Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

Resumo

Tecido adiposo branco (WAT) tem deficiências críticas em seus modelos de cultura primária atual, dificultando o Desenvolvimento farmacológico e estudos metabólicos. Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um sistema de microphysiological de tecido adiposo por WAT imprensar entre lençóis de células do estroma. Essa construção fornece uma plataforma estável e adaptável para a cultura primária de WAT.

Resumo

Tecido adiposo branco (WAT) desempenha um papel crucial na regulação da saúde peso e todos os dias. Ainda assim, existem limitações significativas para modelos de cultura primária disponíveis, os quais não conseguiram fielmente recapitular o microambiente adiposa ou estender a viabilidade WAT para além de duas semanas. A falta de um modelo de cultura primária confiável severamente impede investigação em WAT metabolismo e desenvolvimento de drogas. Para tal, utilizamos padrões do NIH de um sistema de microphysiologic para desenvolver uma nova plataforma para cultura primária de WAT chamada 'SWAT' (imprensada tecido adiposo branco). Superamos a flutuabilidade natural dos adipócitos por picada WAT aglomerados entre lençóis de células do estroma adiposo-derivado de imprensa. Nessa construção, WAT amostras são viáveis em oito semanas em cultura. SWAT mantém o ECM intacta, contatos de célula para célula e pressões físicas na vivo condições WAT; Além disso, a SWAT mantém um perfil transcricional forte, sensibilidade à sinalização química exógena e função do tecido inteiro. SWAT representa um método simples, reprodutível e eficaz de cultura primária de tecido adiposo. Potencialmente, é uma plataforma amplamente aplicável para pesquisa em fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e desenvolvimento farmacêutico WAT.

Introdução

Tecido adiposo é o principal órgão de obesidade, que acarreta custos médicos anuais directos entre US $ 147 bilhões e US $ 210 bilhões nos E.U.¹. O acúmulo de tecido adiposo contribui também para outras principais causas de morte, tais como doenças cardíacas, diabetes tipo II e certos tipos de câncer². Modelos de cultura in vitro são essenciais para estudos metabólicos e desenvolvimento de drogas, mas modelos de pesquisa atual do tecido adiposo tem grandes deficiências. Adipócitos são frágeis, flutuante e células que não aderir ao plástico de cultura de células e, portanto, não podem ser cultivadas usando métodos de cultura de células convencional terminalmente diferenciadas. Desde a década de 1970, vários métodos têm sido utilizados em tentativas para superar esses obstáculos, incluindo a utilização de lamelas de vidro, teto cultura, cultura de suspensão e matrizes extracelulares^{3,4,5, 6 , 7}. no entanto, esses métodos foram marcados por morte celular e o quê, e são usados tipicamente para não mais do que um período de duas semanas de estudo. Além disso, estes modelos não tente recapitular o microambiente adiposa nativo, como eles não mantêm o ECM intacta, as interações entre adipócitos e do estroma apoiar as células, nem as forças contráteis células exercem uns contra os outros em in vivo WAT.

Na ausência de um método de cultura de tecido adiposo primária padrão-ouro, pesquisa adiposa dependeu principalmente pre-adipócitos diferenciados (diffAds). DiffAds são multilocular, aderentes e metabolicamente ativas. Por outro lado, primários adipócitos brancos são unilocular, de e demonstram o metabolismo relativamente baixo. O fracasso dos modelos atuais de cultura de tecido adiposo para recapitular a fisiologia do tecido adiposo maduro saudável provavelmente é um fator importante na ausência de medicamentos aprovados pela FDA que destino diretamente adipócitos. Na verdade, a falta de fisiológica em vitro modelos de órgãos é um grande problema na maioria dos órgãos e doença.

Em seu papel de posição anunciando a criação de seu programa de sistemas de Microphysiological (MPS), o National Institutes of Health (NIH) informou que a taxa de sucesso de 2013 em todos os ensaios clínicos farmacêuticas humanas foi apenas 18% para a fase II e 50% para a fase III ensaios clínicos⁸. O programa MPS é projetado para atender diretamente a incapacidade da monocultura em vitro de fisiologia humana de modelo. O NIH define MPSs como sistemas de cultura compostos de humana primária ou células-tronco em multicelulares construções 3D que recapitular o funcionamento do órgão. Ao contrário dos modelos reducionistas de culturas celulares homogêneos, imortalizado, MPSs com precisão devem modelo celular, droga-célula, medicamentosas e interações de droga-órgão⁹. Ao contrário de métodos de cultura primária a curto prazo, padrões de NIH ditam sustentabilidade MPS durante 4 semanas em cultura⁸. Mais detalhes do programa MPS podem ser encontrados no RFAs (#RFA-TR-18-001)^{10 do NIH}.

Nós desenvolvemos um simples, romance, adaptável, e barato MPS adiposa denominado "imprensado tecido adiposo branco" (SWAT)¹¹. Superamos a flutuabilidade natural dos adipócitos por "imprensar" picado principal tecido adiposo entre lençóis de células do estroma adiposo-derivado (ADSCs) (Figura 1). A construção 3D resultante recapitula o contato célula-célula e o microambiente adiposa nativo cercando adipócitos maduros, com uma população de células de suporte natural dos adipócitos. SWAT foi validada por demonstrar a viabilidade de 8 semanas, resposta a sinalização exógenos, adipokine secreção e enxertia em um modelo animal.

Protocolo

Todas as tarefas foram realizadas em conformidade com os protocolos #8759 e #9189, aprovado pelo IRB escritório de LSUHSC-NO. Todo o trabalho animal foi realizado na adesão ao protocolo #3285 aprovado pelo Instituto IACUC no LSUHSC-n. º

1. semeadura de imprensa folhas de célula

Nota: Consulte a Figura 1.

1. Sementes ADSCs em aproximadamente 80% de confluência em placas de cultura de tecidos (6 cm ou placas boas 6). Para cada poço da SWAT desejado, semente 1 cultura de tecido convencional bem e 1 poço de tamanho correspondente na placa de cultura de tecidos poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-revestido plástico.
   Nota: Nesse sentido, uma placa de 6 da SWAT exigirá a propagação de células em uma placa de cultura de tecido padrão 6-bem (camada de base) e uma placa de cultura de tecido revestido pNIPAAm 6-poços (camada superior). Placas revestidas de pNIPAAm podem ser adquiridas comercialmente ou produziram em laboratório^12,13,14.
2. Manter ADSCs em 37 ° C e 5% CO₂ em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1 x penicilina/estreptomicina_. Mudar a mídia cada 2 dias.
3. Permitir que as células a se aglutinar até que eles se tornam 100% confluente e assumem um padrão estriado (aproximadamente 6-8 dias).
   Nota: Estas células precisa funcionar como uma folha única célula intacta para estabilizar o tecido adiposo flutuante. Insuficientemente confluentes fragmentará após semeadura com WAT.

2. preparação da SWAT suprimentos

1. Preparar várias alíquotas de 10 mL de 1 x Hank está equilibrado sal solução (HBSS); Prepare o suficiente para o número desejado de placas com volume de sobra.
2. Prepare o aparelho atuador para a propagação da SWAT. Construa o êmbolo usando plástico acrílico simples, composto de uma haste anexada a um disco redondo. Certifique-se de que ele se encaixa dentro da circunferência dos poços de cultura de tecidos (diâmetro: < 6cm para prato de 6cm, < 3,5 cm para placa de 6; massa aproximada: 6,7 g para um prato de 6cm, 5,1 g para uma placa de 6).
   1. Prepare os êmbolos extras para garantir que o procedimento será executado sem problemas no caso que há um problema com qualquer atuador individual.
   2. Enrole a fita de laboratório ao redor da borda do disco atuador, pelo menos 2x, para evitar o vazamento da solução de gelatina.
   3. Pulverizar um gabinete de segurança biológica (CSB) com 70% EtOH. Uma mangueirada um rack de tubo cônico de 15 mL dentro do BSC com tubos de 15ml vazias, sem tampa cónica; tubos ajudará a garantir o posicionamento dos êmbolos a gelatina.
   4. Pulverize cada êmbolo enrolado com fita cuidadosamente com 70% EtOH e coloque em um tubo cônico de 15mL na prateleira. Spray-anilhas metálicas (6,3 g de massa aproximada) e colocá-los na prateleira junto com um par de pinças adunco; as anilhas irão adicionar peso para os êmbolos durante a semeadura da SWAT.
   5. Feche a janela BSC e ligue o UV, luz para facilitar a secagem e a esterilização.
      Nota: O ideal realizar esta etapa 24 h antes da semeadura da SWAT. Alternativamente, conduzir o processo no dia do tecido coleção/SWAT de semeadura; no entanto, neste caso, permita 15-45 min para UV secagem/esterilização.

3. preparação da gelatina êmbolos — aplicativo para celular superior folhas

1. Aqueça um banho de água a 75 ° C.
2. Prepare a solução de gelatina, adicionando 0,75 g de pó de gelatina para 10 mL caldo de 1 x HBSS. Sob uma coifa Adicione 100 µ l de 1 M NaOH para equilibrar o pH da solução.
   1. Adicionar os estoques de 10 mL para o banho de água e agitar vigorosamente a cada 5 min até que o pó se dissolve na solução. Objectivo de dissolver a gelatina em pó logo após a adição no banho de água aquecida.
   2. Ligue o ventilador BSC, apague a luz UV e aumentar a faixa. Borrife a superfície BSC e preparar o filtro de suprimentos (seringas de 5ml luer-lock e filtros de seringa 0,2 µm). Prepare vários filtros de forma eficiente tensão volumes suficientes de gelatina para aplicar a êmbolos.
3. Quando a solução de gelatina atinge uma consistência homogênea, filtrar a solução e aplicá-lo para o desentupidor. Carrega a seringa com gelatina. Aplicar a gelatina para os plásticos êmbolos através do filtro de seringa (~2.5 mL para uma placa de 6, ~4.5 mL para um prato de 6 cm) e deixar para solidificar (~ 20 min).
4. Uma vez que a gelatina é sólida, Desembrulhe a fita da borda dos êmbolos. Com gancho pinça, retire a gelatina da aresta exterior do êmbolo (ou seja, as bordas levantadas do menisco). Certifique-se de que a gelatina restante no centro do êmbolo está completamente nivelada para maximizar o contato com folha ADSC.
5. Uma vez que a gelatina em excesso é removida, aplica suavemente os êmbolos de gelatina para as placas ADSC pNIPAAm revestidas. Use as anilhas de metal para pesar para baixo o êmbolo. Não ao cisalhamento folhas de célula, aplicando os êmbolos.
6. Deixe os êmbolos sobre as folhas de célula para 1,5 h à temperatura ambiente. Incube em um banho de água gelada para 1,5 h completar a dissociação da camada de células da superfície da placa pNIPAAm-revestido de placas/êmbolos.
   1. Tenha cuidado ao mesmo tempo incubando no banho de gelo; Não permita que o banho de gelo para contaminar a mídia celular durante a incubação.
   2. Depois de completar a incubação, limpe a parte inferior das placas revestidas pNIPAAm para remover a água não estéril.

4. processamento de tecido adiposo de branco

1. Quando coletar tecido adiposo humano da sala de cirurgia, manter todas as amostras em recipiente estéril que é no gelo até SWAT é para ser semeado. Adicione mídia estéril de manutenção, tais como fosfato-salino (PBS), ao recipiente de tecido adiposo para estabilidade do tecido.
2. Adicione o meio de cultura celular de frio para tubos de microcentrifuga 1,5 mL para cada poço/prato para ser semeado (100 µ l para uma placa de 6, 200 µ l para um prato de 6 cm).
3. Picar o tecido adiposo.
   1. Para segmentos de sólido tecido adiposo, proceda como a seguir.
      1. Lave a grandes segmentos do tecido adiposo 3 x em PBS estéril e remover tanto PBS quanto possível.
      2. Grosseiramente picar tecido com pinça e navalha estéril e remover tanto vasculatura e fáscia quanto possível (veja a discussão para mais detalhes).
      3. Picar finamente gordura com navalha até picado tecido assume consistência espessa, líquida.
         Nota: Idealmente tecido aparecerá homogêneo com nenhum segmentos individuais visíveis de WAT embora isso nem sempre é possível.
   2. Processo de lipoaspirate da seguinte forma.
      1. Sob o BSC, fita de gaze estéril por cima de um copo e colocar esse copo num copo maior para coletar qualquer excesso de líquido.
      2. Usando uma pipeta de 25 mL serológicos, desenhar tanto lipoaspirate conforme necessário e aplicá-lo à superfície de gaze estéril. Aplica o PBS diretamente para esta superfície para lavar lipoaspirated gordura e para remover o excesso de sangue e resíduo de lipídios.
      3. Use fórceps para recuperar tecido drenado, transferi-lo para uma superfície estéril de picagem e picar o lipoaspirate.
4. Use uma lâmina estéril para cortar a extremidade distal de pontas de pipetas p1000 transferir tecido picado; Isto minimizará a tensão de cisalhamento que podem levar a lise do adipócito. Uma vez atingida uma consistência adequada de tecido transferi o volume desejado de tecido picado para cada tubo de 1,5 mL (300 – 400 µ l para a placa de 6, 500 – 600 µ l para o prato de 6 cm). Misture picada WAT e mídia brevemente nos tubos.
5. Levar os pratos ADSC base e decantar/aspiração da mídia. Substitua a mídia com a mistura WAT/meios de comunicação de cada tubo de 1,5 mL.
   1. Delicadamente, retire os êmbolos de gelatina as chapas revestidas pNIPAAm e aplicá-las à mistura com as placas base do ADSC WAT. Examine a monocamada das placas revestidas pNIPAAm sob um microscópio para confirmar o desprendimento celular.
6. Defina um bloco de calor para aproximadamente 37 – 40 ° C sob o BSC. Com o desentupidor ainda no lugar, mova as placas à superfície do bloco calor. Adicione 2-3 mL de meios de cultura aquecido para incubar as células e facilitar a gelatina derreter.
7. Depois de ~ 30 min, retire com cuidado os êmbolos da superfície da placa. Substitua as tampas das placas de cultura de tecido de base e mover para uma incubadora de cultura celular. Uma vez que a gelatina tem completamente liquefeito a 37 ° C, Aspire e substituir os meios de cultura de células.
8. Manter a SWAT a 37 ° C e 5% de CO₂ em vermelho de fenol-livre o meio M199 com 7 insulina µM, 30 dexametasona µM, 1x penicilina/estreptomicina. Manter-se em aproximadamente 2 mL mídia para placas boas 6 e 3 mL para os pratos de 6 cm. Mudar a mídia cada 2 dias.

5. SWAT colheita

1. Preparar a colagenase (colagenase 0,5 mg/mL, adenosina de 500 nM, em PBS) alíquotas em tubos cônico de 15 mL (volume aproximado de 10 mL). Congelar os tubos e armazená-los a-20 ° C.
2. Aspirar a qualquer meio de cultura de células, lavar 1x com PBS e depois Aspire PBS. Prepare as alíquotas de colagenase por-los descongelar em banho maria a 37 ° C.
   Nota: Idealmente, a solução de colagenase chegará a 37 ° C; imediatamente a seguir, adicione o tecido.
3. Adicione todo o tecido da placa da SWAT para as alíquotas individuais. Colheita da SWAT usando uma scrapper célula estéril e transferi-lo para as alíquotas de colagenase com uma ponta de pipeta p1000 Cut-off. Adicione o tecido diretamente para os tubos cônico de 15 mL contendo solução de colagenase.
   1. Alternativamente, incubar a mistura de tecidos/colagenase em um tubo cónico de 50 mL; a maior área de superfície mais facilitará a digestão enzimática.
4. Coloque os tubos de amostra em um agitador orbital incubado em um ângulo de 45°. Incube a 200 rpm, a 37 ° C por 30 a 60 min.
5. Lugar uma 250 µm filtro de malha em um novo tubo cônico de 15 mL para coleção. Despeje a solução digerida dos adipócitos através do filtro.
   Nota: Isto permitirá que todas as células a passagem durante a filtragem de tecido fibroso.
6. Permita a passagem sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente para permitir a separação de fases.
   Nota: Os adipócitos irão flutuar para o topo da solução enquanto as células do estroma adiposas (ASCs) vão resolver para as fases mais baixas. Centrifugação por 5 min a 500 x g também pode maximizar a separação da pilha ou colheita em torno ADSCs em pelota.
7. Usando uma ponta de pipeta corte p1000, transferi os adipócitos (a camada flutuante no topo da solução de colagenase) para um tubo de coleta de microcentrifuga de 1,5 mL. Tendo ~ 250 µ l de cada vez, pipete lentamente ao longo da borda do tubo para coletar os adipócitos.
   1. Gire o tubo lentamente enquanto coleta os adipócitos para maximizar a recuperação de células aderindo ao interior. Mantenha mais células de desenho até que o tubo de 1,5 mL microcentrifuga está cheio.
8. Remova o excesso de líquido os adipócitos isolados, usando uma seringa anexada a uma agulha (~ 21). Submergi a agulha sob a camada flutuante do adipócito. Agitar a agulha brevemente para desalojar qualquer células aderindo ao eixo da agulha e depois esperar que os adipócitos desalojados a flutuar para o topo.
9. Desenhe lentamente o líquido em excesso, tomando cuidado para evitar a remoção involuntária dos adipócitos. Use microcentrifuga graduações de tubo para isolar consistentemente volumes de amostra (por exemplo,. 0,1 mL para cada amostra).
10. Use as células isoladas para extração de DNA/RNA, ensaio de Lipólise, ensaio de absorção de glicose, etc.

Resultados

Viabilidade da SWAT foi inicialmente avaliada por serial brightfield imagem de clusters individuais de WAT (n = 12) aproximadamente 7,6 semanas. Clusters de permaneceram seguras no lugar sobre a monocamada durante todo este tempo. Ligeiras alterações morfológicas foram observadas com adipócitos individuais entortar ligeiramente ou trocando de posição. No entanto, adipócitos nem tornar-se multilocular ao longo do tempo, indicando uma falta de quê, nem fizeram eles apresentam sinais...

Discussão

Este protocolo detalha o uso de ADSCs para sanduíche branco humana tecido adiposo; linhas de células humanas ADSC podem ser isoladas através de de protocolos bem estabelecidos¹⁵. No entanto, o sistema pode ser adaptado para as necessidades de pesquisa individualizada (como o uso de células de 3T3L-1 para mouse sanduíche WAT). Esse processo envolve manipulação de tecido humano primário. Precauções de segurança padrão devem ser empregadas; lidar com tecidos humanos como patógenos BSL-2 ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x HBSS	Thermofisher	14185052
Gelatin	Sigma-aldrich	G9391
Collagenase	Sigma-aldrich	C5138
Adenosine	Sigma-aldrich	A9251
DMEM	Thermofisher	11995065
M199 Media	Thermofisher	11043023	Phenol red-free
250 µm Mesh Filter	Pierce	87791
0.2 µm Syringe Filter	Celltreat	229747
5 mL Luer-Lok syringes	BD	309646
Metal Washers			These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g
Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker	VWR	10020-988	Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block			Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath			Set to ~75 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell	Nunc	174902  or 174901	These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus			These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics