JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, biz meme kanseri hücrelerinin basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine implant için bir protokol mevcut ve bu fare orthotopic meme kanseri model uygun meme yağ yastığı yapısına sahip çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir kanser.

Özet

Uygun bir hayvan modeli daha iyi hastalıkları anlamak için önemlidir. Hayvan farklı Yöntemler (subkutan enjeksiyon, xenografts, genetik manipülasyon, kimyasal reaktifler indüksiyon, vb) tarafından kurulan modelleri çeşitli patolojik karakterler var ve bazı yönlerini araştırıyor içinde önemli rol oynarlar hastalıklar. Her ne kadar tek modeli tamamen bütün insan hastalık ilerleme taklit edebilen, orthotopic organları hastalık modelleri ile uygun bir stromal ortam hastalıkları anlama ve potansiyel uyuşturucu için eleme yeri doldurulamaz bir rol oynamaktadır. Bu makalede, basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine meme kanseri hücrelerinin implant ve uzak organlara metastaz izleyin nasıl açıklar. Birincil tümör büyüme, meme ve meme patolojik değişiklikler uygun özellikleri ve yüksek bir diğer organlara metastaz oluşumunu ile bu model maximumly insan meme kanseri ilerleme taklit eder. Birincil tümör büyüme in situ, uzun-uzak metastaz ve tümör microenvironment meme kanserinin bu modelini kullanarak araştırdı.

Giriş

Meme kanseri kadın ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir. Onun giderek artan insidansı ile meme kanseri halk sağlığı1için ciddi bir sorun haline gelmiştir. Fare kanser modelleri preklinik ve klinik çalışmalar arasında iyi köprüler, ve iyi taklit fare hastalık manken hastalığı ve Tıp araştırma doğruluğunu artırmak.

Metastaz ve komplikasyonlar ana nedenleri ölüm ve zavallı yaşam nitelikleri çoğu kanser hastalarında ise birincil tümör büyüme malign hastalığı ilerlemesini başlatır. Birkaç fare modelleri patoloji insan meme kanseri2,3,4taklit etmek için kullanılır. Xenograft modelleri güvenliği ve etkinliği5,6,7için patolojik karakterleri anlamak kanser çalışma ve ekran uyuşturucu için yaygın olarak kullanılır. Genetik fareler (GEM) belirli oncogenes veya tümör baskılayıcı genler8hedefleyerek insan meme kanseri taklit etmek için oluşturulur. GEM kanserli devam eden genlerin rolünü anlamak için oldukça basit ve üniformalı bir arka plan var; Ancak, yapay çevre ve arka plan metastaz patoloji araştırmak için sınırlıdır ve ilgili tedaviler9. İnsan kanser hücrelerinin, insan patolojik özellikleri olsa da, sadece bağışıklık eksikliği farelerde implante olması ve tümör-host bağışıklık etkileşim yetmezligi önyargılı sonuçları10' a yol açabilir.

Nerede solid tümör başlatır hastalığı11,12,13biyolojik ve patolojik karakteri doğrudan bir etkisi vardır. Kanserli ilerleme tümör hücreleri, stromal hücreler, immünoloji hücreleri, inflamatuar hücreler, büyüme faktörleri ve proteaz arasındaki etkileşimler karmaşık sonucu olduğundan, birincil tümörleri implante in situ daha iyi hakkında bilgi sağlayan ve taklit kanserli işlem kimyasal maddeler veya subkutan enjeksiyon tümör tarafından indüklenen tümörler daha doğru bir şekilde hücreleri. Kimyasal ajanlar tümör ikna etmek için kullanılan araştırmacılar ve çevre için zararlı olabilir ve hatta bazı ülkelerde yasaklanmıştır. Gerçek meme kanseri hastalarda, kanser kaynaklanan ve meme yağ yastığı rahatsız bir meme yağ yastığı ortamı olmaması nedeniyle, ile Subkutan Enjeksiyon patolojik ilerlemesini farklı olabilir. Subkutan Enjeksiyon dezavantajları tümör büyüme çalışmaya orthotopic modelleri kullanımını teşvik etmek. Daha önceki araştırmalarda, yedi orthotopic nakillerine sonra geliştirilen son derece metastatik MDA-MB-231 tümörler enjeksiyon yeri14önemini belirtti. Son zamanlarda, meme kanseri hücrelerinin orthotopic implantasyonu ameliyatı ile meme yağ yastığı içine bildirilen15,16yaşındaydım. Meme pad çevre, tümör büyüme ve uzak organlara kapak tüm süreci içine geçiş patolojik olarak ilgili sitelerdeki meme kanserinin, hangi bu insan hastalıkları ilerlemenin bir minyatür modeli yapar. Ancak, ameliyattan sonra cilt otomatik olarak normal meme kanseri köken ile müdahale potansiyel riskini getirmek ve sonuçları önyargı kendini iyileştirmeye çalışır.

Biz bazı meme kanser modelleri karşılaştırıldığında ve minimal invaziv orthotopic manken meme kanseri ilerleme17,18potansiyel etkisi ilaç araştırmak için kuruldu. Bu çalışmada orthotopically için nasıl bir video iletişim kuralı basit meme yağ yastığı içine meme kanseri hücreleri enjekte, daha az invazif şekilde sunulmuştur. Orthotopic ekleme Buyöntem ameliyat olmadan birçok yönden avantajlı olduğunu. İlk olarak, işlemi basit ve hızlı, fare başına yaklaşık 1 dakika eder. İkincisi, şu patolojik sitelerinde başlayan birincil tümör foci ile meme kanseri ilerleme tümör büyüme eğitimi için iyi bir deneysel hayvan modeli sağlar diğer organlara metastaz bütün tumorigenic sürecini kapsar tümör hücreleri ve tümör microenvironment etkileşim. Ayrıca, tedavisinin etkileri meme kanseri her aşamasında tahmin etmek için değerli bir model olabilir. Bu yöntem maximumly kopyalama insan meme kanseri ilerleme için Hayvansal bir modeli sağlamak için hedeftir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deneyleri hüküm ve genel öneri Çin deneysel hayvan yönetim mevzuatı uyarınca gerçekleştirilmiştir ve kurum hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi sermaye Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (Ref yok. AEEI-2014-052). 6-8 hafta yaşlı kadın Balb/c fareler kullanıldı.

1. hücre ve hayvanlar hazırlanması

  1. Bir gün işleminden önce çalışma alanı ortaya çıkarmak için dördüncü meme etrafında saç tıraş.
    1. Bir yandan fare fare değil serbestçe hareket, karnı operatöre ortaya çıkarmak için fareyi yukarı dönecek ve sonra başka bir el dördüncü meme çevresinde kürk ile elektronik bir tıraş tıraş kullanmak emin olmak için arkadaki sıkıca tutmak için kullanın.
    2. 30-60 s için meme çevresinde epilasyon ince bir tabaka krem koymak uzağa krema distile su ile temiz ve fare yumuşak kağıt ile kuru.
  2. İşlem gününde, fare meme kanseri hücreleri (4T1-luc2) toplamak, hücre sayısı ve hücre yoğunluğu 2 x 105 hücre/ml olarak fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) steril microcentrifuge tüplerde ayarlamak ve buz üzerinde tutun. Her fare için 1 x 104 hücreleri/50 µL 1 mL şırınga içinde hazırlanır.

2. Orthotopic enjeksiyon

  1. Farelerin anestezi
    1. Anestezi neden. Fareler bir kapalı şeffaf kap içinde koymak ve % 2 isoflurane gaz hepsi yalan kadar fareler için yaklaşık 5 dakika, anestezi ve sonbahar uykuda açın.
    2. Anestezi korumak. Fareler için bireysel anestezi maskeleri kapsayıcıdan transfer kuruluğu önlemek için fare supinely için operatör maruz kendi meme tutmak onların gözleri üzerinde bazı veteriner merhem koymak ve birkaç dakika kadar isoflurane gaz nefes devam etsinler Enjeksiyon yapıldı.
    3. Anestezi başarısı bir ayak çimdik çekilme refleks eksikliğinden onaylayın.
    4. Oftalmik merhem göz kuruluğu önlemek için fareler gözler için geçerlidir.
      Not: Göre konteyner boyutunu ve bireysel anestezi maskeleri kullanılabilir sayısını, fareler bir grup birlikte anestezi ve tek tek tek tek anestezi altında enjekte.
  2. Performans enjeksiyon
    1. Bir yandan cilt çadır dördüncü meme cımbız ile takip etmek için şırınga fırlayan bir "tünel" ayarlamak için kullanın. Öte yandan yukarı 5-10 mm subkutan deri meme girmek için açık iğne ile şırınga tutmak için kullanın; o zaman, iğne ucu meme ucu yakın gelir kadar "tünel" izleyin, dikkatle iğne ucu meme yağ yastığı iğne göz altında meme ucu, cımbız atmak ve hücrelerin yavaş yavaş enjekte gelene hareket.
    2. İğne biraz açmak ve şırıngayı yavaşça geri çekmek; hiçbir sıvı sızıntı olduğundan emin olmak 10-20 s için yara iğne basmayı bir pamuklu çubukla kullanın.
    3. Başarılı bir enjeksiyon onaylamak için dördüncü meme gözlemlemek: bir beyaz şeffaf düz küre merkezi olarak meme başı ile (Şekil 1) görülebilir.
  3. Bir dakika daha yeniden elde etmek ve çok hızlı bir şekilde hangi açmak için yara enjeksiyon neden olur hareket fare izin kaçının anestezi fareler ve sızmaya tümör hücreleri tutun.

3. tümör büyüme ve metastaz Analizi

Not: Birincil tümörleri enjeksiyonları sonra saydam veya blister benzeri diken diken ve küresel veya elips katı topaklar meme ucu ile bir kaç gün sonra tanımlanır. Tümör büyüme tümör hacmi ve tümör bioluminescence tarafından değerlendirilir.

  1. Tümör birim kurmak için fareyi tek elinle tutun. Karnı operatöre açığa ve öte yandan tümör uzunluğu (M) ve Genişlik (W) kumpas için kullanın. Tümör hacmi (V) aşağıdaki gibi hesaplar.
    V = (L x W2)/ 2
  2. Tümör bioluminescence yakalamak için 150 mg/kg D-biyoluminesans fare boyun, 10 dk önce görüntüleme arkasına enjekte. Fare ile % 2 isoflurane gaz 5 min için anestezi ve bireysel anestezi maskeleri isoflurane gaz 5 dk daha uzun nefes izin vermek için aktarabilirsiniz. Üreticinin yönergeleri izleyerek bioluminescence birincil tümör ve metastaz, otomatik pozlama süresi, orta binning ve durdurmak f/1'de çekim.

4. analiz için birincil tümör ve metastaz organları hasat

Not: Bu deneme, ya da insana ilişkin bitiş noktası ulaşan amacı ulaşmak zaman birincil tümör ileri çalışmalar için hasat edilebilir. Tümör hacmi yaklaşık 800 mm3ulaştığında bu çalışmada, 4-5 hafta sonra enjeksiyon tümörleri kaldırılır. Akciğerleri hafta 8 kaldırılır.

  1. Birincil tümör hasat
    1. Steril bir ortam sağlamak için steril bir mahallede ameliyatı. Hayvanlar tarafından isoflurane anestezi. Anestezi başarısı ayak çimdik çekilme refleksleri eksikliğinden onaylayın. Oftalmik merhem gözleri farelerin kurumasını engellemek için uygulanır.
    2. Ameliyat sonrası ağrı gidermek için makas, dropwise ağrı kesici (1 mg/mL tramadol, 1 damla fare başına yaklaşık 50 µL) ile cilt tümöründen ayırmak.
    3. Cilt ile cerrahi dikiş dikiş, fazla dikiş kesip, belgili tanımlık kesme asmak.
    4. Yarısında bir neşter ile birincil tümör kesmek, 1/2 tümör % 4 paraformaldehyde daha fazla hematoksilen eozin (H & E) boyama ve immünhistokimya içine koymak ve hemen diğer 1/2 Batı kurutma için sıvı azot veya bir RNA ile dondurma yalıtım çalışma daha sonra.
    5. Sonra dikiş, fareler kadar onlar kurtarmak, bir lamba ile sıcak fareler kadar tamamen iyileşti tek kafeslerde tutmak. Sürekli bir oral gavaj 3 d ile 10 mg/kg tramadol ameliyattan sonra yönetmek.
  2. Metastaz organlarının hasat
    1. Aşırı dozda Fentobarbital ile fareler ötenazi, göğüslerine makasla açın, yavaşça ciğerlerini alır ve PBS ile yıkayın. Beyaz şeffaf görünümlü farklı ve ayırt normal pembe akciğer dokusundan neden olan çarpma gibi akciğer metastazı foci tespit edilebilir.
    2. Akciğerler metastaz H & E boyama doğrulamak için %4 paraformaldehyde içine koymak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sonra başarılı bir enjeksiyon, bir beyaz şeffaf düz küre meme başı ile dışarı yuvarlak yüzey Merkezi (Şekil 1) görülebilir. Birincil tümör büyüme tümör hacmi ve yaşam tümör tarafından ölçülebilir bioluminescence (Şekil 2) hücre. Tümör hacmi ve toplam akı deneme önce rezeksiyon sırasında arttı. Erken bir aşamada metastaz güçlü kollarındaki sinyaller birincil tümör küçük metastaz foci ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada kullanılan hücre 4T1-luc2, onların son derece invaziv doğa2,19 nedeniyle ilaçların antitümör ve antimetastatic etkileri yatırım için yararlı bir araç olan luciferase etiketleme ile fare üç kez negatif meme kanseri hücreleri vardır . Luciferases, hücre nesil için kararlı yaşam tümör göstermek için kullanılır hücreleri, her iki meme bezi ve diğer uzak organlara20. Bazı durumlarda, hipoksi ve koll...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (grant No 81873111, 81673924, 81774039, 81503517), teşekkür etmek istiyorum Pekin doğal Bilim Vakfı (grant No 7172095, 7162084, 7162083) ve Pekin hastaneden Xu Xia temeli Geleneksel Çin tıbbı (Hayır, vermek xx201701). Prof. Dr. Chang-Zhen Liu, kollarındaki görüntüler için Çince Tıbbi Bilimler Akademisi deneysel araştırma merkezi, Çin teşekkür ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
anesthesia machineMidmark Corporation, Dayton, OH, USAMatrx VMSanesthesia
In-Vivo Imaging SystemPerkinElmerIVIS Spectrumused for bioluminescence detecion
 isofluraneHebei yipin chemical reagents  companyO21400anesthesia
1 ml syringeBecton,Dickinson and  CompanyA257cell injection
digital caliperShang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd.S-Hvolume measurement
tramadolMundipharma company-pain killer
D-luciferinGold Biotechnology Inc.LUCK-1Gused for bioluminescence detecion
The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31Abcam ab28364used for MVD detection
hematoxylin and eosin staining kit Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9615histology 
hair removal creamVeet-hair removal cream
Carbomer Eye GelDr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH-ophthalmic ointment
sewing needleShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. 17U0302Jsuture

Referanslar

  1. Torre, L. A., et al. Global cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 65 (2), 87-108 (2012).
  2. Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
  3. Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling. Breast Cancer Research. 6 (1), 31-38 (2004).
  4. Horas, K., Zheng, Y., Zhou, H., Seibel, M. J. Animal models for breast cancer metastasis to bone: opportunities and limitations. Cancer Investigation. 33 (9), 459-468 (2015).
  5. Kawaguchi, T., Foster, B. A., Young, J., Takabe, K. Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).
  6. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804(2016).
  7. Cassidy, J. W., Batra, A. S., Greenwood, W., Bruna, A. Patient-derived tumour xenografts for breast cancer drug discovery. Endocrine-Related Cancer. 23 (12), T259-T270 (2016).
  8. Stiedl, P., Grabner, B., Zboray, K., Bogner, E., Casanova, E. Modeling cancer using genetically engineered mice. Methods in Molecular Biology. 1267, 3-18 (2015).
  9. Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
  10. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. The American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
  11. Spaw, M., Anant, S., Thomas, S. M. Stromal contributions to the carcinogenic process. Molecular Carcinogenesis. 56 (4), 1199-1213 (2017).
  12. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  14. Yano, S., et al. Tumor-targeting adenovirus OBP-401 inhibits primary and metastatic tumor growth of triple-negative breast cancer in orthotopic nude-mouse models. Oncotarget. 7 (51), 85273-85282 (2016).
  15. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).
  16. Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Lab Animal. 51 (1), 85-88 (2017).
  17. Zhang, Y., et al. Establishment of a murine breast tumor model by subcutaneous or orthotopic implantation. Oncology Letters. 15 (5), 6233-6240 (2018).
  18. Zhang, Y., et al. Gubenyiliu II Inhibits Breast Tumor Growth and Metastasis Associated with Decreased Heparanase Expression and Phosphorylation of ERK and AKT Pathways. Molecules. 22 (5), (2017).
  19. Kwon, Y. S., Lee, K. S., Chun, S. Y., Jang, T. J., Nam, K. S. Suppressive effects of a proton beam on tumor growth and lung metastasis through the inhibition of metastatic gene expression in 4T1 orthotopic breast cancer model. International Journal of Oncology. 49 (1), 336-342 (2016).
  20. Kalra, J., et al. Validating the use of a luciferase labeled breast cancer cell line, MDA435LCC6, as a means to monitor tumor progression and to assess the therapeutic activity of an established anticancer drug, docetaxel (Dt) alone or in combination with the ILK inhibitor, QLT0267. Cancer Biology & Therapy. 11 (9), 826-838 (2011).
  21. Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Investigational New Drugs. 17 (4), 343-359 (1999).
  22. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 143Orthotopic enjeksiyonmeme kanserimetastazt m r b y met m r microenvironmentmeme ya k t

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır