Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.

Abstract

Un modello animale adeguato è fondamentale per una migliore comprensione delle malattie. Animale modelli stabiliti dai diversi metodi (iniezioni sottocutanee, xenotrapianti, manipolazione genetica, induzione di reagenti chimici, ecc.) hanno vari caratteri patologici e svolgono un ruolo importante nell'investigare alcuni aspetti della malattie. Sebbene nessun singolo modello può imitare totalmente la progressione di malattia umana, modelli di malattia ortotopici organi con un adeguato ambiente stromale giocano un ruolo insostituibile nella comprensione delle malattie e di screening per potenziali farmaci. In questo articolo, descriviamo come impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, in modo meno invasivo e facile da maneggiare e seguire la metastasi in organi distanti. Con le funzionalità corretta della crescita del tumore primario, al seno e alterazioni patologiche del capezzolo e un alto avvenimento della metastasi in altri organi, questo modello maximumly imita la progressione del cancro al seno umano. Crescita del tumore primario in situ, metastasi a distanza lunga e microambiente tumorale di cancro al seno può essere indagate utilizzando questo modello.

Introduzione

Cancro al seno è la principale causa di mortalità femminile in tutto il mondo. Con la sua incidenza progressivamente crescente, cancro al seno è diventata una seria sfida alla sanità pubblica¹. Modelli murini del cancro sono buoni ponti tra studi preclinici e clinici, e un modello di buona mimica malattia murina aumenterà la precisione della ricerca sulla malattia e medicina.

Crescita del tumore primario inizia lo stato di avanzamento della malattia maligna, mentre le metastasi e le complicazioni sono le principali cause di morte e qualità di vita scarsa nella maggior parte dei malati di cancro. Diversi modelli murini sono utilizzati per simulare la patologia del cancro di seno umano^2,3,4. Modelli di xenotrapianto sono ampiamente utilizzati per lo studio del cancro capire i caratteri patologici e ai farmaci di schermo per la sicurezza e l'efficacia^5,6,7. Topi geneticamente modificati (GEM) vengono generati per simulare il cancro al seno umano di mira alcuni oncogeni o di geni del soppressore del tumore⁸. GEM hanno un background relativamente semplice e uniforme per comprendere il ruolo dei geni in corso cancerosa; Tuttavia, l'ambiente artificiale e sfondo sono limitati a studiare la patologia di metastasi e relative terapie⁹. Cellule tumorali umane, anche se con caratteristiche patologiche umane, possono solo essere impiantate in topi immune-carenti, e l'insufficienza dell'interazione tumore-ospite immune può portare a risultati parziale¹⁰.

Dove inizia il tumore solido ha un'influenza diretta sui caratteri biologici e patologici della malattia^11,12,13. Poiché il progresso cancerosa è il risultato di complicati delle interazioni tra le cellule del tumore, le cellule stromali, immunologia cellule, cellule infiammatorie, fattori di crescita e proteasi, tumori primari impiantati in situ fornire una migliore comprensione e imitare la con più precisione i tumori indotti da agenti chimici o un'iniezione sottocutanea di tumore cellule cancerosa processo. Agenti chimici utilizzati per indurre i tumori possono essere dannosi per i ricercatori e ambiente e sono addirittura vietati in alcuni paesi. A causa dell'assenza di un ambiente di cuscinetto grasso mammario, il progresso patologico di un'iniezione sottocutanea può differire con che nei pazienti di cancro di seno reale, cui il cancro ha origine e irrita da cuscinetto grasso mammario. Gli svantaggi di iniezioni sottocutanee incoraggiano l'uso di Modelli ortotopici per studiare la crescita del tumore. In ricerche precedenti, tumori altamente metastatici di MDA-MB-231, sviluppati dopo sette trapianti ortotopici, indicato l'importanza della posizione iniezione¹⁴. Recentemente, l'impianto ortotopico di cellule di cancro al seno in cuscinetto grasso mammario con la chirurgia è stato segnalato^15,16. Con l'ambiente di cuscinetto mammario, la crescita del tumore e la migrazione in organi distanti coprire l'intero processo di cancro al seno presso siti patologicamente rilevanti, che rende questo modello una miniatura del progresso delle malattie umane. Tuttavia, dopo l'intervento chirurgico, la pelle tenta automaticamente di guarire se stesso, che può portare il potenziale rischio di interferire con l'origine del cancro di seno normale e falsare i risultati.

Abbiamo confrontato alcuni modelli di cancro al seno e stabilito un modello ortotopico mininvasiva per studiare l'effetto potenziale delle droghe il seno cancro progressione^17,18. In questo studio, un protocollo dei video su come orthotopically iniettare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, modo meno invasivo è presentato. Questo metodo di iniezione di orthotopic senza chirurgia è vantaggioso in molti modi. In primo luogo, l'operazione è semplice e rapida, circa 1 minuto per topo. In secondo luogo, con i fuochi del tumore primario a partire dai siti proprio patologici, copre il processo intero cancerogeno della progressione del cancro di seno dalla crescita del tumore ad altre metastasi di organi, che fornisce un buon modello animale sperimentale per lo studio della interazione delle cellule del tumore e microambiente tumorale. Inoltre, può essere un valido modello per stimare gli effetti del trattamento in tutte le fasi del cancro al seno. L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire un modello animale alla progressione tumorale maximumly materno mimico.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la fornitura e la raccomandazione generale di legislazione amministrazione cinese animali sperimentali e sono stati approvati dall'Istituto di cura degli animali e uso Comitato di Capital Medical University (Ref no. AEEI-2014-052). Sono stati utilizzati topi Balb/c femmina 6-8 settimane di età.

1. preparazione delle cellule e animali

1. Un giorno prima dell'operazione, radersi i capelli intorno ai capezzoli quarto per esporre l'area operativa.
   1. Usare una mano per tenere saldamente il mouse sul retro per assicurarsi che il mouse non muoversi liberamente, alzare il mouse per esporre la sua pancia per l'operatore e quindi utilizzare un'altra mano per radere il pelo intorno ai capezzoli quarto con un rasoio elettronico.
   2. Mettere uno strato sottile di rimozione dei capelli crema intorno ai capezzoli per 30-60 s, pulire via la crema con acqua distillata e asciugare il mouse con carta morbida.
2. Il giorno dell'operazione, raccogliere le cellule di carcinoma mammario murino (4T1-luc2), contare il numero di cellulare e regolare la densità delle cellule a 2 x 10⁵ cellule/mL in tampone fosfato salino (PBS) in microcentrifuga sterile e tenerli sul ghiaccio. Per ogni mouse, 1 x 10⁴ cellule/50 µ l in una siringa da 1 mL è preparato.

2. Orthotopic iniezione

1. Anestesia di topi
   1. Indurre l'anestesia. Mettere i topi in un contenitore trasparente chiuso e accendere 2% isoflurane gas per anestetizzare i topi per circa 5 minuti, finche ' non mentono tutti e caduta addormentata.
   2. Mantenere l'anestesia. Trasferire i topi dal contenitore per maschere individuali anestesia, mettere qualche unguento veterinario sui loro occhi per evitare la secchezza, tenere i topi passivamente con i loro capezzoli esposti all'operatore e far loro continuare a inalare gas isoflurano per pochi minuti fino a quando il iniezione è stata eseguita.
   3. Confermano il successo dell'anestesia dalla mancanza di un riflesso di ritiro pizzico di punta.
   4. Applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi per prevenire la secchezza degli occhi.
      Nota: Secondo la dimensione del contenitore e il numero di singoli anestesia maschere disponibili, un gruppo di topi può essere anestetizzato insieme e iniettato uno sotto anestesia individuo.
2. Prestazioni dell'iniezione
   1. Con una mano alla tenda la pelle intorno al capezzolo quarto con le pinzette, per impostare un "tunnel" sollevato per la siringa a seguire. Utilizzare l'altra mano per tenere la siringa con l'ago rivolto verso l'alto per entrare nella pelle per via sottocutanea a 5-10 mm dal capezzolo; quindi, seguire il "tunnel" fino a quando la punta dell'ago si avvicina il capezzolo, spostare con cautela l'ago punta su nel cuscinetto grasso mammario finché non arriva l'occhio dell'ago sotto la punta del capezzolo, scartare le pinzette e iniettare le cellule lentamente.
   2. Girare un po ' intorno all'ago e ritrarre la siringa lentamente; utilizzare un tampone di cotone per premere l'ago ferita per 10-20 s per assicurarsi che non vi è nessuna infiltrazione di fluidi.
   3. Osservare il quarto capezzolo per confermare un'iniezione di successo: una sfera piatta trasparente bianca con il capezzolo come il centro può essere osservata (Figura 1).
3. Tenere i topi anestetizzati per un altro minuto per evitare che i topi recuperare e spostare troppo in fretta, che farà sì che l'iniezione della ferita per aprire e le cellule del tumore per fuoriuscire.

3. analisi della crescita del tumore e metastasi

Nota: I tumori primari sono identificati come trasparente o bolla-come dossi dopo le iniezioni e come grumi solidi sferiche o ellissoidale con il capezzolo pochi giorni dopo. Crescita del tumore viene valutata dal volume del tumore e bioluminescenza del tumore.

1. Per stabilire il volume del tumore, tenere premuto il mouse con una mano. Esporre la sua pancia all'operatore e usare l'altra mano a pinza tumore lunghezza (L) e larghezza (W). Calcolare il volume del tumore (V) come segue.
   V = (L x W²) / 2
2. Per acquisire la bioluminescenza tumore, iniettare 150mg/kg D-luciferina nuca del mouse, 10 min prima di formazione immagine. Anestetizzare i topi con 2% isoflurane gas per 5 min e trasferirli maschere individuali anestesia per far loro inalare gas isoflurano per più di 5 min. Seguendo le istruzioni del produttore, è possibile catturare immagini di bioluminescenza del tumore primario e metastasi, con tempo di esposizione di auto, binning medie e f/stop a 1.

4. raccolta del tumore primario e metastasi organi per l'analisi

Nota: Quando il conseguimento dello scopo di questo esperimento, o raggiungere l'endpoint humane, il tumore primario può essere raccolto per ulteriore studio. In questo studio, i tumori sono rimossi a 4 a 5 settimane dopo l'iniezione, quando il volume del tumore raggiunge circa 800 mm³. I polmoni vengono rimossi alla settimana 8.

1. Raccolta del tumore primario
   1. Eseguire l'intervento in una cappa sterile di mantenere un'atmosfera sterile. Anestetizzare gli animali da isoflurane. Confermano il successo dell'anestesia dalla mancanza di riflessi di ritiro di punta pizzico. Applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi per impedire loro di seccarsi.
   2. Dissociare il tumore della pelle con le forbici, goccia a goccia antidolorifico (1 mg/mL tramadol, 1 goccia di circa 50 µ l per topo) per alleviare il dolore post-operatorio.
   3. Cucire la pelle con una sutura chirurgica, tagliare l'eccesso sutura, drappo fuori l'incisione.
   4. Tagliare il tumore primario nella metà con un bisturi, mettere 1/2 del tumore in paraformaldeide al 4% per ulteriore ematossilina ed eosina (H & E) e immunohistochemistry e congelare immediatamente l'altra 1/2 con azoto liquido per macchiarsi occidentale o un RNA Studio di isolamento più tardi.
   5. Dopo la sutura, caldo, i topi con una lampada fino a recuperare, mantenere i topi in gabbia singola fino a completamente recuperato. Continuamente amministrare tramadol 10 mg/kg con una sonda gastrica orale per 3 d dopo l'intervento chirurgico.
2. Espianto di organi di metastasi
   1. Eutanasia i topi con una overdose di pentobarbital, aprire i loro forzieri con le forbici, delicatamente prendere fuori i polmoni e lavarli con PBS. Fuochi di metastasi del polmone possono essere identificati come bianco trasparente dossi che sono morfologicamente diverso e distinguibile dal tessuto polmonare normale rosa.
   2. Mettere i polmoni in paraformaldeide al 4% per verificare la metastasi macchiando di H & E.

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Risultati

Dopo un'iniezione di successo, una sfera piatta trasparente bianca con il capezzolo come il fuori-superficie rotondo centro possa essere osservato (Figura 1). Crescita del tumore primario può essere misurata dal volume del tumore e tumore vivente delle cellule di bioluminescenza (Figura 2). Sia il volume del tumore e il flusso totale è aumentato durante l'esperimento prima di resezione. In una fase iniziale, non è possibile tr...

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Discussione

Le celle utilizzate in questo studio sono 4T1-luc2, cellule tumorali murine al seno triplo-negativo con etichettatura luciferasi, che sono un utile strumento per investire gli effetti antitumorali e antimetastatic di farmaci a causa della loro natura altamente invasiva^2,19 . Luciferasi, stabile per la prossima generazione di cellulari, vengono utilizzati per indicare il tumore di vivere cellule, entrambi presso la ghiandola mammaria e presso altri organi distanti...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Midmark Corporation, Dayton, OH, USA	Matrx VMS	anesthesia
In-Vivo Imaging System	PerkinElmer	IVIS Spectrum	used for bioluminescence detecion
isoflurane	Hebei yipin chemical reagents  company	O21400	anesthesia
1 ml syringe	Becton,Dickinson and  Company	A257	cell injection
digital caliper	Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd.	S-H	volume measurement
tramadol	Mundipharma company	-	pain killer
D-luciferin	Gold Biotechnology Inc.	LUCK-1G	used for bioluminescence detecion
The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31	Abcam	ab28364	used for MVD detection
hematoxylin and eosin staining kit	Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9615	histology
hair removal cream	Veet	-	hair removal cream
Carbomer Eye Gel	Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH	-	ophthalmic ointment
sewing needle	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	17U0302J	suture