Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Riepilogo

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Abstract

Tessuto adiposo bianco (WAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione della salute peso e tutti i giorni. Ancora, esistono limitazioni significative ai modelli disponibili colture primarie, i quali hanno fallito fedelmente ricapitolare il microambiente adiposo o estendere la vitalità WAT oltre due settimane. La mancanza di un modello affidabile coltura primaria ostacola gravemente ricerca nel WAT metabolismo e lo sviluppo di farmaci. A tal fine abbiamo utilizzato gli standard di NIH di un sistema di microphysiologic per sviluppare una nuova piattaforma per coltura primaria WAT chiamato 'SWAT' (Sandwich tessuto adiposo bianco). Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di interposizione macinate WAT cluster tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromal. In questo costrutto, campioni WAT sono vitali oltre otto settimane nella cultura. SWAT mantiene l'ECM intatto, contatti cellula-cellula e pressioni fisiche delle condizioni in vivo WAT; Inoltre, SWAT mantiene un robusto profilo trascrizionale, sensibilità ai segnali chimici esogeni e funzione del tessuto intero. SWAT rappresenta un metodo semplice, riproducibile ed efficace della cultura adiposo primario. Potenzialmente, è una piattaforma ampiamente applicabile per la ricerca in fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e sviluppo farmaceutico WAT.

Introduzione

Il tessuto adiposo è l'organo primario dell'obesità, che trasporta annuali costi medici diretti tra $ 147 miliardi e $ 210 miliardi a US¹. L'accumulo di tessuto adiposo contribuisce anche ad altre cause conducenti della morte come malattie cardiache, diabete di tipo II e alcuni tipi di cancro². Modelli di coltura in vitro sono essenziali per gli studi metabolici e lo sviluppo di farmaci, ma i modelli attuali di ricerca di tessuto adiposo hanno carenze principali. Adipociti sono fragile, capace di galleggiare e cellule che non aderiranno alla plastica di coltura delle cellule e pertanto non possono essere coltivate utilizzando metodi di coltura cellulare convenzionale terminalmente differenziano. Dal 1970, diversi metodi sono stati utilizzati nei tentativi di superare queste barriere, compreso l'uso di vetrini coprioggetti, soffitto cultura, coltura di sospensione e matrici extracellulari^{3,4,5, 6 , 7}. Tuttavia, questi metodi sono stati segnati da cellule morte e dedifferenziazione e vengono in genere utilizzati per non più di un periodo di studio di due settimane. Inoltre, questi modelli non tentare ricapitolare il microambiente adiposo nativo come non mantengono intatto ECM, le interazioni tra adipociti e stromal cellule di supporto, né le cellule contrattili forze esercitano sulla vicenda in in vivo WAT.

In assenza di un metodo di cultura adiposa primaria oro-standard, ricerca adiposa si affida principalmente differenziati pre-adipociti (diffAds). DiffAds sono multilocular, aderente e metabolicamente attivo. Al contrario, primari adipociti bianchi sono unilocular, nonadherent e dimostrano relativamente basso metabolismo. Il fallimento degli attuali modelli di cultura adiposa di ricapitolare la fisiologia del tessuto adiposo maturo sano è probabilmente un fattore importante in assenza di farmaci approvati dalla FDA che incidono direttamente adipocytes. Infatti, la mancanza di modelli di organo fisiologico in vitro è un grave problema in tutta la maggior parte dei organi e malattia.

Nel suo documento di posizione che annuncia la creazione del suo programma di Microphysiological Systems (MPS), il National Institutes of Health (NIH) ha riferito che il tasso di successo 2013 attraverso tutti gli studi clinici farmaceutici umani era solo 18% per la fase II e 50% per la fase III studi clinici⁸. Il programma MPS è progettato per affrontare direttamente l'incapacità di monocoltura in vitro di fisiologia umana modello. Il NIH definisce MPSs come sistemi di coltura composto umano primario o cellule staminali in costrutti 3D multicellulari che ricapitolano il funzionamento dell'organo. A differenza dei modelli riduzionisti di colture cellulari immortalizzate, omogenea, MPSs dovrebbe modellano accuratamente cellula-cellula, cellula farmaco, farmaco-farmaco e organo-droga interazioni⁹. A differenza dei metodi di coltura primaria a breve termine, NIH standard impongono sostenibilità MPS per 4 settimane in cultura⁸. Ulteriori dettagli del programma MPS possono essere trovati alla RFAs (#RFA-TR-18-001)^{10 di NIH}.

Abbiamo sviluppato un semplice, romanzo, adattabile, e poco costoso MPS adiposo definito "Sandwich tessuto adiposo bianco" (SWAT)¹¹. Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di "sandwiching" macinato primario del tessuto adiposo tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromale (CSTA) (Figura 1). Il costrutto 3D risultante ricapitola il contatto cellula-cellula e il microambiente adiposo nativo circondando adipocytes maturi con una popolazione di cellule di supporto del adipocyte naturale. SWAT è stato convalidato da dimostrare 8-settimana sostenibilità, risposta alla segnalazione esogeno, secrezione di adipokine e attecchimento in un modello animale.

Protocollo

Tutte le attività sono state effettuate in aderenza ai protocolli 8759 # e #9189, approvato dall'ufficio di LSUHSC-NO. IRB Tutto il lavoro animale è stato eseguito in aderenza al protocollo #3285 approvato dall'ufficio IACUC LSUHSC n.

1. semina di interposizione di strati delle cellule

Nota: Vedere la Figura 1.

1. CSTA seme al circa il 80% confluency in piastre di coltura tissutale (6cm o piastre da 6 pozzetti). Per ogni pozzetto di SWAT desiderato, seme 1 coltura convenzionale ben e 1 Pozzo di dimensione corrispondente sulla piastra di plastica rivestita con poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) di coltura del tessuto.
   Nota: Di conseguenza, una piastra a 6 pozzetti di SWAT richiederà semina di cellule su una piastra di coltura di tessuti standard da 6 pozzetti (strato di base) e una piastra 6 pozzetti rivestite di pNIPAAm coltura tissutale (strato superiore). piastre rivestite con pNIPAAm possono essere acquistati in commercio o prodotti in laboratorio^12,13,14.
2. Mantenere CSTA a 37 ° C e 5% CO₂ in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% FBS e 1 x penicillina/streptomicina_. Cambiare supporto ogni 2 giorni.
3. Permettono che le cellule a fondersi fino a quando non diventano 100% confluenti e prendere su un reticolo striato (circa 6 – 8 giorni).
   Nota: Queste cellule dovrà funzionare come un foglio di singola cellula intatta al fine di stabilizzare il tessuto adiposo capace di galleggiare. Al momento di semina con WAT saranno frammento cellule insufficientemente confluenti.

2. preparazione della SWAT forniture

1. Preparare diverse aliquote di 10 mL di 1 x matassa equilibrato sale soluzione (HBSS); preparare abbastanza per il numero di piastre con volume di ricambio desiderato.
2. Preparare l'apparato di stantuffo per la semina di SWAT. Costruire lo stantuffo con semplice plastica acrilica composta da uno stelo collegato a un disco rotondo. Assicurarsi che si inserisce all'interno della circonferenza dei pozzi di coltura del tessuto (diametro: < 6 cm per piatto di 6cm, < 3,5 cm per piastra a 6 pozzetti; massa approssimativa: 6,7 g per un piatto di 6 cm, 5,1 g su una piastra a 6 pozzetti).
   1. Preparare i tuffatori supplementare per garantire che la procedura verrà eseguito senza problemi in caso che c'è un problema con qualsiasi stantuffo individuo.
   2. Avvolgere nastro di laboratorio intorno al bordo del disco lo stantuffo, almeno 2 x, per impedire la fuoriuscita della soluzione di gelatina.
   3. Spruzzare un armadio di sicurezza biologica (BSC) con 70% EtOH. Spray giù un rack di tubo conico da 15 mL all'interno il BSC con provette coniche da vuoto, scoperchiata 15ml; tubi per proteggere il posizionamento dei tuffatori gelatina.
   4. Spruzzare ogni stantuffo nastro avvolto accuratamente con 70% EtOH e posto in una provetta conica da 15mL sulla cremagliera. Spruzzare le rondelle di metallo (massa approssimativa 6,3 g) e metterli sul rack insieme ad un paio di pinze uncinate; le rondelle aggiungerà peso per i tuffatori durante la semina di SWAT.
   5. Chiudere il battente BSC e accendere il UV luce per facilitare l'asciugatura e sterilizzazione.
      Nota: Idealmente, condurre questo passaggio 24 h prima della semina di SWAT. In alternativa, eseguire il processo il giorno di tessuto collezione/SWAT semina; in questo caso, tuttavia, consentire 15 – 45 min per asciugatura e sterilizzazione UV.

3. preparazione della gelatina tuffatori — applicazione per fogli di cellula superiore

1. Riscaldare un bagno di acqua a 75 ° C.
2. Preparare la soluzione di gelatina aggiungendo 0,75 g di gelatina in polvere per 10 mL di brodo di 1 x HBSS. Sotto cappa aspirante aggiungere 100 µ l di 1 M NaOH per equilibrare il pH della soluzione.
   1. Aggiungere le scorte di 10 mL per il bagno di acqua e agitare vigorosamente ogni 5 min fino a quando la polvere si scioglie in soluzione. Mirano a sciogliere la gelatina in polvere presto dopo l'aggiunta al bagno d'acqua riscaldata.
   2. Accendere il ventilatore BSC, spegnere la luce UV e sollevare il telaio. Spruzzare la superficie BSC e preparare il filtro forniture (siringhe luer-lock 5ml e filtri per siringa 0,2 µm). Preparare più filtri per la tensione in modo efficiente sufficienti volumi di gelatina per applicare a stantuffi.
3. Quando la soluzione di gelatina non raggiunge una consistenza omogenea, filtrare la soluzione e applicarlo per i tuffatori. Caricare la siringa con gelatina. Applicare la gelatina per i tuffatori di plastica attraverso il filtro della siringa (~2.5 mL per una piastra a 6 pozzetti, ~4.5 mL per un piatto di 6 cm) e lasciare per solidificare (~ 20 min).
4. Una volta che la gelatina è solida, scartare il nastro dal bordo dei tuffatori. Con il forcipe uncinato, rimuovere la gelatina dal bordo esterno del pistone (cioè, i bordi sollevati del menisco). Assicurarsi che la gelatina restante nel centro dello stantuffo sia completamente a livello per massimizzare il contatto con lo strato ADSC.
5. Una volta che la gelatina in eccesso viene rimosso, applicare delicatamente i tuffatori di gelatina alle piastre rivestite con pNIPAAm ADSC. Utilizzare le rondelle di metallo per pesare giù lungo lo stantuffo. Non tosare strati delle cellule durante l'applicazione i tuffatori.
6. Lasciare i tuffatori sui fogli delle cellule per 1,5 h a temperatura ambiente. Incubare le piastre/stantuffi in un bagno di acqua ghiacciata per 1,5 h per completare la dissociazione dello strato di cellule dalla superficie della placca pNIPAAm-rivestito.
   1. Prestare attenzione durante l'incubazione in bagno di ghiaccio; non lasciare che il bagno di ghiaccio contaminare il media delle cellule durante l'incubazione.
   2. Al termine dell'incubazione, pulire il fondo delle piastre rivestite con pNIPAAm per rimuovere l'acqua non sterile.

4. elaborazione del tessuto adiposo bianco

1. Quando si raccolgono tessuto adiposo umano dalla sala operatoria, è possibile mantenere tutti i campioni in un contenitore sterile che è il ghiaccio fino a SWAT è quello di essere seminato. Aggiungere mezzi di manutenzione sterile, ad esempio tampone fosfato salino (PBS), contenitore di tessuto adiposo per la stabilità dei tessuti.
2. Aggiungere cella fredda di coltura per provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni pozzo/piatto di essere seminato (100 µ l per una piastra a 6 pozzetti, 200 µ l per un piatto di 6 cm).
3. Tritare il tessuto adiposo.
   1. Per segmenti di tessuto adiposo solido, procedere come segue.
      1. Lavare grandi segmenti del tessuto adiposo 3 x in PBS sterile e rimuovere quanto più PBS come possibile.
      2. Grossolanamente tritate tessuto con forcipe e rasoio sterile e rimuovere quanto più sistema vascolare e la fascia come possibile (vedi discussione per maggiori dettagli).
      3. Tritare finemente il grasso con il rasoio fino a quando macinata tessuto assume consistenza liquida.
         Nota: Idealmente tessuto apparirà omogeneo con nessun visibili singoli segmenti di WAT anche se questo non è sempre possibile.
   2. Processo eseguito come segue.
      1. Sotto il BSC, nastro di garza sterile sulla cima di un becher e porre questo Becher in un bicchiere più grande per raccogliere il liquido in eccesso.
      2. Utilizzando una pipetta sierologica di 25 mL, disegnare tanto lipoaspirato come necessario e applicarlo alla superficie della garza sterile. Applicare PBS direttamente a questa superficie per lavare lipoaspirated grasso e rimuovere il sangue in eccesso e dei residui del lipido.
      3. Utilizzare pinze per recuperare dei tessuti drenati, trasferirlo in una superficie di macinazione sterile e tritare il lipoaspirato.
4. Utilizzare un rasoio sterile per tagliare l'estremità distale del p1000 puntali per trasferire macinato tessuto; Questo ridurrà la sollecitazione di taglio che può portare a lisi degli adipociti. Una volta raggiunta una consistenza adeguata del tessuto è possibile trasferire il volume desiderato del tessuto macinato per ogni provetta da 1,5 mL (300 – 400 µ l per piastra a 6 pozzetti, 500 – 600 µ l per piatto 6 cm). Mix tritato WAT e media brevemente nei tubi.
5. Prendere le piastre di base ADSC e decantare/aspirare i media. Sostituire il supporto con la miscela di WAT/media da ogni provetta da 1,5 mL.
   1. Rimuovere i tuffatori di gelatina dalle piastre rivestite con pNIPAAm delicatamente e applicarli alla miscela WAT sulle piastre ADSC base. Esaminare il monostrato delle piastre rivestite con pNIPAAm sotto un microscopio per confermare la separazione cellulare.
6. Impostare un blocco di calore a circa 37-40 ° C sotto il BSC. Con i tuffatori ancora al suo posto, è possibile spostare le piastre alla superficie del blocco termico. Aggiungere 2 – 3 mL di terreni di coltura riscaldato per incubare le cellule e facilitare la fusione della gelatina.
7. Dopo circa 30 min, rimuovere delicatamente i tuffatori dalla superficie della placca. Sostituire i coperchi delle piastre di coltura del tessuto base e spostare in un'incubatrice di coltura cellulare. Una volta che la gelatina ha completamente liquefatto a 37 ° C, aspirare e sostituire mezzi di coltura delle cellule.
8. Mantenere la SWAT a 37 ° C e 5% di CO₂ nel medium M199 rosso fenolo-senza con insulina di 7 µM, 30 µM desametasone, 1x penicillina/streptomicina. Mantenere circa media di 2 mL per piastre da 6 pozzetti e 3 mL per piatti di 6 cm. Cambiare supporto ogni 2 giorni.

5. SWAT Harvest

1. Preparare la collagenosi (0,5 mg/mL collagenosi, 500 adenosina nM, in PBS) aliquote in provette coniche da 15 mL (volume approssimativo di 10 mL). I tubi di congelare e conservare a-20 ° C.
2. Qualsiasi terreno di coltura dalle cellule di aspirare, lavare 1x con PBS e quindi aspirare PBS. Preparare le aliquote di collagenasi di loro scongelamento in bagnomaria a 37 ° C.
   Nota: Idealmente, la soluzione di collagenasi raggiungerà 37 ° C; subito dopo, aggiungere del tessuto.
3. Aggiungere tutto il tessuto dalla piastra SWAT le aliquote individuali. SWAT utilizzando una scrapper sterile cella di raccolta e trasferirlo alle aliquote della collagenosi con una punta di pipetta p1000 di cut-off. Aggiungere tessuto direttamente le provette coniche da 15 mL contenente soluzione della collagenosi.
   1. In alternativa, incubare la miscela di tessuto/collagenasi in una provetta conica da 50 mL; alla superficie maggiore faciliterà ulteriormente la digestione enzimatica.
4. Inserire le provette campione in un agitatore orbitale incubato in un angolo di 45°. Incubare a 200 giri/min, a 37 ° C per 30 – 60 min.
5. Posto a 250 µm filtro a rete in una nuova provetta conica 15 mL per raccolta. Versare la soluzione del adipocyte digerito attraverso il filtro.
   Nota: Questo permetterà tutte le celle di passare attraverso mentre filtrando il tessuto fibroso.
6. Consentire il flusso-attraverso a riposare per 5 min a temperatura ambiente per consentire per separazione di fase.
   Nota: Gli adipociti galleggerà verso l'alto della soluzione, mentre le cellule stromale adipose (ASCs) si depositerà nelle fasi più bassa. Centrifugazione per 5 min a 500 x g può anche massimizzare la separazione cellulare o raccolto che circondano CSTA nel pellet.
7. Utilizzando un puntale di cut-off p1000, trasferire gli adipociti (il livello fluttuante nella superiore della soluzione della collagenosi) in una provetta di raccolta microcentrifuga da 1,5 mL. Prendere ~ 250 µ l in un momento, pipettare lentamente lungo il bordo della provetta per raccogliere gli adipociti.
   1. Ruotare lentamente il tubo mentre raccoglieva gli adipociti per massimizzare il recupero delle cellule aderenti all'interno. Tenere disegno più cellule fino a quando il tubo per microcentrifuga da 1,5 mL è completo.
8. Rimuovere il liquido in eccesso da adipociti isolati utilizzando una siringa collegata ad un ago (~ 21). Immergere l'ago sotto il livello del adipocyte fluttuante. Agitare l'ago brevemente per rimuovere eventuali cellule aderenti all'albero dell'ago e quindi attendere che gli adipociti sloggiati a galleggiare verso l'alto.
9. Disegnare lentamente il liquido in eccesso, facendo attenzione ad evitare la rimozione involontaria degli adipociti. Utilizzare graduazioni di tubo del microcentrifuge per isolare costantemente i volumi di campione (ad esempio,. 0,1 mL per ogni campione).
10. Utilizzare le cellule isolate per estrazione DNA/RNA, analisi di assorbimento del glucosio, dosaggio di lipolisi, ecc.

Risultati

Attuabilità della SWAT inizialmente è stata valutata da formazione immagine seriale campo chiaro di singoli WAT cluster (n = 12) circa 7,6 settimane. Cluster è rimasto protetti in posto su monostrato in tutto questo tempo. Lievi cambiamenti morfologici sono stati osservati con singoli adipociti orditura leggermente o posizioni di spostamento. Tuttavia, adipociti né diventano multilocular nel corso del tempo, che indica una mancanza di dedifferentiation, né fatto essi presentano segni...

Discussione

Questo protocollo dettaglia l'uso di CSTA panino la maggior parte del tessuto adiposo umano bianco; linee cellulari umane di ADSC possono essere isolate tramite protocolli ben stabiliti¹⁵. Tuttavia, il sistema può essere adattato per esigenze di ricerca individualizzata (ad esempio utilizzando cellule di 3T3L-1 al mouse panino WAT). Questo processo comporta la manipolazione del tessuto umano primario. Precauzioni di sicurezza standard dovrebbero essere impiegati; gestire tessuti umani come agenti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics