Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi Vitro tarafından

Özet

Bu iletişim kuralı bir soğuk atmosferik plazma tedavisinin ayrıntılı deneysel adımlar sinir kök hücreleri ve farklılaşma Geliştirme için ayirt algılama sunmayı amaçlamaktadır.

Özet

Fiziksel plazma teknoloji, soğuk atmosferik plazmasının (CAP) yaygın olarak araştırdık gibi dekontaminasyon, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, kök kanal tedavisi, vb, yeni bir araştırma alanı oluşturan plazma tıp adında. Elektrik, kimyasal ve biyolojik reaktif türlerin bir karışımı olarak, kapaklar her iki vitro sinir kök hücre farklılaşması geliştirmek için yeteneklerini göstermiştir ve vivo içinde ve are olma nörolojik hastalık tedavisi için umut verici bir yol gelecekte. Çok daha heyecan verici haber büyük harfler kullanarak tek adımlı farkında olmayabilir ve güvenli bir şekilde yönettiği, sinir kök hücreleri (NSCs) ayrımında doku ulaşım için olduğunu. Biz burada detaylı Deneysel protokol NSC farklılaşma C17.2-NSCs ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirmek için kendini yetiştirmiş bir kap jet aygıtı kullanarak hem de hücre kaderi ile ters gözlemleyerek ve floresan mikroskopi göstermek. Teknoloji boyama ayirt yardımıyla daha işlenmemiş grubu hızlandırılmış bir Diferansiyel oranı gösterdi her iki NSCs bulduk ve ~ %75-in NSCs seçmeli olarak esas olarak Olgun, kolinerjik ve motor nöronların farklı nöronlar.

Giriş

NSCs yönlendirilmiş farklılaşma doku ulaşım için belirli bir soy içine nörodejeneratif ve neurotraumatic hastalıkları¹için en umut verici tedavilerin biri olarak kabul edilir. Örneğin, catecholaminergic dopaminerjik nöron özellikle Parkinson hastalığı (PD) tedavisinde istenen. Ancak, istediğiniz hücreleri taşıma için hazırlamak için geleneksel yöntemlerle kimyasal toksisitesi, yara oluşumu veya büyük ölçüde engellemektedir rejeneratif tıp²NSCs uygulamalarda diğerleri gibi birçok sakıncaları vardır. Bu nedenle, bir roman ve güvenli bir şekilde NSC farklılaşma için bulmak çok gereklidir.

Plazma konularda, aşağıdaki katı, sıvı ve gaz dördüncü durumudur ve bu konularda tüm evrenin % 95'den fazla teşkil eder. Plazma ilişkisiz pozitif/negatif ve tarafsız parçacıkları ile elektriksel olarak nötr ve genellikle yüksek gerilim deşarj Lab tarafından oluşturulur. Son yirmi yılda, biyomedikal plazmada uygulanması soğuk atmosferik basınç plazma teknoloji geliştirme dünya çapında büyük dikkat çekti. Bu teknik sayesinde istikrarlı düşük sıcaklık plazma ark oluşumu olmadan atmosferi çevreleyen havasında oluşturulacak ve reaktif nitrojen türler (RNS), reaktif oksijen türleri (ROS), ultraviyole (UV) gibi çeşitli reaktif türler oluşur radyasyon, elektronlar, iyonlar ve elektrik alanı³. Kapaklar mikro-organizma inactivation, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, cilt hastalıkları, hücre çoğalması ve hücre farklılaşması^4,5,6,7tedavisi için benzersiz avantajları vardır. Önceki çalışmalarda, biz soğuk atmosferik plazma jet NSCs farklılaşma fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSCs) ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirebilirsiniz yönettiği için güçlü bir araç olmak için büyük bir potansiyele sergilenmesi gösterdi NSCs⁸farklılaşma. CAP geliştirme NSC farklılaşma mekanizması henüz tam olarak anlaşılmaktadır değil, ancak Hayır kapaklar tarafından oluşturulan sürecinde önemli bir faktör olduğu ortaya çıktı. Bu çalışmada, biz bir atmosfer basıncı helyum/oksijen plazma jeti NSCs vitro, hücre hazırlık ve Önarıtma, morfoloji gözlem tarafından ters mikroskop, tedavisi için kullanmanın ayrıntılı bir deneysel protokol sağlamayı amaçlamaktadır ve floresans mikroskobu gözlem ayirt boyama.

Protokol

1. hücre kültürleri ve Predifferentiation

1. Nöral kök hücre kültür ve predifferentiation
   1. Poli-D-lizin-kaplı coverslips hazırlayın. Steril coverslip (20 mm çapında) 12-şey plaka koymak. Poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su (Malzemeler tablo) ile kapak cam coverslips üzerinde daha iyi hücre adezyon için sonraki adımları izleyerek kat.
      Not: Her hücre kültürünü ve uygulama için en uygun koşulları belirlenmelidir.
      1. Aseptik poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su ile coverslip yüzey kat. Rock yavaşça coverslip yüzey bile bir kaplama emin olmak için.
      2. Sonra geceleme (~ 12 h) 37 ° C'de kültür, poli-D-lizin çözümü kaldırmak ve yüzey 3 durulayın x 1 mL steril su ile.
      3. Hücreleri en az 30 dk onları tohum önce kuru.
2. Fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSC) kültür ve predifferentiation
   1. C17.2-NSCs Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS), % 5 at serum (HS) ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C ve % 5 CO₂ ~ 2-3 d için takıma bir 25 cm² şişesi içinde kuluçkaya.
   2. Hücreleri % 85 izdiham ulaştığınızda, orta kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerle yıkama ve taze tripsin (% 0,25) 1 mL şişe ekleyin. 1 dakika bırakın; daha sonra kültür orta 1 mL şişe ve pipet yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon emin olmak için birkaç kez ekleyin.
   3. Bir hemasitometre kullanarak süspansiyon hücrelerde yoğunluk saymak. 2 x 10⁴ hücre/mL son hücre konsantrasyon vermek için hücre süspansiyon gerekli hacmi hesaplamak.
   4. C17.2-NSCs 12-şey plaka ~ 2 x de başına 10⁴ hücre yoğunluğu ile kaplı coverslips üzerinde tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğu kontrol edin.
      Not: daha iyi bir sonuç için optimum hücre yoğunluğu ayirt deneme önce belirlenmesi gerekir.
   5. Bir hücre kuluçka için eki için izin vermek 12 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
   6. Hücreler 2 ek sonra yıkayın x 1 mL PBS ile ve hücrelerin plazma tedavi öncesi 48 saat için %1 N2 eki ile DMEM/F12 oluşan farklılaşma orta ile yetiştirmek.
3. Birincil sıçan nöral kök hücre kültür ve predifferentiation
   1. Sıçan NSC büyüme aracı olarak kaplamasız T25 şişeler 5 x 10⁵ hücre yoğunluğu, birincil fare NSC süspansiyon kültür.
      Not: Birincil fare NSCs Xie vd. protokol sonrası izole ⁹.
   2. Ters bir mikroskop altında neurospheres oluşumunu kontrol edin. Neurospheres morfoloji küresel ve şeffaf çok hücreli kompleksleri sergileyen emin olun.
   3. Neurospheres 3 mm veya daha büyük bir çap ulaştığınızda, bir 15 mL steril santrifüj tüpü ve yerçekimi tarafından neurospheres razı olsun neurosphere süspansiyon aktarın.
   4. Neurospheres orta hacmi en az çok dikkatli bir şekilde bırakmak süpernatant kaldırın.
   5. Durulama neurospheres 1 x 5 mL de PBS ve neurospheres yerleşmek yerçekimi tarafından izin ile. PBS bir asgari miktar bırakmak süpernatant kaldırın.
   6. Farklılaşma orta ~ 12-15 neurospheres mililitre başına için hücre yoğunluğunu ayarlamak için uygun birim ekleme. Farklılaşma orta birincil fare NSCs için DMEM/F12, %2 B27 ve % 1 oluşan FBS.
   7. Tohum neurosphere süspansiyon kaplamalı her coverslip 12-şey plaka üzerine 1 mL.
      Not: hafifçe neurospheres eşit olarak dağıtılır sağlamak için plaka sallamak. Daha iyi bir ayirt sonuç için kritik bir adımdır.
   8. Plaka da kuluçka yerleştirin ve plazma tedavi öncesi 24 h için predifferentiate sağlar.

2. plazma jetlerin hazırlanması

1. Bir iç çapı 2 mm ve bir dış çapı 4 mm. ile bir yarı-açık kuvars tüp takın bir yüksek gerilim tel çapı 2 mm ile tüpün içine seçin.
2. Kuvars tüp yüksek gerilim tel ile 5 mL şırınga yerleştirin ve bir tutucu şırınga merkezi içinde bağlamak için kullanın. Kuvars tüp kapalı sonu ve şırınga ucu arasındaki mesafe 1 cm ayarlamak.
3. Açık belgili tanımlık tenkıye sonuna kadar bir 1 m silikon kauçuk kanal (ile bir iç çapı 12 mm) bağlanmak ve sonra sırayla için akış ölçer ve gaz vanası bağlayın.

3. Jets edinimi

1. Devre Şekil 1' de gösterildiği gibi bağlayın. Güç kaynağının çıkış tel plazma jeti cihaza bağlayın ve yüksek gerilim sonda ucu gerilim algılamak için çıkış kabloyla bağlayın. Çıkış voltajı bilgileri kaydetmek için osiloskop yüksek gerilim sonda diğer ucunu bağlayın. Tüm devre kontrol ve güç kaynağı, osiloskop ve yüksek gerilim probu tüm cezalısın emin olun.
2. Gaz hattı kontrol edin. Tüp gaz plazma jeti aygıta bağlı olduğundan emin olun; o zaman, gaz vanası helyum (birim kesir, % 99.999) ve oksijen (birim kesir, % 99.999) açın ve gaz akışı 1 L:0.01 L/dk (o: O₂) ayarlayın.
   Not: ilk kez güç kaynağı açmadan önce birkaç dakika için gaz akışı sağlar.
3. Darbe genlik, frekans ve darbe genişliği 8 olarak ayarla kV, 8 kHz ve 1600 ns, anılan sıraya göre. Devre yeniden denetleyin ve ardından, bir plazma jet oluşturmak için Çıkış düğmesini açın.
   Uyarı: yüksek gerilim tel herhangi bir zamanda dokunmayın.

4. nöral kök hücre tedavisinde plazma

1. Şırınga meme ve hücre iyi deliğe 15 mm arasındaki mesafeyi ayarlayın.
   Not: 12-şey plaka yerleştirildiği platformu alttan mesafe ölçülür.
2. 12-şey plaka kuluçka makinesi dışarı alın ve orta predifferentiated hücrelerinin taze farklılaşma orta 800 µL için değiştirin.
3. Hücreleri üç gruba ayırın: bir tedavi edilmemiş kontrol grubu, 60 s o ve O₂ (% 1) gaz akışı tedavi grup ve 60 s plazma tedavi grup.
   Not: Hiçbir belirgin sıvı kaybı tedavi koşul altında vardır.
4. 12-şey plaka plazma jetlerin altında yer, her deliğin ortasına şırınga başlık sabit olduğundan emin olun ve farklı gruplara 4.3 adımda belirtilen ilgili tedavi vermek.
   Not: Tek tip tedavi koşulları sağlamak için deneysel bir işlem sırasında farklılaşma Orta oda sıcaklığında tedavi edilmezse denetimleri tutuldu. O ve O₂ (% 1) gaz akışı tedavi grubunda yalnızca bir o ile tedavi edildi ve O₂ (% 1) gaz akışı, plazma üretimi olmadan. Tüm tedaviler nüsha gerçekleştirilmelidir.

5. sinirsel kök hücre farklılaşması

1. Tedavi sonra özgün kültür kaldırın ve her şey için yeni farklılaşma orta 1 mL ekleyin.
2. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçka 6 için kuluçkaya ö değiştirmek orta her geçen gün.
3. Her gün bir ters faz kontrast ışık mikroskobu altında farklı grupların ayırt etme durumunu denetleyin. Rastgele en az 12 alanları seçin ve morfolojik değişiklikleri kaydetmek için fotoğraf çekmek.

6. ayirt boyama

1. Durulama
   1. Hücre inkübatör dışında örnekleri ve orta aspirasyon tarafından sökün. Durulama hücreleri 1 x 1 mL PBS ile.
      Not: farklılaşma sonra hücreleri kolayca ayrılır. Hücreleri dışına yıkama önlemek için kültür wells tarafındaki PBS eklemek gereklidir.
2. Fiksasyon
   1. Hücreleri 500 µL % 4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 20 dakika ile düzeltmek. Fiksasyon sonra yavaşça hücreleri 3 durulama x 1 mL kalan % 4'paraformaldehyde kaldırmak için PBS, 5 min her, ile.
      Not: Hücre fiksasyon için en uygun zaman noktası hücre tiplerine göre belirlenmelidir. Fiksasyonun sonra PBS 1 mL kültür wells taraftan ekleyin ve 5 min için tablo örnek bırakmaktır. Bir laboratuar shaker en az bir hücre kaybı sağlamak için kullanın.
3. Permeabilization
   1. Örnekleri % 0,2 ile permeabilize TritonX-100 oda sıcaklığında 10 dakika için PBS içinde. Permeabilization sonra üç kez, 5 min her için 1 mL PBS yavaşça hücrelerle durulayın.
      Not: Cep permeabilization için uygun zaman noktası hücre tiplerine göre belirlenmelidir. Permeabilization sonra 1 mL PBS kültür wells, yan eklemek tablo 5 min için örnek bırakın. Bir laboratuar shaker hücreleri en az kaybı sağlamak için kullanın.
4. Engelleme
   1. 1 mL % 10 keçi serum PBS içinde her örnek için eklenir ve örnek spesifik olmayan herhangi bir etkileşimi engellemek 1 h için masaya bırakılır.
      Not: bir laboratuvar shaker slayttan ayırma hücreleri önlemek için kullanmayın. Bir durulama Bu adım gerekli değildir.
5. Kuluçka birincil antikor ile
   1. Birincil antikor seyreltme tampon kullanarak birincil antikor sulandırmak.
      Not: en iyi sonuçlar için birincil antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir. Anti-testin (için farklılaşmamış kök hücre), seyreltme oranları anti-β-tübülin III (nöron için) anti-O4 (için oligodendrocyte), anti-NF200 (için olgun nöronlar), Anti-sohbet (için kolinerjik nöronlar), anti-LHX3 (için motor nöronlar), anti-GABA (için GABAergic nöronlar), anti-serotonin (için serotonerjik nöron) ve anti-TH (için dopaminerjik nöron) are 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 ve 1: 100, anılan sıraya göre.
   2. Seyreltilmiş birincil antikorların 300 µL farklı örnekleri için geçerlidir.
   3. Gecede 4 ° C'de hücre örnekleri kuluçkaya
      Not: Bu 4 ° C'de arka plan ve nonspesifik boyama azaltmak için birincil antikorlar kuluçkaya önerilir.
   4. Birincil antikorlar kaldır ve yavaşça hücreleri 3 durulayın x 1 mL PBS ile.
6. Kuluçka ikincil antikor ile
   1. Cy3-Birleşik veya Alexa Fluor 488 Birleşik ikincil antikorlar % 3 keçi serum içinde PBS kullanarak sulandırmak.
      Not: en iyi sonuçlar için ikincil antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir.
   2. Her birincil antikor algılamak için ilgili ikincil antikorların 300 µL uygulanır.
      Not: Sonraki adımlar floresans Şoklama önlemek için karanlıkta gerçekleştirilmesi gerekir.
   3. Hücre örneği içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
   4. İkincil antikorlar kaldırmak ve PBS 1 mL oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe hücrelerle durulayın.
7. Nükleer boyama
   1. 500 µL Höchst 33258 çalışma çözüm hücre örnek sokmak için geçerlidir.
   2. Hücre örnek çekirdeklerin etiketlemek için oda sıcaklığında 8 min için karanlıkta kuluçkaya.
   3. Nazikçe yıkayın hücreleri 3 x 1 mL PBS, 10 min her, ile korunan ışıktan.
      Not: hücreleri en az kaybı için en iyi çamaşır koşulu ampirik olarak belirlenmelidir.
8. Montaj
   1. Montaj orta bir damla microslide ortasına yerleştirin.
   2. Cımbız kullanarak coverslips dışında (örnekler ile) almak ve dikkatli bir şekilde örnek montaj orta üstüne getirin. Hava kabarcıkları kaçının.
   3. Emici kağıt ile her aşırı montaj ortam kaldırın.
9. Floresans mikroskobu gözlem
   1. Höchst 33258, Alexa Fluor 488 ve Cy3 için filtre ile donatılmış floresans mikroskobu altında örnekleri gözlemlemek. Her örnek için rasgele bir kamera ile en az 8-12 alanları ve kayıt görüntüleri seçin.

Sonuçlar

Hücre morfolojisi ters mikroskop altında her gün kap tedavi sonrasında görülmüştür. Şekil 2 , her iki hücre hatlarında sıradan ters faz kontrastlı ışık mikroskobu görüntüler hücre farklılaşma göstermektedir. Plazma tedavi grubu bir hızlandırılmış farklılaşma oranı ve denetim ve gaz akışı grubuna kıyasla yüksek farklılaşma oranı sergiler.

C17....

Tartışmalar

C17.2-NSCs olan bir tür ölümsüzleştirdi nöral kök hücre satırı yenidoğan fare serebellar taneli katman hücrelerden, Snyder ve diğerleri tarafından geliştirilen^10,11. C17.2-NSCs nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes ayırabilir ve nörolojik¹²' yaygın olarak kullanılmaktadır. Bizim önceki çalışmada, CAPs C17.2-NSCs farklılaşma nöronların içine geliştirmek. Bir kanıt prensibi çalışma da birincil fare NSCs ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A