile et transférez-le vers les aliquotes de collagénase avec une pointe de pipette de coupure p1000. Ajouter le tissu directement sur les tubes coniques 15 mL contenant une solution de collagénase.
   1. Par ailleurs, incuber le mélange de tissus/collagénase dans un tube conique de 50 mL ; l’augmentent la surface facilitera davantage la digestion enzymatique.
4. Placer les tubes de l’échantillon dans un agitateur orbital incubé à un angle de 45°. Incuber à 200 tr/min, à 37 ° C pendant 30 à 60 min.
5. Place un 250 µm filtre mesh dans un nouveau tube conique 15 mL pour collection. Versez la solution adipocyte digérées par le filtre.
   Remarque : Cela permettra à toutes les cellules de traverser tout en filtrant les tissus fibreux.
6. Permettre accréditives à siéger pendant 5 min à température ambiante pour permettre à la séparation de phase.
   Remarque : Les adipocytes flottera jusqu’au sommet de la solution alors que les cellules stromales adipeuses (ASCs) seront déposent dans les phases plus bas. Centrifugation pendant 5 min à 500 x g peut également maximiser la séparation des cellules ou la récolte autour de ADSCs dans le culot.
7. À l’aide d’une pointe de pipette de coupure p1000, transférer les adipocytes (le calque flottant au dessus de la solution de collagènase) à un tube de prélèvement de microtubes de 1,5 mL. Prendre ~ 250 µL à la fois, Pipetter lentement le long du bord du tube pour recueillir les adipocytes.
   1. Tourner lentement le tube tout en collectant les adipocytes afin de maximiser la récupération des cellules adhérant à l’intérieur. Garder plus de cellules de dessin jusqu'à ce que le tube de microtubes de 1,5 mL est plein.
8. Retirer le liquide en excès les adipocytes isolés à l’aide d’une seringue jointe à une aiguille (~ 21). Immergez l’aiguille sous la couche flottante d’adipocytes. Agiter l’aiguille brièvement pour déloger les cellules adhérant à l’axe de l’aiguille et ensuite attendre les adipocytes délogées à flotter vers le haut.
9. Lentement, tirer le liquide en excès, en évitant la suppression involontaire des adipocytes. Graduations de tubes de microcentrifuge permet d’isoler systématiquement des volumes d’échantillon (par exemple. 0,1 mL pour chaque échantillon).
10. Utiliser les cellules isolées pour l’extraction de l’ADN/ARN, dosage de l’absorption de glucose, test de lipolyse, etc.

Résultats

Viabilité de SWAT a été initialement évaluée par imagerie série fond clair de clusters individuels de WAT (n = 12) au cours des semaines environ 7,6. Les clusters est resté sécurisés en place sur la monocouche pendant tout ce temps. Légers changements morphologiques ont été observés avec les adipocytes individuels se déformant légèrement ou le déplacement des postes. Toutefois, les adipocytes ni devient multiloculaires au fil du temps, ce qui indique une absence de dédif...

Discussion

Ce protocole détaille l’utilisation de ADSCs pour "sandwich" humain le tissu adipeux blanc ; lignées de cellules humaines ADSC peuvent être isolées par l’intermédiaire des protocoles bien établis,¹⁵. Toutefois, le système peut être adapté pour les besoins de recherche individualisée (comme l’utilisation de cellules 3T3L-1 pour la souris "sandwich" WAT). Ce processus implique la manipulation des tissus humains primaires. Les précautions standard devraient être utilisées ; manip...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics