Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Brustkrebs-Zellen in der Mamma Fettpolster in einer einfachen, weniger invasiv und einfach zu handhabende Möglichkeit, einzupflanzen und dieses orthotopen Brust Krebs Mausmodell mit einer richtigen Mamma Fettlappen Umgebung kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu untersuchen Krebs.

Zusammenfassung

Eine ordnungsgemäße Tiermodell ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Krankheiten. Animal Modelle hergestellt durch verschiedene Methoden (subkutane Injektionen, Xenotransplantate, Genmanipulation, chemische Reagenzien Induktion, etc.) haben verschiedene pathologische Charaktere und spielen eine wichtige Rolle bei der Untersuchung bestimmte Aspekte der Krankheiten. Obwohl kein einheitliches Modell der ganzen menschlichen Krankheitsverlauf völlig nachahmen kann, spielen orthotopen Organe Krankheitsmodelle mit geeigneten Stromazellen Rahmenbedingungen eine unersetzliche Rolle bei Krankheiten zu verstehen und mögliche Drogen-screening. In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu implantieren Brustkrebszellen in Mamma Fettpolster in einer einfachen, weniger invasiv und einfach zu handhabende Weg und folgen der Metastasierung zu entfernten Organen. Mit den richtigen Funktionen Primärtumor Wachstum, Brust und Brustwarze pathologischen Veränderungen, und ein hohes Auftreten von anderen Organen Metastasen ahmt dieses Modell maximumly menschlichen Brust Krebs fortschreiten. Primärtumor Wachstum in Situ, lang-Fernmetastasen und der Tumor Mikroumgebung von Brustkrebs können durch die Verwendung dieses Modells untersucht werden.

Einleitung

Brustkrebs ist die häufigste Ursache für weibliche Sterblichkeit weltweit. Mit seiner progressiv steigender Inzidenz ist Brustkrebs eine ernste Herausforderung für die öffentliche Gesundheit¹geworden. Murine Krebs Modelle sind gute Brücken zwischen präklinischen und klinischen Studien, und eine gute mimische murinen Krankheitsmodell erhöhen die Genauigkeit der Forschung zur Krankheit und Medizin.

Primärtumor Wachstum beginnt den Fortschritt der malignen Erkrankungen, Metastasen und Komplikationen die Hauptursachen des Todes und der Armen Lebensqualitäten in den meisten Krebspatienten sind. Mehrere murinen Modelle werden verwendet, um die Pathologie der menschlichen Brust Krebs^2,3,4zu imitieren. Xenograft-Modelle sind für Krebs-Studie, die pathologischen Zeichen zu verstehen und zu Bildschirm Drogen für die Sicherheit und Wirksamkeit^5,6,7verbreitet. Gentechnisch veränderte Mäuse (GEM) werden generiert, um menschlichen Brustkrebs zu imitieren, indem Sie auf bestimmte Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene-⁸. GEM haben einen relativ einfachen und uniformierten Hintergrund zu verstehen, die Rolle der Gene Krebs Fortschritte; künstlichen Umwelt und Hintergrund sind jedoch begrenzt, die Metastasen Pathologie zu untersuchen und verwandte Therapien⁹. Menschlichen Krebszellen, wobei menschliche pathologische Züge können nur implantiert werden in immundefiziente Mäuse, und die Unzulänglichkeit der Tumor-Host immun Interaktion zu verzerrten Ergebnissen¹⁰führen kann.

Wo die soliden Tumoren initiiert hat einen direkten Einfluss auf die biologische und pathologischen Zeichen der Krankheit^11,12,13. Da Krebs Fortschritte der komplizierten Interaktionen zwischen Tumorzellen, stromale Zellen, Zellen der Immunologie, Entzündungszellen, Wachstumsfaktoren und Proteasen ergibt sich, Primärtumoren implantiert in Situ besseren Einblick und imitieren die kanzerösen Prozess Zellen genauer als Tumoren induziert durch chemische Mittel oder eine subkutane Injektion des Tumors. Chemische Mittel verwendet, um Tumore zu induzieren, Forscher und Umwelt schädlich sein können und sind in einigen Ländern sogar verboten. Wegen des Fehlens einer Mamma Fettlappen Umgebung kann der pathologische Fortschritt eine subkutane Injektion mit unterscheiden sich in echten Brustkrebs-Patientinnen, deren Krebs stammt und von der Mamma Fettlappen reizt. Die Nachteile des subkutanen Injektionen Heranziehung die orthotopen Modelle Tumorwachstum zu studieren. In früheren Untersuchungen angegeben hoch metastatische Tumoren der MDA-MB-231, entwickelt nach sieben orthotopen Transplantationen, die Bedeutung der Injektion Lage¹⁴. Vor kurzem war die orthotopen Implantation von Brustkrebs-Zellen in der Mamma Fettpolster mit Chirurgie gemeldeten^15,16. Mit der Mamma Pad-Umwelt, das Tumorwachstum und die Migration in entfernte Organe decken den gesamten Prozess von Brustkrebs bei pathologisch relevanten Websites wodurch dieses Modell eine Miniatur des Fortschritts der menschlichen Krankheiten. Allerdings versucht die Haut nach der Operation automatisch zur Selbstheilung, die bringen des potenziellen Risikos einer Störung der normalen Brust-Krebs-Entstehung und die Ergebnisse beeinflussen können.

Wir haben einige Brust-Krebs-Modelle verglichen und gründete eine minimalinvasive orthotopen Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Medikamente auf Brust Krebs Fortschreiten^17,18. In dieser Studie ein video Protokoll zum Orthotopically injizieren Brustkrebs-Zellen in der Mamma Fettpolster in einer einfachen, weniger invasive Weise präsentiert. Diese orthotopen Injektion Methode ohne Operation ist in vielerlei Hinsicht vorteilhaft. Zuerst, die Bedienung ist einfach und schnell, ca. 1 Minute pro Maus. Zweitens mit Primärtumor Herde direkt pathologischen Websites ab, es deckt den ganzen tumorigenic Prozess der Brust Tumorprogression aus dem Wachstum des Tumors in anderen Organen Metastasen, bietet eine gute experimentellen Tiermodell für das Studium der Zusammenspiel von Tumorzellen und Tumor Mikroumgebung. Es kann außerdem ein wertvolles Modell, die Behandlungseffekte in allen Stadien von Brustkrebs zu schätzen. Das Ziel dieser Methode ist zu einem Tiermodell zu maximumly mimischen menschlichen Brust Krebs fortschreiten.

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Protokoll

Tierversuche wurden im Einklang mit der Bereitstellung und allgemeine Empfehlung der chinesischen experimentelle Tier Verwaltung Gesetzgebung und durch die Einrichtung von Animal Care und Nutzung Ausschuss der Hauptstadt Medical University angenommen wurden (Ref keine. AEEI-2014-052). Weibliche Balb/c Mäusen im Alter von 6 bis 8 Wochen dienten.

1. Vorbereitung der Zellen und Tieren

1. Rasieren Sie einen Tag vor der Operation die Haare rund um die vierte Brustwarzen, im OP-Bereich verfügbar zu machen.
   1. Verwenden Sie eine Hand, halten Sie die Maustaste fest auf der Rückseite um sicherzustellen, dass die Maus nicht frei bewegen, drehen Sie die Maus, um seinen Bauch an den Betreiber zu entlarven, und verwenden Sie dann eine andere Hand, um das Fell um die vierte Brustwarzen mit einem elektronischen Rasierer zu rasieren.
   2. Legte eine dünne Schicht der Haarentfernung Creme um die Brustwarzen für 30-60 s, entfernen Sie die Creme mit destilliertem Wasser und trocknen Sie die Maus mit weichem Papier.
2. Am Tag der Operation sammeln Sie murinen Brustkrebszellen (4T1-luc2) zu, zählen Sie, Zelle, und passen Sie die Zelldichte, 2 x 10⁵ Zellen/mL in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und halten sie auf dem Eis. Für jede Maus ist 1 x 10⁴ Zellen/50 µL in einer 1-mL-Spritze bereit.

(2) orthotopen Injektion

1. Betäubung von Mäusen
   1. Anästhesie zu induzieren. Setzen Sie die Mäuse in einem geschlossenen transparenten Behälter und schalten Sie 2 % Isofluran Gas um die Mäuse für ca. 5 min zu betäuben, bis sie alle hinlegen und fallen schlafend.
   2. Pflegen Sie Anästhesie. Übertragen Sie die Mäuse aus dem Behälter auf individuelle Anästhesie-Masken, einige Vet-Salbe auf ihre Augen zu Trockenheit zu vermeiden, halten die Mäuse supinely mit ihren Nippel an den Betreiber ausgesetzt, und lassen weiterhin Isofluran Gas einatmen, für ein paar Minuten, bis die Injektion durchgeführt worden.
   3. Bestätigen Sie den Erfolg der Anästhesie durch den Mangel an einer Zehe Prise Rückzug Reflex.
   4. Gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen der Mäuse, Augentrockenheit zu verhindern.
      Hinweis: Je nach Größe des Containers und die Anzahl der einzelnen Anästhesie-Masken zur Verfügung, eine Gruppe von Mäusen kann zusammen betäubt und eins nach dem anderen in einzelnen Betäubung eingespritzt.
2. Leistung der Injektion
   1. Verwenden Sie Zelt die Haut mit einer Hand um die vierte Brustwarze mit einer Pinzette, zum Einrichten eines erhobenen "Tunnels" für die Spritze zu folgen. Verwendung der anderen Hand halten Sie die Spritze mit der Nadel nach oben gedreht, geben Sie die Haut subkutan bei 5-10 mm aus Brustwarze; dann folgen Sie den "Tunnel", bis die Nadelspitze in der Nähe der Brustwarze kommt, ziehen Sie vorsichtig die Nadel Tipp oben in der Mamma Fettlappen, bis das Nadelöhr kommt unter der Brustwarze-Spitze, verwerfen die Pinzette und die Zellen langsam zu injizieren.
   2. Die Nadel ein wenig umdrehen und die Spritze langsam zurückziehen; Drücken Sie die Nadel gewickelt für 10-20 s, um sicherzustellen, gibt es keine Flüssigkeit sickern mit einem Wattestäbchen.
   3. Die vierte Brustwarze bestätigen eine erfolgreiche Injektion zu beobachten: eine weiße transparente flache Kugel mit der Brustwarze als Zentrum beobachtet werden (Abbildung 1).
3. Halten Sie die Mäuse betäubt für eine weitere Minute zu vermeiden, dass die Mäuse zu erholen und zu schnell zu bewegen, die wird dazu führen, dass der Spritze aufgezogen, um zu öffnen und die Tumorzellen zu entweichen.

3. Analyse der Tumorwachstum und Metastasierung

Hinweis: Primärtumoren sind transparent oder Blister-wie Beulen nach Injektionen sowie als Kugel oder Ellipsoid feste Klumpen mit der Brustwarze ein paar Tage später identifiziert. Tumorwachstum wird vom Tumorvolumen und Tumor Biolumineszenz ausgewertet.

1. Um das Tumorvolumen zu etablieren, halten Sie die Maus mit einer Hand. Setzen Sie ihren Bauch an den Betreiber und verwenden Sie der anderen Seite, um den Tumor Länge (L) und Breite (W) caliper. Das Tumorvolumen (V) wie folgt zu berechnen.
   V = (L x W²) / 2
2. Um den Tumor Biolumineszenz zu erfassen, zu injizieren 150 mg/kg D-Luciferin auf der Rückseite der Maus Hals, 10 min vor der Bildgebung. Betäuben Sie die Mäuse mit 2 % Isofluran Gas für 5 min zu und übertragen Sie sie auf einzelnen Anästhesie-Masken zu Isofluran Gas für 5 min länger inhalieren lassen. Nach den Anweisungen des Herstellers die Aufnahmen Sie Biolumineszenz der Primärtumor und Metastasen, mit Auto-Belichtungs-Dauer, mittlere binning und f/Stop am 1.

4. Ernte der Primärtumor und Metastasen Organe für die Analyse

Hinweis: Wenn den Zweck dieses Experiment, oder erreichen die humaneren Endpunkt zu erreichen, kann der Primärtumor für weitere Studie geerntet werden. In dieser Studie werden Tumoren bei 4 bis 5 Wochen nach der Injektion entfernt, wenn das Tumorvolumen ca. 800 mm³erreicht. Die Lungen sind in Woche 8 entfernt.

1. Ernte des Primärtumors
   1. Führen Sie die Operation in einem sterilen Abzug eine sterile Atmosphäre beibehalten. Die Tiere von Isofluran zu betäuben. Bestätigen Sie den Erfolg der Anästhesie durch den Mangel an Zehe Prise Rückzug Reflexe. Gelten Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen der Mäuse, damit sie nicht austrocknen.
   2. Distanzieren Sie den Tumor von der Haut mit Schere, tropfenweise Schmerzmittel (1 mg/mL Tramadol, 1 Tropfen etwa 50 µL pro Maus), um postoperative Schmerzen zu lindern.
   3. Nähen Sie die Haut mit einer chirurgischen Naht zu, schneiden Sie überschüssiges Naht, aus der Schnitt drapieren.
   4. Halbierung der Primärtumor mit einem Skalpell, 1/2 des Tumors in 4 % Paraformaldehyd für weitere Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und Immunohistochemistry genommen und sofort Einfrieren der anderen 1/2 mit flüssigem Stickstoff für das westliche Beflecken oder einer RNA Isolierung-Studie später.
   5. Nach nähen, wärmen die Mäuse mit einer Lampe, bis sie sich erholen, halten Sie die Mäuse in einzelne Käfige bis vollständig erholt. Verwalten Sie kontinuierlich 10 mg/kg Tramadol mit einer oralen Magensonde für 3-d nach der Operation.
2. Ernte der Metastasierung Organe
   1. Einschläfern Sie die Mäuse mit einer Überdosis von Pentobarbital, öffnen Sie ihre Brust mit einer Schere vorsichtig herausnehmen Sie der Lunge und mit PBS waschen. Lungenkrebs Metastasen Brennpunkte können identifiziert werden, wie weiß transparent Beulen, die morphologisch unterschiedlich und von normalen rosa Lungengewebe zu unterscheiden sind.
   2. Legen Sie die Lungen in 4 % Paraformaldehyd, die Metastase durch H & E Färbung zu überzeugen.

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Ergebnisse

Nach einer erfolgreichen Injektion, eine weiße transparente flache Kugel mit der Brustwarze als die out-Oberfläche hindurch Zentrum beobachtet werden (Abbildung 1). Wachstum des primären Tumors kann gemessen werden Tumorvolumen und lebendigen Tumor Zelle Biolumineszenz (Abbildung 2). Das Tumorvolumen und den Gesamtfluss erhöht während des Experiments vor Resektion. In einem frühen Stadium kann nicht Metastasen gefunden werd...

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Diskussion

In dieser Studie verwendeten Zellen sind 4T1-luc2, murine Triple-negativem Brustkrebs-Zellen mit Luciferase zu beschriften, sind ein nützliches Werkzeug für die Investierung Antitumor- und antimetastatic Wirkungen von Medikamenten aufgrund ihrer sehr invasive Natur^2,19 . Luciferases, stabil, um die nächste Zellgeneration werden verwendet, um den lebenden Tumor zeigen Zellen, sowohl bei der Brustdrüse und bei anderen entfernten Organen²⁰

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Midmark Corporation, Dayton, OH, USA	Matrx VMS	anesthesia
In-Vivo Imaging System	PerkinElmer	IVIS Spectrum	used for bioluminescence detecion
isoflurane	Hebei yipin chemical reagents  company	O21400	anesthesia
1 ml syringe	Becton,Dickinson and  Company	A257	cell injection
digital caliper	Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd.	S-H	volume measurement
tramadol	Mundipharma company	-	pain killer
D-luciferin	Gold Biotechnology Inc.	LUCK-1G	used for bioluminescence detecion
The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31	Abcam	ab28364	used for MVD detection
hematoxylin and eosin staining kit	Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9615	histology
hair removal cream	Veet	-	hair removal cream
Carbomer Eye Gel	Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH	-	ophthalmic ointment
sewing needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	17U0302J	suture