Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Resumo

Um modelo animal adequado é crucial para uma melhor compreensão de doenças. Animal modelos estabelecidos por métodos diferentes (injecções subcutâneas xenografts, manipulação genética, indução de reagentes químicos, etc.) tem vários personagens patológicas e desempenhar um papel importante na investigação de certos aspectos da doenças. Embora nenhum modelo único totalmente pode imitar a progressão da doença humana inteira, modelos de doença ortotópico órgãos com um ambiente adequado do estroma desempenham um papel insubstituível na compreensão de doenças e de rastreio de drogas potenciais. Neste artigo, descrevemos como implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, de maneira menos invasiva e fácil de manusear e siga a metástase para órgãos distantes. Com os recursos adequados de crescimento do tumor primário, da mama e alterações patológicas do mamilo e uma alta ocorrência de metástase de outros órgãos, este modelo màxima imita a progressão do câncer de mama humano. Tumor primário crescimento em situ, long-metástase à distância e o microambiente do tumor do câncer de mama podem ser investigada usando este modelo.

Introdução

Câncer de mama é a principal causa de mortalidade feminina em todo o mundo. Com sua incidência progressivamente crescente, câncer de mama tornou-se um sério desafio para a saúde pública¹. Modelos de câncer murino são boas pontes entre os estudos pré-clínicos e clínicos, e um modelo de bom imitar murino doença aumentará a precisão das pesquisas sobre a doença e a medicina.

O crescimento do tumor primário começa o progresso da doença maligna, enquanto metástase e as complicações são as principais causas de morte e qualidades de vida pobre, na maioria dos pacientes de câncer. Vários modelos de murino são usados para imitar a patologia do câncer de mama humano^2,3,4. Modelos de enxerto são amplamente utilizados para o estudo do câncer entender os personagens patológicos e às drogas da tela para a segurança e eficácia de^6,5,7. Ratos geneticamente modificados (GEM) são gerados para imitar o câncer de mama humano pela segmentação determinados oncogenes ou tumor supressor genes⁸. GEM tem um fundo relativamente simples e uniformizado para entender o papel dos genes em andamento canceroso; no entanto, o ambiente artificial e fundo limitam-se a investigar a patologia de metástase e relacionados a terapias⁹. Células cancerosas humanas, embora com características patológicas humanas, poderá apenas ser implantadas em camundongos deficientes em imune, e a insuficiência da interação imune tumor-hospedeiro pode conduzir a resultados tendenciosos¹⁰.

Onde inicia o tumor sólido tem uma influência direta sobre os caracteres biológicos e patológicos da doença^11,12,13. Desde que progresso canceroso é o complicado resultado das interações entre as células do tumor, células do estroma, células de Imunologia, células inflamatórias, fatores de crescimento e proteases, tumores primários implantados em situ fornecerá uma visão melhor e imitar o processo canceroso mais precisão do que tumores induzidos por agentes químicos ou uma injeção subcutânea de tumor de células. Agentes químicos utilizados para induzir tumores podem ser prejudiciais para os pesquisadores e o meio ambiente e até são proibidos em alguns países. Devido à ausência de um ambiente do tecido mamário, a evolução patológica de uma injeção subcutânea pode diferir com que em pacientes de câncer de mama real, cujo câncer se origina e irrita do pad gordo mamário. As desvantagens de injecções subcutâneas incentivam a utilização de modelos ortotópico para estudar o crescimento do tumor. Na pesquisa anterior, altamente metastáticos tumores MDA-MB-231, desenvolvidos após sete transplantes ortotópico, indicaram a importância da injeção local¹⁴. Recentemente, a implantação ortotópico de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária com cirurgia foi relatado^15,16. Com o ambiente de almofada mamária, o crescimento do tumor e a migração para o disfarce de órgãos distantes de todo o processo de câncer de mama em sites relevantes patologicamente, que torna este modelo uma miniatura do progresso de doenças humanas. No entanto, após a cirurgia, a pele automaticamente tentativas para curar a próprio, que pode trazer o risco potencial de interferir com a originação de câncer mamário normal e influenciar os resultados.

Nós temos comparado a alguns modelos de câncer de mama e estabeleceu um modelo ortotópico minimamente invasiva para investigar o potencial efeito das drogas sobre^1817,progressão do cancro da mama. Neste estudo, um protocolo de vídeo sobre como orthotopically injetar células de câncer de mama a almofada de gordura mamária de forma simples, da maneira menos invasiva é apresentada. Este método de injeção ortotópico sem cirurgia é vantajoso em muitos aspectos. Primeiro, a operação é simples e rápida, cerca de 1 minuto por rato. Em segundo lugar, com focos de tumor primário começando no sites bem patológicos, abrange o processo inteiro tumorigênico da progressão de câncer de mama do crescimento do tumor para outras metástases de órgãos, que fornece um bom modelo animal experimental para estudar a interação de células tumorais e o microambiente do tumor. Além disso, pode ser um modelo valioso para estimar os efeitos do tratamento em todas as fases do câncer de mama. O objetivo desse método é fornecer um modelo animal para a progressão de câncer de mama humano imitar màxima.

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Protocolo

Experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a disposição e recomendação geral de chinês Experimental Animal administração legislação e foram aprovados pelo Comitê de uso de Capital médica Universidade e instituição de cuidado Animal (Ref não. AEEI-2014-052). Foram utilizados camundongos Balb/c fêmeas com idade de 6 a 8 semanas.

1. preparação das células e animais

1. Um dia antes da operação, raspe os pelos ao redor dos mamilos quarto para expor a área de atuação.
   1. Utilize uma mão para segurar o mouse firmemente para trás para certificar-se de que o mouse não irá mover-se livremente, transformar-se o mouse para expor sua barriga ao operador e então usar a outra mão para raspar a pele ao redor dos mamilos quarta com uma máquina eletrônica.
   2. Coloque uma camada fina de depilação creme ao redor dos mamilos para 30-60 s, limpar o creme com água destilada e seque o mouse com papel macio.
2. No dia da operação, coletar células de câncer de mama murino (4T1-luc2), contar o número de células e ajustar a densidade da célula a 2 x 10⁵ células/mL de tampão fosfato salino (PBS) em tubos estéreis microcentrifuga e mantê-los no gelo. Para cada rato, 1 x 10⁴ células/50 µ l em uma seringa de 1 mL é preparada.

2. ortotópico injeção

1. Anestesia de ratos
   1. Induzi a anestesia. Colocar os ratos em um recipiente transparente fechado e vire na queda e 2% de isoflurano gás para anestesiar os ratos por cerca de 5 min, até que todos mentem para baixo dormindo.
   2. Manter a anestesia. Transferir os ratos do recipiente para máscaras individuais de anestesia, colocar alguma pomada de veterinário em seus olhos para evitar ressecamento, manter os ratos passivamente com os mamilos expostos ao operador e deixá-los continuar a inalar gás de isoflurano durante alguns minutos até o injeção foi executada.
   3. Confirme o sucesso da anestesia pela falta de um reflexo de retirada de pitada de dedo do pé.
   4. Aplica a pomada oftálmica aos olhos dos ratos para evitar ressecamento do olho.
      Nota: De acordo com o tamanho do recipiente e o número de máscaras de anestesia individuais disponíveis, um grupo de ratos pode ser anestesiado juntos e injetou um sob anestesia individual.
2. Desempenho da injeção
   1. Utilize uma mão para tenda a pele ao redor do mamilo quarto com uma pinça, para criar um "túnel" Erguido para a seringa seguir. Use a outra mão para segurar a seringa com a agulha virada para cima para entrar na pele por via subcutânea em 5-10 mm de mamilo; em seguida, siga o "túnel" até que a ponta da agulha aproxima-se o mamilo, cuidadosamente mover a agulha é dica para do tecido mamário até o olho de agulha vem sob a ponta do mamilo, descartar a pinça e injetar as células lentamente.
   2. Vire a agulha um pouco e retirar a seringa lentamente; Use um cotonete para pressionar a agulha ferida para 10-20 s para certificar-se de que não há nenhum escoamento de fluidos.
   3. Observar o mamilo quarto para confirmar uma injeção bem sucedida: uma esfera branca transparente plana com o mamilo como o centro pode ser observada (Figura 1).
3. Manter os ratos anestesiados por mais um minuto evitar que os ratos recuperar e mover-se muito rapidamente, que fará com que a injeção ferida para abrir e as células do tumor a vazar.

3. análise do crescimento tumoral e metástase

Nota: Tumores primários são identificados como solavancos transparentes ou bolha-como após as injeções e como esféricos ou elipsoide pedaços sólidos com o mamilo alguns dias mais tarde. O crescimento do tumor é avaliado pelo volume do tumor e bioluminescência do tumor.

1. Para estabelecer o volume do tumor, segure o mouse com uma mão. Expor sua barriga ao operador e use a outra mão para pinça apoio o tumor comprimento (L) e largura (W). Calcule o volume do tumor (V) como segue.
   V = (L x W²) / 2
2. Para capturar a bioluminescência de tumor, injete 150 mg/kg D-luciferina nuca do rato, 10 minutos antes da imagem latente. Anestesiar os ratos com gás de isoflurano 2% por 5 min e transferi-los para máscaras individuais de anestesia para deixá-los a inalar gás de isoflurano por mais 5 min. Seguindo as instruções do fabricante, capture imagens de bioluminescência do tumor primário e metástases, com tempo de exposição automática, binning médio e de f/stop em 1.

4. colheita do Tumor primário e metástases órgãos para análise

Nota: Quando alcançar o objetivo deste experimento, ou atingindo o ponto de extremidade humano, o tumor primário pode ser colhido para um estudo mais aprofundado. Neste estudo, os tumores são removidos em 4 a 5 semanas após a injeção, quando o volume do tumor atinge cerca de 800 mm³. Os pulmões são removidos na semana 8.

1. Colheita do tumor primário
   1. Realizar a cirurgia em um capuz estéril para manter um ambiente estéril. Anestesia os animais por isoflurano. Confirme o sucesso da anestesia pela falta de reflexos de retirada de pitada de dedo do pé. Aplica a pomada oftálmica aos olhos dos ratos para evitar que sequem.
   2. Dissocia o tumor da pele com uma tesoura, gota a gota analgésico (tramadol 1mg/mL, 1 gota de cerca de 50 µ l por rato) para aliviar a dor pós-operatória.
   3. Costurar a pele com uma sutura cirúrgica, cortar o excesso sutura, drape fora da incisão.
   4. Cortado ao meio com um bisturi, o tumor primário, coloque 1/2 do tumor em paraformaldeído 4% para mais hematoxilina e eosina (H & E) coloração e imuno-histoquímica e congelar imediatamente a outra 1/2 com nitrogênio líquido para a mancha ocidental ou um RNA estudo de isolamento mais tarde.
   5. Após a sutura, aquecer os ratos com uma lâmpada, até se recuperarem, manter os ratos em gaiolas simples até totalmente recuperado. Continuamente, administre tramadol 10 mg/kg com uma oral gavagem para 3 d após a cirurgia.
2. Colheita de órgãos de metástase
   1. Eutanásia em ratos com uma overdose de pentobarbital, abrir o peito com uma tesoura, delicadamente tirar os pulmões e lavá-los com PBS. Focos de metástase pulmonar podem ser identificados como branco transparente solavancos que são morfologicamente diferentes e distinguíveis de tecido pulmonar normal de rosa.
   2. Colocar os pulmões em paraformaldeído 4%, para verificar se a metástase por H & E mancha.

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Resultados

Depois de uma injeção bem sucedida, uma esfera branca transparente plana com o mamilo como a out-superfície redondo centro pode ser observado (Figura 1). O crescimento do tumor primário pode ser medido pelo volume do tumor e vivos tumor celular bioluminescência (Figura 2). Tanto o volume do tumor e o fluxo total aumentaram durante o experimento antes de ressecção. Numa fase inicial, a metástase não pode ser encontrado po...

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Discussão

As células utilizadas neste estudo são 4T1-luc2, células cancerosas murino mama triplo-negativo com rotulagem luciferase, que são uma ferramenta útil para investir efeitos antitumorais e antimetastatic de drogas devido à sua natureza altamente invasivo^2,19 . Luciferases, estáveis para a próxima geração de célula, são usados para indicar o tumor de vida células, ambos na glândula mamária e em outros órgãos distantes²⁰. Em a...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Midmark Corporation, Dayton, OH, USA	Matrx VMS	anesthesia
In-Vivo Imaging System	PerkinElmer	IVIS Spectrum	used for bioluminescence detecion
isoflurane	Hebei yipin chemical reagents  company	O21400	anesthesia
1 ml syringe	Becton,Dickinson and  Company	A257	cell injection
digital caliper	Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd.	S-H	volume measurement
tramadol	Mundipharma company	-	pain killer
D-luciferin	Gold Biotechnology Inc.	LUCK-1G	used for bioluminescence detecion
The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31	Abcam	ab28364	used for MVD detection
hematoxylin and eosin staining kit	Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9615	histology
hair removal cream	Veet	-	hair removal cream
Carbomer Eye Gel	Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH	-	ophthalmic ointment
sewing needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	17U0302J	suture