İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Özet

Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

Özet

Bitkiler, algler ve Diyatomlarla fotosentetik performansı güçlü ışık hasat ve enerji hızlı ve verimli regülasyonu kloroplast thylakoid membran transfer işlemlerinde bağlıdır. Diyatomlarla anteni hasat ışık, sözde fucoxanthin klorofil a/c bağlayıcı proteinler (FCP), ışık emilimi için gerekli ve fotosentetik tepki verimli transferi de fotoğraf-koruma aşırı ışık gelince merkezleri. Bu iki işlev arasında geçiş araştırma uzun zamandır devam eden bir mesele. Bu çalışmaların çoğu FCP ile deterjan micelles gerçekleştirilen. Etkileşim çalışmaları için deterjanlar, hangi FCP kompleksleri belirsiz bir toplama için yol kaldırılmıştır. Bu yaklaşım, eserler ve fizyolojik olarak ilgili verileri arasında ayırt etmek zordur. Bu nedenle, FCP ve kompleksleri hasat diğer bağlı membran ışık hakkında daha değerli bilgiler yerel lipid ortamlarındaki katıştırılmış Eğer protein-protein etkileşimleri, enerji transferi ve diğer spektroskopik özellikleri inceleyerek elde edilebilir. En büyük avantajı lipozomlar tanımlı boyutunu ve hangi tarafından FCP kümeleme ölçüde kontrol edilir bir tanımlanmış lipid/protein oranı olması. Ayrıca, in vivo hasat ışık düzenleyen pH ve iyon kompozisyon değişiklikleri kolayca benzetimi yapılabilir. Thylakoid membran ile karşılaştırıldığında lipozomlar elde edilir ve spektroskopik veri anlamak daha kolay kılan daha homojen ve daha az karmaşık. Protokol FCP yalıtım ve arıtma, lipozom hazırlık ve FCP birleşme içine lipozomlar doğal lipid bileşimi ile ilgili yordamı açıklamaktadır. Sonuçlar tipik bir uygulamadan verilen ve tartışıldı.

Giriş

Fotosentetik canlılar Diyatomlarla gibi sürekli değişen ışık koşulları ile başa çıkmak ve yüksek fotosentetik verimliliği sürdürmek ve aşırı ışık tarafından fotoğraf-oksidatif hasarı korumak sofistike calıştıkları mekanizmaları ile yanıt. Bir büyük ışık-koruyucu fotosentetik ökaryotlarda yüksek enerji su verme (q_E) olmayan fotokimyasal su verme (NPQ) hafif stres koşulları^{1,2 altında ana katkısı olarak oluşur emilen ışık işlemidir ,3}. Işık hasat Anten kompleksleri (LHC) uyarma enerji transferi yolları Yönetmelikte katılmaktadırlar. Yanıt yüksek ışık olarak düşük pH kloroplast lümen, anten sistem anahtarları devlet su verme durumuna hasat ışık indüklenen. Bu enerji dissipative devlet photosystems (PS) ve diğer kompleksleri thylakoid zarda fotoğraf-oksidasyon korur. Fotosentetik ökaryotlarda q_E genellikle iki faktör^1,2,3tarafından indüklenen. Düşük pHiçin yanıt protein hasat özel ışık bir faktördür. PsbS protein yüksek bitkiler⁴q_E neden olmaktadır. LhcSRs⁵PsbS faaliyete göre modüle, neden yeşil algler⁶'_E q. Diyatomlarla yapısal olarak LHCSRs^7,8,9,10' a ilgili Lhcx gibi proteinler sahip.

İkinci q_E nerede karotenoidler anten fotoğraf-koruyucu forma de-epoxidation tarafından dönüştürülür ve epoxidation tarafından yeniden dönmek xanthophyll döngüsü faktördür. Bitki ve yeşil algler, violaxanthin zeaksantin için dönüştürülür. Diyatomlarla, diadinoxanthin diatoxanthin, sonra NPQ¹¹ölçüde ile karşılıklı olarak ilişkilendirir dönüştürülür. Bitki ve yosun LHCs ilgili evrimsel olsa anten hasat diatom ışık bazı özelliklerine sahiptir. Fotoğraf-koruma için hasat ışık geçiş son derece hızlı ve NPQ kapasitesi daha bitkiler¹²' ye göre. Bu neden Diyatomlarla okyanus net birincil üretim¹³ilâ % 45 sorumlu oldukları bir şekilde farklı ekolojik niş içinde çok başarılı bir nedeni olabilir. Bu nedenle, diatom sistemleri hasat ışık fotosentez araştırma ilginç bir nesne vardır.

Merkezli türler Cyclotella meneghiniana, thylakoid içsel ışık sistemleri sonra pigmentler adlı hasat sahip gibi Diyatomlarla - fucoxanthin, klorofil (chl) a ve c, dolayısıyla FCP proteinler, hasat ışık bağlama FCPs gibi vardır birçok membran katmandan oluşan thylakoid membran sisteminde gömülü. Diyatomlarla üç thylakoids grupları oluşturur. Bu karmaşık durum thylakoid zarda moleküler düzeyde çalışmaya zor yapar. Buna ek olarak, birçok bileşenleri (yukarı bakın) hasat ışık düzenlenmesi için katkıda bulunur. Bu nedenle, pek çok yaklaşım içinde kompleksleri gibi n-Lauryl-β-D-membran solubilize ama FCP kompleksleri sağlam tutmak maltopyranoside (β-demir), hafif deterjan kullanarak zar izole edildi. İntramolecular enerji transferi^14,15,16,17araştırmak için çözündürüldükten FCP kullanarak birçok spektroskopik çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Enerji transferi Yönetmeliği ile diğer Anten kompleksleri veya photosystems excitonic etkileşim ihtiyacı ancak, bu eski yaklaşım sınırlı alınmaya başlanmıştır. Kompleksleri arasındaki etkileşimi kayıp olduğu için bu nedenle, bu tür çalışmalar çözündürüldükten kompleksleri ile uygulanmaz.

Önemli bir anten Yönetmelikte "moleküler kalabalık" anten ve thylakoid membran¹⁸photosystems özelliğidir. Eskiden, basit bir yaklaşım bu etkisi simüle etmek için yapılmıştır tüp bebek. Anten kompleksleri rasgele toplama için bu da neden deterjan kaldırıldı. Her ne kadar bazı makul veri bu yaklaşım^17,19tarafından elde edildi, deterjan kaldırma durumu vivo içinde yansıtmaz ve kompleksleri onların düzenli Tersiyer etkileşim değil bu yana bazı sınırlamalar vardır yapısı.

Lipozomlar kullanımı birkaç eski sınırlamalar üstesinden gelir. Üçüncül yapı hala tam olarak sağlamdır. Lipozom membran Anten kompleksleri için yarı doğal bir ortam sağlar. Membran lipozom iç dış ortamdan ayıran. Bu şekilde, lipozomlar iyon ve pH degradeleri de taşıma işlemleri gelince, çalışmalar için iki reaksiyon bölmeler sağlar. Ayrıca, deneysel sistem parametrelerini daha kolay thylakoid membran araştırmaları kontrol edilebilir. Lipozomlar zaten fotosentetik kompleksleri eğitim için mükemmel bir araç olarak gösterildi. Geçmişte büyük bir odak bitki nerede değişmiş lipid kompozisyon etkisini LHC II²⁰üzerinde test edildi LHC oldu. Diğer yaklaşımlar, farklı LHC II arasındaki protein-protein etkileşimi incelenen²¹idi. Ayrıca, yeşil algler bazı çalışmalarda spontan LHC²²arasında kümeleme açıklayan gerçekleştirilmiştir. Diyatomlarla sucul ekosistemler için önemi göz önüne alındığında, görece az sayıda çalışmalar Diyatomlarla Anten kompleksleri ile gerçekleştirilmiştir. İki çalışma nerede FCP anten²³ ve FCP yanıt elektrokimyasal gradyan²⁴ için kümeleme gösterildi merkezli Cyclotella meneghiniana, Anten kompleksleri araştırıldı. Böylece, lipozomlar diatom antenler ve etkileşim ve neredeyse doğal koşullar Yönetmelikte eğitim için mükemmel bir araç vardır. Lipozomlar lipid bileşimi, lipozom boyutu, protein yoğunluğu gibi birçok koşulları beri çok yönlü ve çevresindeki sulu faz kontrol edilebilir. Ayrıca, yöntem örnekleri düşük miktarda gerektirir. Deneysel sistem sağlam ve son derece tekrarlanabilir. PH eğitimi için lipozomlar compartmentalization sağlar ve önemli iyon degradeler faktörler Anten kompleksleri Yönetmelikte.

Burada, FCP Anten kompleksleri C. meneghiniana üzerinden yalıtım ve onların birleşme lipozomlar doğal thylakoid lipid bileşimi ile açıklanmaktadır. Ayrıca, çözündürüldükten FCP spektroskopik karakterizasyonu için örnek veri sağlamak ve onları lipozomlar FCP ile karşılaştırın. Yöntem bilgi ve Gundermann ve Büchel 2012²³, Natali vd. 2016²²ve Ahmed ve Dietzel 2017²⁴ilerleme--dan elde edilen standart iletişim kuralları özetler.

Şekil 1: iş akışı şematik gösterimi. (1) başvuran hücre büyüme, bozulma ve FCP ayrılık sükroz yoğunluk gradyanlar üzerinde; aşağıdaki thylakoid yalıtım tanımlayan paragraf 1 C. m. -Cyclotella meneghiniana hücreleri. (2) doğal thylakoid lipid karışımı (MGDG, DGDG ve SQDG) hazırlanması 2 ve lipid-deterjan micelles octylglycoside (OG) ile oluşturulması paragrafta açıklanan. Tanımlanmış lipid-micelle boyutu ekstrüzyon tarafından tanımlanmış gözenek çapı membranlar kullanılarak elde edilir. FCP ve lipid-micelles önceden tanımlanmış bir lipid birleştirilmiş: protein oranı ve OG ve β-DDM deterjanlar vardır FCP proteoliposomes oluşturan kontrollü kaldırılan yolu ile diyaliz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

Not: Fotosentetik kompleksleri FCPs gibi ışık ve ısı için son derece açıktır. Her zaman buz üzerinde ve bir çok loş ışık altında çalışır.

1. yalıtım FCP hücrelerden

1. Thylakoid yalıtım C. meneghiniana hücrelerden
   1. C. meneghiniana her ASP-orta^23,25 ve 50 milyon hücre ile 300 mL dolu beş 500 mL şişe içinde büyümek. Şişeler ile pamuk Tıpa tak ve hücreleri bir shaker 16 h ışık ile 120 rpm'de yaklaşık bir hafta için üstel büyüme aşaması ve 8 h 40 µmol photons/(m²s) beyaz ışık karanlık aşamasında ve 15-18 ° c arasında bir sıcaklık için büyümeye izin Cep numarasını 1.5-2 milyon hücre/mL bir hücre sayaç odası arasında olup olmadığını kontrol edin.
   2. 4000 x g yüksek hızlı santrifüj 15dk için bir precooled Open End-500 mL santrifüj tüpleri (4 ° C) ile de hücreleri santrifüj kapasitesi. Hücre topakları homojenizasyon arabellek (HB, Tablo 1) 12 ml pipetting tarafından yeniden askıya alma.
      1. Süspansiyon tek 50 mL plastik tüp aktarın. -80 ° C'de örnekleri depolamak veya 1.1.3 adıma geçin.
   3. Boncuk fabrikası ve donanımları önceden serin. Boncuk Değirmen %75 50 mL kabı bir cam boncuk karışımı ile doldurun ve hücre süspansiyon ekleyin. Hücre bozulması için 30 ile tam hızda 7 x 45 s darbeleri kullanın her darbe arasında soğutma s. 20 µL kalite kontrolleri için kesintiye hücre içinde 1.1.6 adım.
   4. Kesintiye hücreleri bir cam filtre huni ve yıkama üzerinde net göründükleri kadar HB cam boncuklar dökerek filtre. Havuzu yıkama kesir ile filtrate. Son ses 150 mL daha düşük tutun.
   5. Örnek üç 50 mL Plastik tüpler hücre artıkları cips kullanarak 140 x g de 15 dakika santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant 20 mL Polikarbonat ultrasantrifüj şişeleri için transfer ve Pelet.
      1. Şişeleri HB ile doldurmak, ağırlık equilibrate ve 300.000 x g ve thylakoid membran cips 4 ° C, 1 h için uygun bir Open End santrifüj kapasitesi.
   6. Santrifüjü tam zamanı 1.1.3 içinde alınan 20 µL örnek ile 400 X büyütme, mikroskobu tarafından kesintiye hücre oranı kontrol etmek için kullanın. Kloroplast ücretsiz ve frustules (silis kabukları) içeren kloroplast arasındaki oran hesaplamak.
      Not: Diatom hücre duvarları çok madde içinde mikroskop diffracting olarak görünür silis yapılır. Hücre bozulma işe yaradıysa kadar yeşil noktalar meydana gelen kloroplast hücrelerden serbest bırakılmış olması gereken.
   7. İle membran Pelet mümkün olduğunca küçük çamaşır tampon olarak yeniden askıya alma (0.5-1 mL) küçük bir ressamın fırça kullanarak. Arabellek (Tablo 1) yıkama ile Polikarbonat ultrasantrifüj şişeleri doldurun, onların ağırlık ve 200.000 x g ve 4 ° c, 20 dk santrifüj equilibrate
      1. Bir ressamın fırça ile yıkanmış membranlar yeniden askıya alma. Çamaşır arabellek yalnızca mümkün olduğu kadar yüksek thylakoid konsantrasyonu tutmak için gerekirse ekleyin. Tüm thylakoids bir örnek flakon (15 mL) havuz.
   8. Örnek 10 µL % 100 aseton 90 µL ile kullanarak örnekleri önceden oranında seyreltin. 12.000 x g zarlarını protein cips 5 min için de santrifüj kapasitesi. Predilution 10 µL alıp % 90 aseton 990 µL ile karıştırın.
      1. Klorofil a ve c 664 absorbans (ABS) ölçmek nm ve 630 nm % 90 aseton içinde. Her iki değer üzerinden ABS_750nm çıkarma. Aşağıdaki formülü kullanarak toplam klorofil içeriği belirlemek:²⁴
         1)
         2)
   9. Toplam klorofil 1,5 mL tepki tüpler 0.5 mg bazı bölümlerinde aliquot thylakoids onları sıvı azot içinde dondurma ve-80 ° C'de kadar daha fazla kullanılmasını depolayabilirsiniz.
2. Ayrılık ve FCP kompleksleri ile konsantrasyonu
   1. Sükroz degrade çözüm hazırlamak ve ultracentrifuge tüpler yükleme birimi (300-500 µL) eksi üst kadar doldurun. Onlar tamamen donmuş kadar tüpler-20 ° C'de dondurmak. 4 ° C'de 3-4 h 17 mL tüp için alır, çözülme tüpler izin.
      1. İki kez daha iyi çözünürlük için degrade iyileştirmek için donma-çözülme döngüsünü tekrarlayın.
   2. Klorofil 0.5 mg için karşılık gelen 1.1.9 elde örnekleri kullanır ve arabellek B1 ile ayarlamak (Tablo 1) son hacmiyle 2 mL. Solubilization için n-Lauryl-β-D-maltopyranoside (b-DDM) 20 mM son bir konsantrasyon için ekleyin.
      1. Tüp 3 kez ters çevir ve buz yumuşak köpük önlemek için sallayarak ile 20 dakika yerleştirin. Önceden soğutulmuş Masa Üstü Santrifüj 4 ° C'de 12.000 x g de 5 dk santrifüj
   3. Süpernatant degradeyi tarih yüklemek. 17 mL şişe kullanılan degrade başına toplam klorofil 125'ten fazla µg yük değil. Santrifüj için 100.000 x g ve 4 ° c, 22 h
      1. İstenen kahverengi FCP kesirler (Şekil 2A) kullanarak degrade yeniden elde etmek. 5 µL aliquot al ve B1a 995 µL ile sulandırmak.
   4. Bir UV-VIS-spektrofotometre 370-750 nm arasında absorbans (ABS) spektrum ölçmek. Yarı mikro optik cam cuvettes kullanın.
      1. Spectra Yöneticisi yazılımını açın, spektrum moduna gidin ve bir satır taban çizgisinden 370 750 için kayıt nm örnek ölçümleri tarafından takip. Kullanma ertesi gün koyma: tarama hızı, 200 nm/dak; veri aralığı, 0.5 nm; Yanıt, orta.
   5. Bir micropipette ile kurtarılan örnek hacmi ölçmek. FCP kompleksleri B1 arabelleği (Tablo 1) ile iki kez kurtarılan birim ekleyerek yıkayın. Membran yoğunlaştırıcı 30 kDa 1000 x g ve 4 ° C en az 20 ABS_672nm için kesme ile konsantre.
      Not: B-demir konsantrasyonu micelle zenginleştirme örnek yerde nedeniyle artış olabilir. Bu FCP kompleksleri daha fazla solubilization için neden olabilir! Aşırı solubilization deterjan boş arabellek adımları daha fazla yıkama Eğer B1 kalan sükroz kaldırmak için gerekli ekleyerek kaçının.
   6. 20 µL denetimleri için aliquot al. Şok örnekleri sıvı azot donma ve onları-80 ° C'de depolayın

Şekil 2: arıtma FCP, spektroskopik denetimleri ve saflık onay. (A) tipik görünümünü sükroz yoğunluğu degrade sonra gece Santrifüjü. FCPa ve FCPb. pigm. oluşan FCP havuz bütün kahverengi grupları içeren - ilişkisiz pigmentler, PS - FCP photosystems (B) absorbans spectra (mavi çizgi) önce ve sonra santrifüj filtre aygıtından 30 kDa kesme (turuncu kesik çizgi) konsantrasyonu . Özellikle, karotenoidler kaybı için 500-550 nm arasındaki bölgede alt absorbans sonuçlanır FCP üzerinden yatkındır. Grafikler klorofil Q_y ~ 670 maksimum için normalleştirilmiş nm. (C) klorofil a emisyon spectra chl c uyarma ile (465 nm) fonksiyonel uyarma enerji transferi test etmek için. Enerji için chl chl c aktarırsanız bir engel oluyor, ~ 640 bir ek floresans band nm (chl c) oluşur. Grafikler maksimum emisyon için normalleştirilmiş. (D) uyarma spectra kaydedilen 675 nm (chl bir floresan maksimum) enerji transferi chl için test etmek için bir bütün pigmentler 370 arasında emici üzerinden nm ve 600 nm. Enerji için chl aktarırsanız bir daha az verimlidir, floresans verim özellikle 465 ve 550 nm arasında azaltmak. Grafikleri en fazla yaklaşık 440 normalleştirilmiş nm. Spectra (b), (C) ve (D) konsantrasyonu iyi çalıştı Eğer neredeyse aynıdır. (E) Tris-tricine jel²⁸kullanarak izole FCP saflık için kontrol edin. FCPa ve FCPb alt birimleri arasında 18-19 kDa var. Tüm görünür gümüş lekeli 20 kDa büyük kirletici maddeleri proteinlerdir. Thyl. -Thylakoids Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. Spektroskopik ve jel tabanlı denetimler
   1. Kayıt absorbans FCP 5 µL B1a 995 µL adım 1.2.5 sonra içinde 370-750 nm arasında. 1.2.4. adımda elde spektrum ile karşılaştırın. Aynı araçları ve 1.2.4. adımda açıklandığı gibi ayarlarını kullanır.
      1. Veri *.csv verebilir ve bir elektronik tabloya veri alabilirsiniz. Her iki spectra chl maksimum normalize bir civarında 672 Q_y bandında Şekil 2Btasvir nm.
   2. 1.2.4 ve 1.3.1. adımdaki örnek seyreltme faktörü 0.03 istenen ABS_672nm tarafından ölçülen ABS_672nm bölerek hesaplayın. Buna göre örnekleri seyreltik B1a ile ve özel cam floresans cuvettes için aktarabilirsiniz.
   3. CHL sağlam ışık enerjisi transfer chl c chl bir (Şekil 2C) ortaya çıkarmak için bir spectrofluorometer ile floresan emisyon spektrum kaydedin.
      1. Spektrometre yazılımı kullanabilir ve spektrum ölçüm modu aşağıdaki ayarlarla gidin: modu, emisyon; yarık genişliği uyarma ve emisyon, 3 nm; duyarlılık, orta; tarama hızı, 100 nm/dak; veri aralığı, 0.5 nm; uyarma dalga boyu, 465 nm; emisyon, 600-800 nm. Autozero ve ölçü gerçekleştirmek.
   4. Uyarma spectra aynı örnek ve bozulmamış enerji transferi tüm pigmentler chl ortaya çıkarmak için donatım (Şekil 2B) kaydedin. Değiştirmek için ayarları: modu, uyarma; emisyon dalga boyu, 675 nm; uyarma, 370-600 nm. Spectra kaydedin.
      1. Lamba- cfspektral özellikleri için aynı aralıkta rodamine spektrum ile düzeltin. Kullanıcı el kitabındaki yönergeleri.
   5. Mix FCP örnekleri chl 1 µg için karşılık gelen bir 10 µL SDS-yükleme arabelleği ile. 25 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya Santrifüj 12000 x g masa üstü santrifüj içinde de 5 min için.
      1. Tris-tricine jel²⁸süpernatant yükleyin. Bu 150 V 2 h için ayrı ve gümüş-bu ayrılık⁴⁰sonra leke.
         Not: İki önemli protein grup arasında FCPa ve FCPb²⁹ (2E rakam) bileşenlerinin çoğu 18-19 kDa FCP alt birimleri ayrı.

2. lipozomlar ve FCP ortaklığın hazırlanması

1. Lipid karışımı ve lipid deterjan micelles hazırlanması
   Not: lipidler oksidatif koşulları ile kombine sıcaklık sıcak duyarlı. Lipidler soğutulmuş ve bir N₂ atmosfer altında tutmaya çalışın.
   1. İstenen thylakoid lipid oranları C. meneghiniana için Vieler ve ark. 2007³⁰göre hesaplar. Supplemental Tablo 1' de verilen örnek bakın. Lipid bir çözelti geçirmez Konteyner üreticisi tarafından önerilen hisse senedi çözümleri hazırlayın.
   2. Lipidler 2 mL tepki tüp içinde istenilen miktarda pipette ve nazik azot akışı kullanarak kloroform buharlaşır ve lipidler tüp tabanının bütün alana yayılmış çalışın. Tüm çözücü buharlaşan kadar N₂ akışı sağlar.
   3. N-Oktil β-D-glucopyranoside çözüm (OG) 29 µL lipid karışımı 4 h Incubate lipid karışımı 30 ° C'de 10 dakika için 4 ° C'de solubilize 3 x 3 dk 30 tarafından kesintiye 25 ° C'de bir sonicator banyoda lipidler kuluçkaya s buz üzerinde.
      1. Tricine arabellek 221 µL ve 4 x diyaliz arabelleği 250 µL ekleyin.
   4. Bir ekstruder 0,1 µm Polikarbonat Membranlar ile 50-70 nm tanımlanmış lipozom çapı için kullanın. Ekstruder membran ve filtre desteği ile bir araya getirin. Hava kabarcıklarını önlemek ve derleme iyice sıkın.
   5. 4 x diyaliz arabellek ile bir şırıngaya doldur ve hava kabarcığı yok ikinci şırıngada görülebilir kadar ekstruder önceden ıslak.
   6. Lipid-deterjan-micelles için Ekstruder uygulamak ve diğer bir şırınga çözümden ileri tuşuna basın ve geri. Çözüm homojen görünene kadar bu 5 kez tekrarlayın.
      Not: Bu çözüm 4 ° C'de birkaç gün boyunca saklanır. Dondurma değil!
2. FCP kompleksleri ve deterjanlar ve toplamları kaldırma
   Not: Biz bir lipid/chl 12:1 oranında kullanın örneğin, hangi yaklaşık 100: 1 bir lipid/protein oranına karşılık gelir.
   1. FCP chl 20 µg için eşit eklemek bir toplam hacmi 500 µL 250 μhaddelenmiş lipid micelles L B1a arabelleğe ve diyaliz arabellek x 4 250 µL içinde. Örnekleri 1500-3000 devirde buz üzerinde 30 s duraklamadan kesintiye thermomixer 25 ° C'de 3 x 3 dk için kuluçkaya.
   2. Dört 1,5 mL tepki tüp altında hala kapağını uygun bir yüzüğü vermek üst kapağını kesmek. Diyaliz membran 1.5 cm x 1,5 cm adet hazırlamak ve 20 mL 1 x diyaliz arabellek yıkayın
   3. Her kapak için örnek 250 µL doldurun. Dikkatle, membran kapak üzerinde yuvası ile örnek tamamen dolu ve hiçbir hava kabarcıkları oluşur düzenleyin. Derleme tepki tüp halka kapalı bir bölme için sıkın.
   4. Gecede 1 diyaliz arabellek x 50 mL (12-16 h) örneklerinde bir yuvarlanan shaker buz üzerinde diyaliz. Kullanılan diyaliz tampon yerine taze bir ve kalan deterjanlar için en az 6 h kaldırmak için adsorbent boncuk 7 mg ekleyin.
   5. Diyaliz arabellek tekrar eski yerine koymak ve diyaliz membran ile 200 µL micropipette bahşiş piercing tarafından lipozomlar başka bir 12 h. kurtarmak için diyaliz ve tepki tüp kapak üzerinden tüm lipozomlar Aspire edin.
   6. İsteğe bağlı adım: Eğer yüksek saflıkta (> % 95) gereklidir. Kesintili yoğunluğu Gradyanda 17 mL % 6, % 10, % 15 ve % 20 sükroz epichlorhydrin kopolimer diyaliz arabelleği içeren adımlarla ultrasantrifüj tüpleri hazırlayın. Lipozomlar üstte ve ultracentrifuge 100.000 x g sallanan bir kova Open End 4 h için de yük.
      1. Üst kahverengi bant şırıngayla kurtarmak, DP ile örnek 1:5 oranında seyreltin ve sonraki adıma geçin.
   7. En az 2 ml 1 x 100.000 x g ve 4 ° c, 1,5 saat için diyaliz arabellek FCP lipozomlar santrifüj kapasitesi Lipozomlar santrifüj tüpü bir 45 ° açıyla çevirerek kurtarmak. Lipozomlar 1 dk (Şekil 3A) aşağı taşımak izin verir.
   8. Çökelti rahatsız edici son hacmi 25-50 µL. FCP lipozomlar önlemek yeniden elde etmek.
3. Kontroller 1: absorbans, floresans spektroskopisi
   1. 3 µL aliquot FCP lipozomlar, 1 x diyaliz arabellek ve santrifüj 12.000 x g de 5 min için 1 mL son hacmi ekleyin.
      1. FCP-lipozomlar aynı ekipman ile 370 ve 750 nm arasında absorbans 1.2.4 içinde açıklandığı gibi kaydedin. Spektrum chl (670-680 nm) S_y bölgesinde maksimum normalleştirmek ve çözündürüldükten FCP (Şekil 3 c) normalleştirilmiş spektrum karşılaştırın.
   2. DP 1 ml bir absorbans (ABS) ile FCP lipozomlar hazırlamak 0,03 ile ilgili 670-680 nm arasında maksimum =. 1.2.6. adımdaki deterjan ile B1a sulandrarak aynı ABS için solubilized FCP ayarlayın.
   3. Her iki örnek absorbans spectra 1.2.4 içinde açıklandığı gibi kaydedin. CHL 1.3.3 içinde açıklandığı gibi her iki örnekleri bir floresan emisyon spektrum kaydedin.
      Not: Floresans verim FCP lipozom örnek (şekil 3D ve bkz tartışma.) azalır

Şekil 3: FCP proteoliposomes yalıtım ardından spektroskopik denetimleri ve confocal görüntüleme ekleyin. (A) FCP lipozomlar Santrifüjü sonra kurtarılması. 45 ° aralıklarla tüp açın ve hangi tüp duvara lipozomlar sopa içine dahil değil FCP toplar ise yaklaşık 1 dak - lipozomlar hareket edecek bekleyin. Absorbans spectra çözündürüldükten FCP içinde deterjan (mavi) ve FCP lipozomlar (turuncu) içinde karşılaştırılması (B) (C) (B) olduğu gibi aynı spectra chl için kırmızı bölgede maksimum normalize (~ 670 nm - Qy tepe); çözündürüldükten FCP içinde deterjan (mavi) ve FCP lipozomlar (turuncu) içinde. Büyük olasılıkla, olabilir bir pigment kaybı özellikle karotenoidler görünür 500-550 nm bölgede. FCP lipozomlar içinde kümeleme bir tepe genişletmektedir ve chl hafif bir kayma için maksimum açabilir (~ 670 nm) kırmızı. (D) emisyon spectra çözündürüldükten FCP içinde deterjan ve FCP lipozom içinde. Lipozom FCP, kümeleme floresans verim (turuncu eğri) düşürür ve emisyon maxima biraz kırmızı vardiya FCP kompleksleri enerjik etkileşimlerin geliştirir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonuçlar

Protokol Cyclotella meneghiniana üzerinden toplam FCP kesir yalıtım ve birleşme lipozomlar yerli lipid bileşimi ile içine açıklar. Thylakoid yalıtım son derece tekrarlanabilir olmakla beraber thylakoid verim değişebilir. Tüm pigmentler % 50'den fazla adım 1.1.4 kazanılmaktadır kabul edilebilir bir sonucudur. % 80'den fazla en uygunudur.

Thylakoids solubilization kritik bir adımdır. Sonra adım 1.2.2 s?...

Tartışmalar

FCP lipozomlar doğal lipid bileşimi ile spektroskopik özellikleri araştırmak için kullanışlı, basit ve tekrarlanabilir bir araç sağlamak tüp bebek. FCP lipozomlar lipid ortamında doğal koşullarına yakın olan deneysel sonuçlar için sebebiyet veren thylakoid membran içinde durum benzer.

C. meneghiniana bir modeli sistem olarak FCP anten için kullanmanın bir çok avantajı vardır. Bu nispeten hızlı büyür ve diğer diatom modeli türler ile karşılaşt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge	Heraeus
Bead Mill VI 2	Edmund-Bühler (edmund-buehler.de)		newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm	Sigmund-Lindner.com	5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm	Sigmund-Lindner.com	4504
VitraPOR filter funnel - por1	ROBU GmbH	21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE	Sorvall	n.a.
rotor T 865	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved)	Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)	T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7)	Optik-Pro (optik-pro.de)	51428
optical glass cuvettes (6040-OG)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	"6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)	Jasco (jasco.de)	V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	344061
rotor AH629-17-mL	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff	Millipore (merckmillipore.com)	4307
Biometra Minigel-Twin	Analytik Jena AG (analytik-jena.de)	846-010-100
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad (bio-rad.com)	1610449
libre office spread sheet	The document foundation	https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)	Jasco (jasco.de)	FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load	ROTH (carlroth.com)	K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1300	make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1310	make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1230	make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)	Larodan AB (larodan.com)	37-0150	make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	P3782 SIGMA	make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH	Sonicor (getmedonline.com	SONICOR-S-50TH
mini-Extruder	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610000
Nuleopore polycarbonate membrane	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff	ROTH (carlroth.com)	0653.1	boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent	Biorad (Bio-rad.com)	152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	252150
rotor TFT 80.4	Millipore (merckmillipore.com)	54356
material listed in order of appearance			For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. Standard lab material and substances are not listed.