신경 줄기 세포 분화는 원스텝 차가운 대기 플라즈마 치료에서 체 외에 의해

요약

이 프로토콜 신경 줄기 세포 및 분화 향상을 위한 면역 형광 검출에 차가운 대기 플라즈마 처리의 자세한 실험 단계를 제공 하는 것을 목표로.

초록

으로 실제 플라즈마 기술, 차가운 대기 플라즈마 (모자) 개발 오염, 암 치료, 상처 치유, 루트 운하 치료, 등에서 널리 조사 되어, 플라즈마 의학 이라는 새로운 연구 분야를 형성. 전기, 화학, 및 생물학적 반응 종의 혼합물 이기 때문에, 모자 나타났습니다 신경 줄기 세포 분화를 향상 시키기 위해 그들의 능력 둘 다 생체 외에서 vivo와 는 신경 질환 치료를 위한 유망한 방법 고 미래. 훨씬 더 흥미로운 뉴스 이며 그 모자를 사용 하 여 한 단계, 깨닫지 안전 감독, 신경 줄기 세포 (NSCs)의 조직 교통. 여기 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSC 차별화를 강화 하는 성가 모자 제트 장치를 사용 하 여 뿐 아니라 셀 운명으로 거꾸로 관찰 하 고 형광 현미경 검사 법의 자세한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 면역 형광 검사 기술 얼룩의 도움으로 우리 모두는 NSCs 치료 그룹 보다 가속된 차동 속도 보였다 발견 하 고는 NSCs의 ~ 75%는 주로 성숙 하 고 해, 모터 신경에 선택적으로 분화 신경입니다.

서문

조직 교통에 대 한 특정 계보에 NSCs의 감독된 분화 신경 및 neurotraumatic 질병¹에 대 한 가장 유망한 요법 중 하나 간주 됩니다. 예를 들어 catecholaminergic dopaminergic 신경 세포는 특히 파 킨 슨 병 (PD) 치료에 원하는 됩니다. 그러나, 교통에 대 한 원하는 세포를 준비 하는 전통적인 방법 화학 독성, 흉터 형성, 또는 다른 사람, 재생 의학²NSCs의 애플 리 케이 션을 크게 저해 하는 등 많은 단점이 있다. 따라서, 그것은 매우 NSC 차별화에 대 한 소설과 안전한 방법의 찾을 필요가 있다.

플라즈마 문제, 다음 고체, 액체, 가스의 제 4 상태 이며, 그것은 구성 하는 전체 우주에서 문제의 95% 이상. 플라즈마 전기 중립 중립 입자와 언바운드 긍정적/부정적 이며 일반적으로 실험실에서 고압 방전에 의해 생성 됩니다. 지난 2 년간에 의학에서 플라즈마의 응용 프로그램 차가운 대기압 플라즈마 기술 개발으로 세계적으로 큰 관심을 모으고 있다. 이 기술 덕분에 안정적인 저온 플라즈마 아크 형성 없이 분위기에 주위 공기에 생성 될 수 있습니다 및 종의 다양 한 반응, 반응 질소 종 (RNS), 반응성 산소 종 (선생님), 자외선 (UV)로 구성 되어 방사선, 전자, 이온, 및 전기 분야³. 모자는 마이크로-유기 체 비활성화, 암 치료, 상처 치유, 피부 질환, 세포 증식, 세포 감 별 법^4,5,,67의 치료에 대 한 독특한 장점이 있다. 이전 작품에서는, 우리가 보여주는 차가운 대기 플라즈마 제트 murine 신경 줄기 세포 C17.2 (C17.2-NSCs)에 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSCs의 분화를 향상 시킬 수 있습니다는 감독에 대 한 강력한 도구가 될 큰 잠재력을 전시 NSCs⁸분화 NSC 차별화의 모자 향상의 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다 아직, 비록 모자에 의해 생성 된 NO는 과정에서 핵심 요소가 될 것 입증 되었다. 이 작품에서는, 우리는 NSCs 생체 외에서셀 준비 및 전처리, 거꾸로 한 현미경으로 형태학 관찰의 치료는 대기압 헬륨/산소 플라즈마 제트를 사용 하 여 자세한 실험 프로토콜을 제공을 목표로 하 고 면역 형광 염색 법의 형광 현미경 관찰입니다.

프로토콜

1. 세포 문화 및 Predifferentiation

1. 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
   1. Coverslips 폴 리 D lysine 코팅을 준비 합니다. 12-잘 접시에 메 마른 coverslip (지름 20 mm)을 넣어. 다음 단계에 따라 더 나은 세포 접착에 있는 coverslips에 대 한 물 (재료의 테이블)에 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 커버 유리를 코트.
      참고: 최적의 조건 각 셀 라인 및 응용 프로그램에 대 한 결정 해야 합니다.
      1. Aseptically 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 물에 coverslip의 표면 코트. 부드럽게 coverslip 표면에 코팅 되도록 바위.
      2. 하룻밤 (~ 12 h) 37 ° C에서 배양 후 폴 리-D-리 솔루션을 제거 하 고 씻어 표면 3 살 균 물의 1 mL x.
      3. 그들을 뿌리기 전에 셀 적어도 30 분을 건조.
2. C17.2 (C17.2-NSC) 문화 murine 신경 줄기 세포 및 predifferentiation
   1. C17.2-NSCs Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5% 말 혈 청 (HS), 및 1% 페니실린/스 ~ 2-3 d 37 ° C, 5% CO₂ 보충에 25 c m² 플라스 크에서 품 어.
   2. 셀 85% 합류에 도달, 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS로 세포 세척 한 신선한 trypsin (0.25%)의 1 mL 플라스 크에 추가. 1 분;에 대 한 둬 그런 다음, 플라스 크 및 단일 세포 현 탁 액을 위해 여러 번 왔다 갔다 피 펫 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
   3. 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 밀도 계산. 2 × 10⁴ 셀/mL의 최종 셀 농도 주고 세포 현 탁 액의 필요한 볼륨을 계산 합니다.
   4. 씨 C17.2 NSCs 코팅된 coverslips에 ~ 잘 당 10⁴ 셀 x 2의 밀도와 12-잘 접시에. 현미경으로 세포 밀도 확인 합니다.
      참고: 더 나은 결과 위한 최적의 셀 밀도 면역 형광 실험 하기 전에 결정 되어야 합니다.
   5. 첨부 파일에 대 한 있도록 12 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
   6. 첨부 후 씻어 셀 2 x 1 mL의 PBS로 1 %N2 플라즈마 치료 전에 48 h에 대 한 보완과 DMEM/F12 이루어진 차별화 매체와 셀을 육성.
3. 기본 쥐 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
   1. 5 x 10⁵ 세포의 밀도에 uncoated T25 플라스 크에 쥐 NSC 성장 매체에서 주 쥐 NSC 정지 문화.
      참고: 기본 쥐 NSCs Xie 그 외 의 프로토콜을 따르고 고립 됐다 ⁹.
   2. 거꾸로 현미경 neurospheres의 형성을 확인 하십시오. neurospheres의 형태 전시 구형 하 고 투명 한 다세포 단지 다는 것을 확인 하십시오.
   3. neurospheres 직경 3 m m 이상에 도달, 전송 neurosphere 정지는 15 mL 메 마른 분리기 관 고는 neurospheres 중력에 의해 정착.
   4. 신중 하 게 매체의 최소한의 볼륨에는 neurospheres를 떠나 상쾌한을 제거 합니다.
   5. Neurospheres 1 린스는 neurospheres 중력에 의해 침전 PBS의 5 mL x. PBS의 최소한의 볼륨을 떠나 상쾌한을 제거 합니다.
   6. 차별 매체 12 ~ 15 밀리 리터 당 neurospheres에 셀 밀도 조정의 적합 한 볼륨을 추가 합니다. 기본 쥐 NSCs 차별화 매체 구성 DMEM/F12, 2 %B27, 및 1 %FBS.
   7. 씨 12-잘 접시에 각 코팅된 coverslip에 neurosphere 서 스 펜 션의 1 mL.
      참고: 격판덮개는 neurospheres은 고르게 분포 되도록 부드럽게 흔들어. 이 단계는 더 나은 면역 형광 검사 결과 대 한 중요 한.
   8. 인큐베이터에 접시를 놓고 플라즈마 치료 전에 24 h에 대 한 predifferentiate에 그것을 허용 합니다.

2입니다. 플라즈마 제트의 준비

1. 2 m m 내부 직경 및 외부 직경 4 m m.의 반 오픈 석 영 튜브 튜브 2 m m의 직경을 가진 높은 전압 와이어 삽입 선택 하십시오.
2. 5 mL 주사기로 높은 전압 와이어와 석 영 튜브를 삽입 하 고 주사기의 센터 마운트 홀더를 사용 하 여. 1 cm에서 석 영 튜브의 봉인된 끝과 주사기 끝 사이의 거리를 설정 합니다.
3. 주사기의 열린 끝을 (와 12 m m 내부 직경) 1 m 실리콘 고무 파이프를 연결 하 고, 다음, 순서 대로 유량 계 및 가스 밸브에 연결.

3입니다. 제트기의 수집

1. 그림 1과 같이 회로 연결 합니다. 플라즈마 제트 장치에 전원 공급 장치의 출력 와이어를 연결 하 고, 다음, 높은 전압 프로브 끝 전압을 출력 와이어 연결. 출력 전압의 정보를 기록 하는 오실로스코프에 고전압 프로브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 전체 회로 확인 하 고 전원 공급 장치, 오실로스코프, 그리고 높은 전압 프로브 모두 접지 되어 있는지 확인 하십시오.
2. 가스 라인을 확인 합니다. 가스 튜브; 플라즈마 제트 장치에 연결 되어 있는지 확인 다음, 헬륨 (볼륨 분수, 99.999%)와 산소 (볼륨 분수, 99.999%)의 가스 밸브를 열고 L:0.01 1 L/min (그: O₂)를 가스 흐름을 설정 합니다.
   참고: 처음으로 전원 공급 장치를 켜기 전에 몇 분 동안 가스 흐름을 보자.
3. 펄스 진폭, 주파수, 및 펄스 폭을 8로 설정 kV, 8, 및 1600 ns, 각각. 회로 다시 확인 하 고, 출력 버튼을 플라즈마 제트를 생성, 설정.
   주의: 언제 든 지 높은 전압 와이어를 만지지 마십시오.

4. 플라즈마 처리 신경 줄기 세포의

1. 주사기의 노즐 및 15 mm 셀 잘 구멍 사이의 거리를 설정 합니다.
   참고: 거리 12-잘 접시 배치 됩니다 플랫폼의 하단에서 측정 됩니다.
2. 인큐베이터에서 12-잘 접시를가지고 고 신선한 차별화 매체의 800 µ L predifferentiated 셀의 변경.
3. 3 개의 그룹으로 셀 분할: 치료 되지 않는 통제 그룹, 60 s 그 O₂ (1%) 가스 흐름 처리 그룹, 그리고 60 s 플라즈마 처리 그룹.
   참고:가 아무 명백한 액체 치료 조건 하 에서입니다.
4. 플라즈마 제트 아래 12-잘 접시, 주사기 노즐 각 구멍의 중심에 고정 되어 있는지 확인 하십시오 놓고 4.3 단계에서 언급 한 다른 그룹에 관련 된 치료를 제공 합니다.
   참고: 치료 컨트롤 실험 절차를 균일 한 치료 조건 동안 실 온에서 차별화 매체에 유지 했다. 그 O₂ (1%) 가스 흐름 치료 그룹은만 그 치료와 O₂ (1%) 가스 흐름, 플라즈마 생성 없이. 모든 치료는 3 중에서 수행 되어야 합니다.

5. 신경 줄기 세포 분화

1. 치료 후, 원래의 문화를 제거 하 고 각 우물에 새로운 차별화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
2. 6 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에서 세포를 품 어 d. 변경 매체 매일.
3. 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 아래 매일 다른 그룹의 분화 상태를 확인 하십시오. 임의로 적어도 12 필드를 선택 하 고 형태학 상 변화를 기록 하는 사진을 찍는.

6. 면역 형광 염색

1. 세 정
   1. 셀 인큐베이터에서 샘플을 받아 고 포부에 의해 매체를 제거 합니다. 1 셀 린스 1 mL의 PBS와 x.
      참고: 차별화, 후 셀은 쉽게 분리. 그것은 세포에서 세척 하지 않으려면 문화 우물의 측면에서 PBS를 추가 해야 합니다.
2. 고정
   1. 실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 셀을 수정 합니다. 고정, 후 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS 5 분 각, 잔여 4 %paraformaldehyde 제거.
      참고: 셀 고정을 위한 최적의 시간 포인트 셀 유형에 따라 결정 되어야 합니다. 고정, 후 문화 우물의 측면에서 PBS의 1 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 테이블에는 샘플을 두고. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.
3. Permeabilization
   1. 0.2% 샘플 permeabilize 실 온에서 10 분에 대 한 PBS에 TritonX-100. Permeabilization, 후 3 시간, 5 분 각 1 mL PBS와 부드럽게 셀 린스.
      참고: 셀 permeabilization에 대 한 최적의 시간 포인트 셀 형식에 따라 결정 되어야 합니다. Permeabilization, 후 5 분에 대 한 테이블에는 샘플 두고 문화 우물의 측면에서 1 mL PBS를 추가. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.
4. 차단
   1. 각 샘플에 PBS에 10% 염소 혈 청 1 mL을 추가 하 고 어떤 일반적인 상호 작용을 차단 하는 1 시간에 대 한 테이블에는 샘플을 두고.
      참고: 셀 슬라이드에서 분리 되지 않도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오. 린스는이 단계에서 필요 하지 않습니다.
5. 1 차적인 항 체를 가진 외피
   1. 1 차적인 항 체 희석 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석.
      참고: 최적의 결과 대 한 1 차적인 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다. (대 한 미 분화 줄기 세포), 안티 Nestin의 희석 비율 (신경)에 대 한 안티-β-Tubulin III, 안티-O4 (oligodendrocyte)에 대 한, 안티-NF200 (대 한 성숙한 뉴런), (대 한 해 신경), 반대로 채팅 안티-LHX3 (모터 신경)에 대 한 안티-GABA ( GABAergic 신경), (대 한 serotonergic 신경), 항 세로토닌 및 안티-일 (대 한 dopaminergic 신경)는 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200, 그리고 1: 100, 각각.
   2. 300 µ L 희석된 주 항 체의 다른 샘플에 적용 됩니다.
   3. 4 ° c.에 하룻밤 셀 샘플을 품 어
      참고: 배경 및 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 4 ° C에서 1 차 항 체를 품 어에 추천 된다.
   4. 1 차 항 체를 제거 하 고 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS.
6. 이차 항 체를 가진 외피
   1. Cy3 활용 또는 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 이차 항 체 3% 염소 혈 청을 사용 하 여 PBS에 희석.
      참고: 최적의 결과 대 한 이차 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다.
   2. 각 1 차적인 항 체를 검출 하기 위하여 관련 2 차 항 체의 300 µ L를 적용 합니다.
      참고: 모든 후속 단계 형광 냉각을 방지 하기 위해 어둠 속에서 수행 해야 합니다.
   3. 실 온에서 2 h에 대 한 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.
   4. 2 차 항 체를 제거 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 PBS의 1 mL와 함께 부드럽게 셀 린스.
7. 핵 얼룩
   1. Hoechst 33258 작업 솔루션을 셀 샘플을 담가의 500 µ L를 적용 합니다.
   2. 핵을 실 온에서 8 분 동안 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.
   3. 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS, 10 분 각, 빛 으로부터 보호.
      참고: 셀의 최소한의 손실, 최적의 세척 조건 결정 되어야 합니다 경험.
8. 장착
   1. microslide의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다.
   2. 핀셋을 사용 하 여 (샘플)와 coverslips에서 하 고 신중 하 게 장착 매체 위에 샘플 위치. 공기 방울을 피하십시오.
   3. 흡수 성 종이 초과 설치 매체를 제거 합니다.
9. 형광 현미경 관찰
   1. Hoechst 33258, 알 렉 사 Fluor 488, 및 Cy3 필터 장착 형광 현미경 아래 샘플을 관찰 합니다. 각 샘플에 대 한 무작위로 선택 적어도 8-12 필드와 레코드 이미지 카메라와 함께 합니다.

결과

셀 형태 모자 치료 후 매일 거꾸로 현미경 관찰 되었다. 그림 2 는 두 셀 라인에서 세포 분화의 일반 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 이미지를 보여준다. 플라즈마 처리 그룹 가속된 분화 속도 및 제어 및 가스 흐름 그룹에 비해 높은 차별화 비율을 전시 한다.

Immunofluorescent 결과 C17.2 NSCs 및 기?...

토론

C17.2-NSCs 일종 이다 신생아 마우스 소 뇌 세분화 된 계층 셀에서 불멸 하 게 신경 줄기 세포 선의^10,11스나이더 및 다른 사람에 의해 개발. C17.2-NSCs 신경, 이다, 그리고 oligodendrocytes로 분화 할 수 있다 하 고 신경 과학¹²에서 널리 이용 된다. 우리의 이전 연구에서 모자 뉴런으로 C17.2 NSCs의 차별화를 향상 시킬 수 있습니다. 증거의 원리 연구...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A